本發(fā)明涉及通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生領(lǐng)域，具體涉及一種始興石斛優(yōu)質(zhì)種苗無性克隆快速繁殖方法和所使用的培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

始興石斛，拉丁名Dendrobium shixingense，于2010年發(fā)現(xiàn)于廣東北部始興縣，現(xiàn)僅在廣東及其與江西交界的少數(shù)地區(qū)發(fā)現(xiàn)有分布，適生海拔約400-600米，具有重要的藥用、觀賞、科研、保護(hù)等價(jià)值。與目前市場價(jià)值良好的鐵皮石斛相比，始興石斛的葉色、莖色為紅棕色，更具觀賞性，花色紫紅色，色彩更加迷人，嚼之粘性更強(qiáng)、口感更清甜，加上其萌芽率高，抗逆性、抗病蟲性較強(qiáng)，其發(fā)展前景十分廣闊，適合栽培觀賞和科研保護(hù)以及作為藥用的石斛原材料。

現(xiàn)有的繁殖方式發(fā)現(xiàn)對(duì)始興石斛種子進(jìn)行無菌播種時(shí)，培養(yǎng)出來的后代有分離現(xiàn)象，各種形狀參差不齊。由于種源間的顯著差異，傳統(tǒng)的無菌播種有性繁殖體系很難解決種苗的一致性和穩(wěn)定性，難以保持母株的優(yōu)良性狀，針對(duì)此問題，現(xiàn)在無性繁殖已經(jīng)被業(yè)內(nèi)很多專家認(rèn)為是具有發(fā)展前景的技術(shù)。例如公告號(hào)為CN101855993B、名稱為“齒瓣石斛無性系種苗繁殖方法”的專利就公開了一種齒瓣石斛無性系種苗繁殖方法，其以齒瓣石斛優(yōu)質(zhì)單株為材料，以莖段作為外植體，經(jīng)消毒處理后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等過程不僅使種苗保持母株的優(yōu)良性狀，而且還提高了種苗繁殖系數(shù)。因此有必要探索適合于始興石斛的無性快速繁殖方法，即探索以優(yōu)良單株的嫩芽為外植體，利用離體組織，培養(yǎng)無性克隆的快速繁殖方法，以提高其繁殖倍數(shù)，繁殖出規(guī)格劃一、形狀穩(wěn)定一致的優(yōu)質(zhì)種苗，滿足新優(yōu)石斛藥材的發(fā)展需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是探索始興石斛的無性快速繁殖方法，以解決繁殖后代的分離現(xiàn)象、形狀參差不齊，不利于商品化生產(chǎn)的問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種始興石斛優(yōu)質(zhì)種苗無性克隆快速繁殖方法及其所使用的培養(yǎng)基，技術(shù)方案包括以下步驟：

一、預(yù)處理、誘導(dǎo)培養(yǎng)

選取始興石斛株系，用水沖洗干凈，剪去葉片，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5～10分鐘，無菌水沖洗4～5次，切取高1～2厘米帶節(jié)的莖段，接種到類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1，45天后，莖段在培養(yǎng)基上有腋芽產(chǎn)生，莖段基部切口膨大形成顆粒突起；

二、形成類原球莖

轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基M1上，再經(jīng)過50天培養(yǎng)，形成類原球莖，誘導(dǎo)類原球莖階段的培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照度1500～2000Lx，光照12小時(shí)/天；

三、類原球莖增殖

將獲得的類原球莖繁殖材料轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基M2中，在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)45天后，類原球莖增殖倍數(shù)可達(dá)到8倍以上；經(jīng)過3代類原球莖增殖培養(yǎng)可獲得足夠的繁殖材料進(jìn)行類原球莖分化培養(yǎng)，類原球莖增殖階段的培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照度1500～2000Lx，光照12小時(shí)/天；

四、分化培養(yǎng)

將獲得的類原球莖繁殖材料轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基M3中，45天后，類原球莖在培養(yǎng)基上分化形成高3～5厘米不定芽，類原球莖分化階段的培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照度2000～3000Lx，光照12小時(shí)/天；

