本發(fā)明屬于通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生技術(shù)，具體涉及一種鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗自然光培養(yǎng)一次成苗快速繁殖方法，以及所采用的一次成苗培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛是蘭科石斛屬附生植物，自古以來就是公認(rèn)的名貴中草藥。野生鐵皮石斛生長發(fā)育所需的環(huán)境條件極為苛刻，生長緩慢，繁殖率極低，而人為掠奪性采挖已導(dǎo)至野生鐵皮石斛資源近于枯竭。目前的繁殖方法主要分兩類，一類是組織快繁。組培苗栽培前應(yīng)先進(jìn)行14～21天的煉苗，具體措施是將組培苗移至煉苗房，使其在開放變化的環(huán)境中逐漸適應(yīng)自然環(huán)境，待組培苗葉色濃綠時(shí)即可出瓶種植。出瓶前先將瓶蓋打開，讓瓶苗在室外空氣中放置2～3天，讓其適應(yīng)自然溫濕度。然后進(jìn)行洗苗，洗苗時(shí)將帶有培養(yǎng)基的幼苗輕輕取出，置于盆中清洗，污染苗和裸根苗或少根苗應(yīng)分開放置。組培苗先用自來水清洗，主要是應(yīng)洗掉瓊脂，以免瓊脂發(fā)霉引起爛根，而后再用清水漂洗一下。洗苗時(shí)最好根據(jù)苗的大小和優(yōu)劣同步進(jìn)行分級，以便栽培、管理，提高組培苗的成活率并使其生長整齊。另一類是分株扦插，主要原理是分株時(shí)選擇1年生或2年生、色澤嫩綠、健壯、萌發(fā)多、根系發(fā)達(dá)及無病蟲害的植株作種株，剪去枯枝、斷枝、老枝及過長的須根，將株叢切開，分成小叢，每叢帶有葉的莖株5～7根，即可種植。

組培繁育鐵皮石斛種苗的技術(shù)雖然已經(jīng)獲得成功，但鐵皮石斛種苗普遍存在培養(yǎng)周期長、污染率高、操作復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高的等問題，從而制約著鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。如公開號為CN101564008A、名稱為“一種鐵皮石斛無菌苗的無激素培養(yǎng)及快速繁殖方法”的國內(nèi)發(fā)明專利公開了一種鐵皮石斛無菌苗的無激素培養(yǎng)及快速繁殖方法，內(nèi)容包括鐵皮石斛種子的無菌萌發(fā)，原球莖及幼苗的形成與保存，無菌苗的生根、增殖和壯苗培養(yǎng)，無菌苗的練苗和移栽等過程。但該技術(shù)存在的缺點(diǎn)是原球莖及幼苗的誘導(dǎo)過程涉及紅光、綠光、無光、黃光和藍(lán)光的使用，因此過程非常復(fù)雜，而且誘導(dǎo)的過程很難控制，不利于于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是鐵皮石斛種苗普遍存在的培養(yǎng)周期長、污染率高、操作復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高的問題等問題，本發(fā)明通過利用高萌發(fā)率的種子、營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基、全自然光培養(yǎng)室實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛種苗一次成苗大規(guī)模生產(chǎn)，具有低成本，高效率的特點(diǎn)，是種苗的規(guī)?；a(chǎn)的高新生物技術(shù)，可促進(jìn)鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

為解決上述問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是一種鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗自然光培養(yǎng)一次成苗快速繁殖方法，包含以下步驟：

(1)準(zhǔn)備鐵皮石斛材料；

(2)建造全自然光培養(yǎng)室

使用透光材料，并配備遮陽系統(tǒng)、降溫設(shè)備和培養(yǎng)架，通過遮陽系統(tǒng)確保培養(yǎng)室內(nèi)頂層培養(yǎng)架的光照強(qiáng)度為3000～5000Lux，光照強(qiáng)度隨著培養(yǎng)架的層數(shù)下移而降低，底層培養(yǎng)架的光照強(qiáng)度為100～1000Lux，降溫設(shè)備可將玻璃培養(yǎng)室的溫度控制在20～30℃，培養(yǎng)架長度可根據(jù)培養(yǎng)室的大小而定；

(3)制作種子懸浮液

于鐵皮石斛種質(zhì)圃中，選取生長健壯、萌芽率高、抗逆性、抗病蟲害強(qiáng)的健康株系，于開花季節(jié)進(jìn)行人工授粉并套袋，選取一定范圍果齡的蒴果為外植體，進(jìn)行消毒、清洗和除水，接著用無菌手術(shù)刀切開蒴果，將蒴果內(nèi)的種子全部洗脫至一裝有無菌水的瓶中，每個(gè)蒴果的種子對應(yīng)洗脫至一個(gè)瓶，制成種子懸浮液，對每個(gè)蒴果種子懸浮液進(jìn)行種子密度的檢測，根據(jù)每瓶懸浮液種子濃度用無菌水進(jìn)一步稀釋成種子濃度為10-15粒/毫升的接種用的種子懸浮液；

