本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種創(chuàng)制能穩(wěn)定遺傳的攜帶蘿卜染色體的白菜種質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
白菜和蘿卜是我國的兩種重要蔬菜，分別屬于十字花科的蕓薹屬和蘿卜屬。在蔬菜作物雜交育種中，利用種間、屬間、科間的遠緣雜交在提高作物的抗病性和抗逆性、提高作物品質(zhì)、創(chuàng)造新類型或新種質(zhì)等方面發(fā)揮了重要的作用，已成為解決植物基因資源匱乏的重要手段，它可以解決近緣雜交不能解決的問題。因此，越來越被育種家們重視和利用，在植物遺傳育種中已有廣泛的應(yīng)用，如在小麥、棉花、油菜、黃瓜等多種作物上通過種間或?qū)匍g雜交進行品種改良，獲得了豐富的遺傳變異類型。
但是，有性遠緣雜交經(jīng)常會遇到雜交不親和、雜種不育、雜種后代遺傳變異復(fù)雜等問題。盡管白菜與蘿卜同屬十字花科，但白菜屬于蕓薹屬蕓薹種(基因組A，n＝10)，而蘿卜屬于蘿卜屬蘿卜種(基因組R，n＝9)。白菜和蘿卜直接雜交后代沒法繼續(xù)回交的研究(李旭峰等，1995)。事實證明，蘿卜與蕓薹屬植物雜交獲得雜種非常困難，而且雜種高度不育，難以繼續(xù)回交。為了克服兩者之間雜交的不親和問題，許多學(xué)者嘗試用不同技術(shù)和方法，如：植株嫁接后雜交、混合花粉授粉、化學(xué)藥物處理等，但這些技術(shù)和方法對蕓薹屬植物與蘿卜的遠緣雜交幾乎沒有效果。后來組織培養(yǎng)技術(shù)和體細胞融合技術(shù)推動了這一領(lǐng)域的發(fā)展，如通過原生質(zhì)體融合技術(shù)將蘿卜的細胞質(zhì)雄性不育基因轉(zhuǎn)入蕓薹屬蔬菜，獲得白菜細胞質(zhì)雄性不育材料。與有性雜交相比，體細胞融合技術(shù)雖然可以在一定程度上克服遠緣雜交不親和性，但存在結(jié)果不確定性、成本偏高等缺陷，難以得到廣泛的應(yīng)用。
因此，尋求一種能克服遠緣雜交障礙，使白菜與蘿卜可以通過有性雜交獲得有利用價值的雜種后代的方法，對白菜育種具有重要的應(yīng)用價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是提供一種創(chuàng)制攜帶蘿卜染色體的白菜種質(zhì)的方法。
本發(fā)明提供的方法，為以附加蘿卜d染色體的甘藍型油菜作為蘿卜染色體的載體，將所述蘿卜染色體轉(zhuǎn)移到白菜或具備白菜生物學(xué)特性的植物，得到攜帶蘿卜染色體的白菜或具備白菜生物學(xué)特性的植物。
上述方法包括如下步驟：
1)將所述附加蘿卜d染色體甘藍型油菜作為母本，所述白菜或具備白菜生物學(xué)特性的植物作為父本，進行雜交，得到F1代植株；選取含有蘿卜d染色體，且根尖細胞的染色體數(shù)為30的所有F1代單株，記作F1-A；
2)將所述F1-A單株作為母本，所述白菜作為父本，回交，得到BC1群體；選取含有蘿卜d染色體，且根尖細胞的染色體數(shù)為21，且形態(tài)與所述白菜相同或接近的所有BC1單株，命名為BC1-A；
3)將所述BC1-A單株自交，得到BC1F2群體，選取含有蘿卜d染色體，且根尖細胞的染色體數(shù)為22，且形態(tài)與所述白菜相同或接近的所有BC1F2單株，為能穩(wěn)定遺傳的攜帶蘿卜染色體的白菜或能穩(wěn)定遺傳的攜帶蘿卜染色體具備白菜的生物學(xué)特性植物。
上述根尖細胞的染色體數(shù)為單個根尖細胞中的染色體數(shù)。
上述方法中，所述選取含有蘿卜d染色體的方法為用SSR標(biāo)記RSSH173-219的引物對對植株進行分子鑒定，選取含有該標(biāo)記的植株；
所述SSR標(biāo)記RSSH173-219的引物對由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成。
上述方法中，所述選取符合所需根尖細胞的染色體數(shù)的植株的方法為顯微鏡鏡檢。
上述方法中，所述附加蘿卜d染色體的甘藍型油為甘藍型油菜-蘿卜d染色體附加系05-1CGMCC No.3596。
甘藍型油菜-蘿卜d染色體附加系05-1CGMCC No.3596在白菜育種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