五、生根壯苗

將高3～5厘米的不定芽，轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基M4，培養(yǎng)60天時(shí)，苗高可達(dá)到5～7厘米，根數(shù)3～5條，生根率為95％以上，生根壯苗階段的培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照度2000～3000Lx，光照12小時(shí)/天；

六、移栽

將生根培養(yǎng)50-70天的試管苗在強(qiáng)光照下煉苗7天后出瓶，移栽時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出生根苗，洗凈附著的培養(yǎng)基后，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5分鐘，種植基質(zhì)采用已經(jīng)發(fā)酵好的闊葉林樹皮和木屑的混合基質(zhì)，注意保持適宜濕度和溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，成活率可達(dá)95％以上，25-35天成活后的植株產(chǎn)生新的根系，移入大棚進(jìn)行正常水、肥、藥管理。

上述類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1的成分為：每升含花寶1號(hào)1～2g，蛋白胨0.5～2g，椰子汁50～100mL，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-芐基嘌呤5.0～8.0毫克，萘乙酸0.2～2mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

上述增殖培養(yǎng)基M2的成分為：每升含花寶1號(hào)1～2g，蛋白胨0.5～2g，土豆泥40～80g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-芐基嘌呤2.0～5.0毫克，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

上述分化培養(yǎng)基M3的成分為：每升含花寶1號(hào)1～2g，蛋白胨0.5～2g，土豆泥40～80g，活性碳50～100mg，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-芐基嘌呤3.0～6.0毫克，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

上述生根壯苗培養(yǎng)基M4的成分為：每升含花寶1號(hào)1～2g，蛋白胨0.5～2g，土豆泥40～80g，活性碳500～1000mg，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

本發(fā)明的有益效果在于：

1，本發(fā)明通過選取始興石斛優(yōu)良單株，然后利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行優(yōu)質(zhì)種苗的快速大量繁殖，有利于實(shí)現(xiàn)始興石斛種苗的規(guī)?；?、商品化生產(chǎn)。

2，本發(fā)明只需有簡單的植物組織培養(yǎng)設(shè)備即可進(jìn)行，利用植物組織細(xì)胞的全能性和植物組織培養(yǎng)等技術(shù)進(jìn)行珍稀植物種苗的規(guī)模化生產(chǎn)，可以成功地進(jìn)行始興石斛無性克隆和快速大量繁殖，具有低成本，高效率的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的流程示意圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步的說明。

如圖1所示，本發(fā)明提出的一種始興石斛優(yōu)質(zhì)種苗無性克隆快速繁殖方法，主要步驟包括預(yù)處理、誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成類原球莖，類原球莖增殖，分化培養(yǎng)，生根壯苗和移栽。

以下通過實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明的上述步驟內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

1.取材：在生長季節(jié)在華南植物園選取始興石斛種質(zhì)圃生長旺盛的優(yōu)良單株的當(dāng)年生嫩芽為外植體。

2.選取始興石斛株系，用水沖洗干凈，剪去葉片，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5分鐘，無菌水沖洗4～5次，切取高1～2厘米帶節(jié)的莖段，接種到類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1，45天后，莖段在培養(yǎng)基上有腋芽產(chǎn)生，莖段基部切口膨大形成顆粒突起；轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基M1上，再經(jīng)過50天培養(yǎng)，形成類原球莖，誘導(dǎo)類原球莖階段的培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照度1500Lx，光照12小時(shí)/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基為M2，在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)45天后，類原球莖增殖倍數(shù)可達(dá)到8倍以上；經(jīng)過3代類原球莖增殖培養(yǎng)可獲得足夠的繁殖材料進(jìn)行類原球莖分化培養(yǎng)，類原球莖增殖階段的培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照度2000Lx，光照12小時(shí)/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基為M3，45天后，類原球莖在培養(yǎng)基上分化形成高3～5厘米不定芽，類原球莖分化階段的培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照度2000Lx，光照12小時(shí)/天；將高3～5厘米的不定芽，轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基M4，培養(yǎng)60天時(shí)，苗高可達(dá)到5～7厘米，根數(shù)3～5條，生根率為95％以上，生根壯苗階段的培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照度3000Lx，光照12小時(shí)/天；將生根培養(yǎng)50-70天的試管苗在強(qiáng)光照下煉苗7天后出瓶，移栽時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出生根苗，洗凈附著的培養(yǎng)基后，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，種植基質(zhì)采用已經(jīng)發(fā)酵好的闊葉林樹皮和木屑的混合基質(zhì)，注意保持適宜濕度和溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，成活率可達(dá)95％以上，25-35天成活后的植株產(chǎn)生新的根系，移入大棚進(jìn)行正常水、肥、藥管理。