(4)無菌播種

無菌條件下用移液槍吸取接種用的種子懸浮液2毫升至裝有150毫升的一次成苗固體培養(yǎng)基的蘭花培養(yǎng)瓶中，每瓶鐵皮石斛的種子數(shù)量20-30粒；

(5)一次成苗培養(yǎng)

原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將種子懸浮液均勻分布培養(yǎng)基表面上，將此培養(yǎng)瓶放置全自然光培養(yǎng)室中的培養(yǎng)架上，保持其光照強(qiáng)度在100～1000Lux，保持培養(yǎng)室溫度在(26±2)℃，此條件下培養(yǎng)60～90天，種子萌發(fā)形成原球莖，原球莖長出根和葉片；

小苗培養(yǎng)：將小苗移動至培養(yǎng)架的合適層，加強(qiáng)其自然光照培養(yǎng)，促進(jìn)小苗生長，此時(shí)期培養(yǎng)時(shí)間為90天，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃，小苗長成大苗，苗高3～5cm，3～5片～葉片，3～5條根須，根長1～3厘米；大苗基部萌發(fā)出1-2個(gè)新苗，形成叢生苗；

大苗培養(yǎng)：將大苗移動至培養(yǎng)架的頂層，在高自然光光強(qiáng)下進(jìn)行培養(yǎng)，既可以促進(jìn)大苗的生長，又可以達(dá)到煉苗的效果，此時(shí)期培養(yǎng)60天，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃，此時(shí)鐵皮石斛苗每叢2－5苗，苗高5～8cm，有4-6節(jié)，4片以上葉片，3條以上根，莖粗2.0mm以上，達(dá)到出苗的標(biāo)準(zhǔn)；

(6)試管苗的移栽

移栽時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出生根苗，洗凈附著的培養(yǎng)基后，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，然后將生根苗晾干至根變白，種植基質(zhì)采用已經(jīng)消毒處理的樹皮，注意保持適宜濕度和溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，30天左右成活后的植株能產(chǎn)生新的根系，此時(shí)可移入大棚進(jìn)行正常水、肥、藥管理。

進(jìn)一步，步驟(2)中，假設(shè)培養(yǎng)架為四層結(jié)構(gòu)，則頂層往下的第二、三層培養(yǎng)架光照強(qiáng)度為1000～3000Lux。

作為優(yōu)選，步驟(3)中所述一定范圍果齡為120天。

進(jìn)一步，步驟(3)中所述消毒、清洗和除水具體過程為：在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒15～20分鐘，無菌水沖洗4～5次，于超凈工作臺上無菌條件下用無菌濾紙吸干蒴果表面的水分。

進(jìn)一步，上述步驟(3)中所述種子密度的檢測是指對每個(gè)蒴果種子懸浮液進(jìn)行種子密度的檢測，具體過程為在搖勻情況下用無菌移液槍吸取20微升于生物顯微鏡下計(jì)算其種子數(shù)量，每瓶種子懸浮液重復(fù)取10次計(jì)算其平均每毫升種子數(shù)。

另外，本發(fā)明還提供一種上述鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗自然光培養(yǎng)一次成苗快速繁殖方法中使用的一次成苗培養(yǎng)基，其包含以下成分：每升含花寶1號1～2g，花寶2號1～2g，蛋白胨0.5～2g，土豆泥40～80g，香蕉泥50～100g，蘋果泥10～20g，活性碳500～1000mg，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-芐基嘌呤0.05～0.1毫克，萘乙酸(NAA)0.2～2mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

1，可以一次成苗，不需轉(zhuǎn)接人工，加上采用全自然光培養(yǎng)室，根據(jù)不同生長階段對光的需求不同而移動培養(yǎng)的位置，生產(chǎn)出來的種苗健壯易成活，移栽前不需要經(jīng)過專門的煉苗處理，可直接出瓶移栽，顯著降低了生產(chǎn)成本。

2，利用高萌發(fā)率的種子、營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基、全自然光培養(yǎng)室進(jìn)行鐵皮石斛種苗一次成苗大規(guī)模生產(chǎn)，試管苗無病蟲生長健壯，種苗具有品質(zhì)好、抗性強(qiáng)、生長迅速、便于生產(chǎn)管理和降低生產(chǎn)成本等優(yōu)勢，可以實(shí)現(xiàn)定時(shí)、定質(zhì)、定量提供規(guī)格劃一、整齊一致的優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛試管苗以滿足市場需求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的流程圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

本發(fā)明的流程圖如圖1所示，主要由6個(gè)步驟組成。依次為準(zhǔn)備鐵皮石斛材料，建造全自然光培養(yǎng)室，制作種子懸浮液，無菌播種，一次成苗培養(yǎng)和試管苗的移栽。其中一次成苗培養(yǎng)又進(jìn)一步分為原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)，小苗培養(yǎng)和大苗培養(yǎng)三個(gè)階段。