含蘿卜d染色體的白菜在形態(tài)上不是唯一的，只要具備白菜的生物學(xué)特性即可。
甘藍型油菜-蘿卜d染色體附加系05-1于2010年1月27日，保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為：CGMCC No.3596，分類命名：油菜brassica napus；該附加系記載在公開號為102138515A的專利中，該專利的申請?zhí)枮?01010104342X，授權(quán)號為ZL201010104342X，申請日為2010.2.1。
本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明可以克服蘿卜與白菜之間的遠緣雜交障礙，通過有性回交將蘿卜染色體導(dǎo)入白菜且在白菜基因組背景中能穩(wěn)定遺傳的方法。
與傳統(tǒng)的白菜和蘿卜直接遠緣雜交方法相比，本發(fā)明以甘藍型油菜-蘿卜d染色體附加系(基因組AACC+dd)作為白菜(基因組AA)與蘿卜(基因組RR)的中間橋梁，用附加蘿卜d染色體的甘藍型油菜與白菜進行雜交，兩者完全親和，解決了白菜與蘿卜之間不親和的問題；并且只有1對蘿卜染色體與白菜基因組整合，可以避免用整個蘿卜基因組雜交引起的更多遺傳累贅，因此這種方法不但可以克服白菜與蘿卜之間的遠緣雜交障礙，避免了白菜與蘿卜之間的直接雜交，提高目標(biāo)性狀的轉(zhuǎn)移和選擇效率,這種蕓薹屬內(nèi)的雜交比蕓薹屬與蘿卜屬之間的屬間雜交更容易成功；為白菜與蘿卜的遠緣雜交提供了一條新的思路與方法，為白菜遺傳育種創(chuàng)造更多的遺傳變異。基因組成是純合的就可以穩(wěn)定遺傳
下面結(jié)合附圖及最佳實施方式對本發(fā)明做進一步說明，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容有整體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開了本發(fā)明可以實施的保護范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容進行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于對本發(fā)明的侵犯。
附圖說明
圖1為SSR分子鑒定圖。泳道從右到左分別是Marker，1個白菜親本，1個附加系親本，1個F1，1個BC1，其余為BC1F2。
具體實施方式
下述實施例中所用的父本白菜可以從商業(yè)途徑獲得，獲得的含蘿卜d染色體的白菜在形態(tài)上不是唯一的，只要具備白菜的生物學(xué)特性即可。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實施例中甘藍型油菜-蘿卜d染色體附加系于2010年1月27日，保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為：CGMCC No.3596，分類命名：油菜brassica napus；該附加系記載在公開號為102138515A的專利中，該專利的申請?zhí)枮?01010104342X，授權(quán)號為ZL201010104342X，申請日為2010.2.1。
實施例1、創(chuàng)制含蘿卜染色體的白菜的育種方法
具體步驟如下：
一、雜交及F1代植株鑒定
1、雜交
第一年10月播種甘藍型油菜-蘿卜d染色體附加系和白菜，11月分別定植5株苗于日光溫室。次年3月，以甘藍型油菜-蘿卜d染色體附加系為母本，白菜(后代回交以此為輪回親本)為父本進行雜交授粉；開花前2-3天，父母本花枝分別套袋隔離。母本蕾期去雄，取父本的花粉涂抹于母本的柱頭上，每株雜交20個蕾。6月份雜交種子成熟，得到F1代種子1000粒以上。
2、F1代植株分子鑒定
利用蘿卜d染色體的SSR標(biāo)記RSSH173-219檢測F1是否含有蘿卜d染色體，有該標(biāo)記的植株為含有蘿卜d染色體，具體方法如下：
采用SDS法提取親本和F1植株幼苗葉片DNA，用SSR引物RSSH173進行PCR擴增。
SSR引物RSSH173序列如下，擴增片段大小為219bp：
FW-primer：5'-TGAGCAGAGAAGAGAATCTAGAGACA-3'(序列1)；