類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1的成分為：每升含花寶1號(hào)1g，蛋白胨2g，椰子汁50mL，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4mg，煙酸0.8mg，6-芐基嘌呤5.0毫克，萘乙酸2mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.4。

增殖培養(yǎng)基為M2的成分為：每升含花寶1號(hào)1g，蛋白胨2g，土豆泥40g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4mg，煙酸0.8mg，6-芐基嘌呤2.0毫克，萘乙酸0.5mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.4。

分化培養(yǎng)基為M3的成分為：每升含花寶1號(hào)1g，蛋白胨2g，土豆泥40g，活性碳100mg，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素0.05mg，鹽酸吡哆醇0.8mg，煙酸0.4mg，6-芐基嘌呤6.0毫克，萘乙酸0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。

生根壯苗培養(yǎng)基M4的成分為：每升含花寶1號(hào)1g，蛋白胨2g，土豆泥40g，活性碳1000mg，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素0.05mg，鹽酸吡哆醇0.8mg，煙酸0.4mg，萘乙酸0.5mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.4。

實(shí)施例2

1.取材：在生長季節(jié)在華南植物園選取始興石斛種質(zhì)圃生長旺盛的優(yōu)良單株的當(dāng)年生嫩芽為外植體。

2.選取始興石斛株系，用水沖洗干凈，剪去葉片，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒10分鐘，無菌水沖洗4～5次，切取高1～2厘米帶節(jié)的莖段，接種到類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1，45天后，莖段在培養(yǎng)基上有腋芽產(chǎn)生，莖段基部切口膨大形成顆粒突起；轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基M1上，再經(jīng)過50天培養(yǎng)，形成類原球莖，誘導(dǎo)類原球莖階段的培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照度2000Lx，光照12小時(shí)/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基為M2，在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)45天后，類原球莖增殖倍數(shù)可達(dá)到8倍以上；經(jīng)過3代類原球莖增殖培養(yǎng)可獲得足夠的繁殖材料進(jìn)行類原球莖分化培養(yǎng)，類原球莖增殖階段的培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照度1500Lx，光照12小時(shí)/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基為M3，45天后，類原球莖在培養(yǎng)基上分化形成高3～5厘米不定芽，類原球莖分化階段的培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照度3000Lx，光照12小時(shí)/天；將高3～5厘米的不定芽，轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基M4，培養(yǎng)60天時(shí)，苗高可達(dá)到5～7厘米，根數(shù)3～5條，生根率為95％以上，生根壯苗階段的培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照度2000Lx，光照12小時(shí)/天；將生根培養(yǎng)50-70天的試管苗在強(qiáng)光照下煉苗7天后出瓶，移栽時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出生根苗，洗凈附著的培養(yǎng)基后，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，種植基質(zhì)采用已經(jīng)發(fā)酵好的闊葉林樹皮和木屑的混合基質(zhì)，注意保持適宜濕度和溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，成活率可達(dá)95％以上，25-35天成活后的植株產(chǎn)生新的根系，移入大棚進(jìn)行正常水、肥、藥管理。

類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1的成分為：每升含花寶1號(hào)2g，蛋白胨0.5g，椰子汁100mL，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素0.05mg，鹽酸吡哆醇0.8mg，煙酸0.4mg，6-芐基嘌呤8.0毫克，萘乙酸0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。