為使得本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明，現(xiàn)提供一個(gè)具體的實(shí)施例，如下：

1.準(zhǔn)備鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)材料。

2.全自然光培養(yǎng)室建造：使用鋼化玻璃建成透光的培養(yǎng)室，配備遮陽系統(tǒng)、降溫設(shè)備、培養(yǎng)架。遮陽系統(tǒng)包括內(nèi)外遮陽網(wǎng)，通過調(diào)控內(nèi)外遮陽網(wǎng)使培養(yǎng)室內(nèi)頂層培養(yǎng)架的光照強(qiáng)度為3000～5000Lux，頂層往下的第二、三層培養(yǎng)架光照強(qiáng)度為1000～3000Lux，底層即頂層下第四層光照強(qiáng)度100～1000Lux。降溫設(shè)備采用冷暖兩用空調(diào)，可將玻璃培養(yǎng)室的溫度控制在20～30℃。培養(yǎng)架寬為60厘米，高為200厘米，離地面10厘米為第四層，層距60厘米，共四層，培養(yǎng)架長度可根據(jù)培養(yǎng)室的大小而定。

3.種子懸浮液的制作：于鐵皮石斛種質(zhì)圃中，選取生長健壯、萌芽率高、抗逆性、抗病蟲害強(qiáng)的健康株系，于開花季節(jié)進(jìn)行人工授粉并套袋，選取果齡為120天的蒴果為外植體，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒15～20分鐘，無菌水沖洗4～5次，于超凈工作臺上無菌條件下用無菌濾紙吸干蒴果表面的水分。接著用無菌手術(shù)刀切開蒴果，將蒴果內(nèi)的種子全部洗脫至一裝有200毫升無菌水的三角瓶中，每個(gè)蒴果的種子對應(yīng)洗脫至一瓶裝有200毫升無菌水的三角瓶，制成種子懸浮液。對每個(gè)蒴果種子懸浮液進(jìn)行種子密度的檢測，在搖勻情況下用無菌移液槍吸取20微升于生物顯微鏡下計(jì)算其種子數(shù)量，每瓶種子懸浮液重復(fù)取10次計(jì)算其平均每毫升種子數(shù)。根據(jù)每瓶懸浮液種子濃度用無菌水進(jìn)一步稀釋成種子濃度為10-15粒/毫升的接種用的種子懸浮液。

4.無菌播種：無菌條件下用移液槍吸取接種用的種子懸浮液2毫升至裝有150毫升的一次成苗固體培養(yǎng)基的蘭花培養(yǎng)瓶中，每瓶鐵皮石斛的種子數(shù)量20-30粒。一次成苗培養(yǎng)基：每升含花寶1號1.5g，花寶2號1.5g，蛋白胨2g，土豆泥40g，香蕉泥80g，蘋果泥10g，活性碳500～1000mg，肌醇100mg，甘氨酸2.0mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.5mg，煙酸0.5mg，6-芐基嘌呤0.05毫克，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖20g，瓊脂6g，pH 5.4-5.6。

5.一次成苗培養(yǎng)：

原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將種子懸浮液均勻分布培養(yǎng)基表面上，將此培養(yǎng)瓶放置全自然光培養(yǎng)室中的第四層培養(yǎng)架上，保持其光照強(qiáng)度在100～1000Lux，保持培養(yǎng)室溫度在(25±2)℃。此條件下培養(yǎng)60～90天，種子萌發(fā)形成原球莖，原球莖長出根和葉片，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃。

小苗培養(yǎng)：將小苗移動至培養(yǎng)架的第二或第三層，加強(qiáng)其自然光照培養(yǎng)，促進(jìn)小苗生長，此時(shí)期培養(yǎng)時(shí)間為90天，小苗長成大苗，苗高3～5cm，3～5片～葉片，3～5條根須，根長1～3厘米；大苗基部萌發(fā)出1-2個(gè)新苗，形成叢生苗，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃。

大苗培養(yǎng)：將大苗移動至培養(yǎng)架的第一層，在高自然光光強(qiáng)下進(jìn)行培養(yǎng)，既可以促進(jìn)大苗的生長，又可以達(dá)到煉苗的效果。此時(shí)期培養(yǎng)60天，此時(shí)鐵皮石斛苗每叢2－5苗，苗高5～8cm，有4-6節(jié)，4片以上葉片，3條以上根，莖粗2.0mm以上，達(dá)到出苗的標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃。

6.試管苗的移栽：移栽時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出生根苗，洗凈附著的培養(yǎng)基后，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，然后將生根苗晾干至根變白，種植基質(zhì)采用已經(jīng)消毒處理的樹皮，注意保持適宜濕度和溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，成活率可達(dá)98％以上。30天左右成活后的植株能產(chǎn)生新的根系，此時(shí)可移入大棚進(jìn)行正常水、肥、藥管理。

以上所述僅為本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。