BW-primer：5'-CAATAACCATTAAATTGTAAACCGAA-3'(序列2)。
上述PCR擴增的反應(yīng)體系為：8ng/μL DNA 1.6μL，5×PCR Buffer 1.2μL，10μM FW-primer 0.15μL，10μM BW-primer 0.15μL，5U Taq DNA聚合酶0.048μL，最后用ddH2O補齊6μL。
上述PCR擴增的程序為：94℃(5min)，94℃(30s)-50℃(30s)-72℃(30s)45個循環(huán)，之后72℃7min，4℃保存。
PCR產(chǎn)物用6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測。
F1代植株的DNA用SSR引物SSH173做PCR均能擴增出如圖1所示的219bp的特異條帶，即F1代植株含有蘿卜d染色體。
3、F1染色體鏡檢
染色體鏡檢方法：先固定F1植株幼苗根尖，取2～3mm左右根尖于飽和對二氯苯溶液中避光處理4h，后轉(zhuǎn)入現(xiàn)配的卡諾固定液(無水乙醇：冰醋酸以3：1混合)中固定3～24h。取固定后的根尖進行解離，先用蒸餾水漂洗根尖2～3次,然后將根尖放入已預(yù)熱的1mol/L鹽酸中60℃水浴6－8分鐘，再轉(zhuǎn)入蒸餾水中浸泡10分鐘以上。切取根尖用卡寶品紅染液染色4-6分鐘，常規(guī)壓片后在OLYMPUS BH-2顯微鏡下鏡檢染色體。結(jié)果F1根尖細胞的染色體數(shù)目是30。
選取F1代植株中分子鑒定含有蘿卜d染色體，且根尖細胞中染色體數(shù)為30的植株，命名為F1-A(基因組為AAC+d)。
二、回交及鑒定
1、回交
第二年10月播種上述一鑒定得到的F1-A和白菜，11月定植各5株。次年3月以F1-A單株作為母本，白菜為輪回父本進行回交，每株授粉30個蕾。授粉方法同步驟一的1，得到的種子為BC1。
2、BC1分子鑒定
利用蘿卜d染色體的SSR標(biāo)記RSSH173-219檢測BC1群體各單株是否含有蘿卜d染色體，有該標(biāo)記的植株為含有蘿卜d染色體，具體方法如上述一的2，結(jié)果供試的120株BC1中鑒定出58株帶該標(biāo)記的單株，用于進一步的染色體鑒定。
3、顯微鏡鏡檢根尖細胞染色體
用顯微鏡鏡檢上述分子標(biāo)記鑒定含有蘿卜d染色體的BC1植株的根尖細胞的染色體數(shù)目，具體方法如上述一的3，結(jié)果篩選出9株根尖細胞的染色體數(shù)為21的BC1單株。
4、形態(tài)觀察
觀察BC1單株的形態(tài)，選取BC1群體中分子鑒定含有蘿卜d染色體，且根尖細胞的染色體數(shù)為21，且形態(tài)與白菜相同或接近的植株5株，命名為BC1-A(基因組為AA+d)。
三、BC1自交及鑒定
1、BC1自交
第三年10月將上述二鑒定得到的5個BC1-A單株播種定植于溫室，次年3月進行自交，即取某單株自身的花粉涂抹于自身花朵柱頭上，每株授粉30個蕾，套袋隔離，種子成熟后得到BC1F2。
2、BC1F2分子鑒定
利用蘿卜d染色體的SSR標(biāo)記RSSH173-219檢測BC1F2群體各單株是否含有蘿卜d染色體，有該標(biāo)記的植株為含有蘿卜d染色體，具體方法如上述一的2，結(jié)果137個BC1F2單株中鑒定出92株含有蘿卜d染色體的個體。
3、顯微鏡鏡檢根尖細胞染色體
用顯微鏡鏡檢上述分子標(biāo)記鑒定含有蘿卜d染色體的BC1F2單株根尖細胞染色體，具體方法如上述一的3，選擇根尖細胞的染色體數(shù)為22的BC1F2單株23株。
4、形態(tài)觀察
觀察BC1F2單株的形態(tài)，選取BC1F2單株中分子鑒定含有蘿卜d染色體，且根尖細胞的染色體數(shù)為22，且形態(tài)與白菜相同或接近的植株，即為目的選育植株，命名為攜帶有蘿卜d染色體的白菜(基因組為AA+dd)。
序列表
<110> 北京市農(nóng)林科學(xué)院
<120> 一種創(chuàng)制能穩(wěn)定遺傳的攜帶蘿卜染色體的白菜種質(zhì)的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
tgagcagaga agagaatcta gagaca 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
caataaccat taaattgtaa accgaa 26