增殖培養(yǎng)基為M2的成分為：每升含花寶1號(hào)2g，蛋白胨0.5g，土豆泥80g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素0.05mg，鹽酸吡哆醇0.8mg，煙酸0.4mg，6-芐基嘌呤5.0毫克，萘乙酸0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。

分化培養(yǎng)基為M3的成分為：每升含花寶1號(hào)2g，蛋白胨0.5g，土豆泥80g，活性碳50mg，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4mg，煙酸0.8mg，6-芐基嘌呤3.0毫克，萘乙酸0.5mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.4。

生根壯苗培養(yǎng)基M4的成分為：每升含花寶1號(hào)2g，蛋白胨0.5g，土豆泥80g，活性碳500mg，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4mg，煙酸0.8mg，萘乙酸0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。

實(shí)施例3

1.取材：在生長季節(jié)在華南植物園選取始興石斛種質(zhì)圃生長旺盛的優(yōu)良單株的當(dāng)年生嫩芽為外植體。

2.選取始興石斛株系，用水沖洗干凈，剪去葉片，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒7.5分鐘，無菌水沖洗4～5次，切取高1～2厘米帶節(jié)的莖段，接種到類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1，45天后，莖段在培養(yǎng)基上有腋芽產(chǎn)生，莖段基部切口膨大形成顆粒突起；轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基M1上，再經(jīng)過50天培養(yǎng)，形成類原球莖，誘導(dǎo)類原球莖階段的培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照度1800Lx，光照12小時(shí)/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基為M2，在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)45天后，類原球莖增殖倍數(shù)可達(dá)到8倍以上；經(jīng)過3代類原球莖增殖培養(yǎng)可獲得足夠的繁殖材料進(jìn)行類原球莖分化培養(yǎng)，類原球莖增殖階段的培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照度1800Lx，光照12小時(shí)/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基為M3，45天后，類原球莖在培養(yǎng)基上分化形成高3～5厘米不定芽，類原球莖分化階段的培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照度2500Lx，光照12小時(shí)/天；將高3～5厘米的不定芽，轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基M4，培養(yǎng)60天時(shí)，苗高可達(dá)到5～7厘米，根數(shù)3～5條，生根率為95％以上，生根壯苗階段的培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照度2500Lx，光照12小時(shí)/天；將生根培養(yǎng)50-70天的試管苗在強(qiáng)光照下煉苗7天后出瓶，移栽時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出生根苗，洗凈附著的培養(yǎng)基后，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，種植基質(zhì)采用已經(jīng)發(fā)酵好的闊葉林樹皮和木屑的混合基質(zhì)，注意保持適宜濕度和溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，成活率可達(dá)95％以上，25-35天成活后的植株產(chǎn)生新的根系，移入大棚進(jìn)行正常水、肥、藥管理。

類原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1的成分為：每升含花寶1號(hào)1.5g，蛋白胨1g，椰子汁75mL，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.6mg，煙酸0.6mg，6-芐基嘌呤7毫克，萘乙酸1mg，蔗糖25g，瓊脂6.5g，pH 5.5。

增殖培養(yǎng)基為M2的成分為：每升含花寶1號(hào)1.5g，蛋白胨1g，土豆泥60g，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.6mg，煙酸0.6mg，6-芐基嘌呤4毫克，萘乙酸0.4mg，蔗糖25g，瓊脂6.5g，pH 5.5。

分化培養(yǎng)基為M3的成分為：每升含花寶1號(hào)1.5g，蛋白胨1g，土豆泥60g，活性碳75mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.6mg，煙酸0.6mg，6-芐基嘌呤5毫克，萘乙酸0.4mg，蔗糖25g，瓊脂6.5g，pH 5.5。

生根壯苗培養(yǎng)基M4的成分為：每升含花寶1號(hào)1.5g，蛋白胨1g，土豆泥60g，活性碳750mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.6mg，煙酸0.6mg，萘乙酸0.4mg，蔗糖25g，瓊脂6.5g，pH 5.5。

需要說明的是，本發(fā)明所提供的上述實(shí)施例僅具有示意性，不具有限定本發(fā)明的具體實(shí)施的范圍的作用。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)包括那些對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說顯而易見的變換或替代方案。