本發(fā)明涉及一種用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的組合物以及一種用于使用以上的組合物將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞和血管細(xì)胞的方法，所述組合物包含選自由直接轉(zhuǎn)分化因子ETV2和FLI1的每個(gè)的蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、以及用于通過引入編碼所述蛋白的核酸分子表達(dá)所述蛋白的載體組成的組的至少一種。另外，本發(fā)明涉及藥物組合物、細(xì)胞治療劑、篩選藥物的組合物或用于制備人工組織的3D打印生物材料組合物，其的每一個(gè)包含通過用于體細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)分化的以上的方法誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞和血管細(xì)胞，由此被用來預(yù)防或治療缺血性血管疾病。

背景技術(shù)：

血管形成過程主要分為兩種類型，即血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管形成(angiogenesis)，在血管發(fā)生中成血管細(xì)胞或血管祖細(xì)胞分化以形成原始血管網(wǎng)，在血管形成中新血管由現(xiàn)存的血管形成。在血管發(fā)生期間，血管祖細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞等，產(chǎn)生主要的血管。取決于血管祖細(xì)胞的分化模式，血管發(fā)生可包括1型血管發(fā)生和2型血管發(fā)生，在1型血管發(fā)生中，如在身體內(nèi)的血管的產(chǎn)生中一樣，血管內(nèi)皮細(xì)胞原位分化；在2型血管發(fā)生中，如在心內(nèi)膜或顱區(qū)域中的血管的形成中一樣，當(dāng)血管祖細(xì)胞遷移過某段顯著的距離并然后分化時(shí)2型血管發(fā)生出現(xiàn)。這在炎癥、腫瘤等的多種病理狀態(tài)，以及生理狀態(tài)(諸如傷口愈合、排卵和懷孕，包括胎兒發(fā)育過程)中充當(dāng)重要的機(jī)制，并因此正在研究中。

血管損傷引起多種缺血性疾病，且可從根本上通過恢復(fù)內(nèi)源性細(xì)胞或移植用于形成血管的功能性血管細(xì)胞來治療。在這方面，通過移植功能血管細(xì)胞的治療是有問題的，由于分化血管細(xì)胞的有效方法不容易得到，并且由于獲得大量的細(xì)胞是困難的。

此外，已提出了誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(ESC)及誘導(dǎo)多能(pluripotent)干細(xì)胞分化為血管細(xì)胞的方法，但，所述方法是不利的，由于誘導(dǎo)為感興趣的細(xì)胞的效率是低的，且在分化為特定的細(xì)胞后存在來自胚胎干細(xì)胞或多能干細(xì)胞的活化腫瘤基因的風(fēng)險(xiǎn)。此外，盡管誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞能夠避免與胚胎破壞相關(guān)的倫理問題，并且耐受當(dāng)被移植時(shí)的免疫系統(tǒng)排斥，如在胚胎干細(xì)胞中一樣，它們不期望地易于形成畸胎瘤。

另外，由體細(xì)胞通過直接轉(zhuǎn)分化制備血管祖細(xì)胞的方法尚未被報(bào)道。特別地，由體細(xì)胞通過ETV2(ETS變體基因2)或FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1(Friend leukemia virus integration 1))的轉(zhuǎn)導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)分化的血管細(xì)胞多潛能性(multipotency)的建立是未知的。

公開內(nèi)容

技術(shù)問題

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有被引入至其的所述核酸分子的載體，作為活性成分。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種用于預(yù)防或治療缺血性血管疾病的藥物組合物、一種用于預(yù)防或治療缺血性血管疾病的細(xì)胞治療劑、一種用于篩選用于治療缺血性血管疾病的藥物的組合物、或一種用于制備用于治療缺血性血管疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物，其的每一個(gè)包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

本發(fā)明的仍另一個(gè)目的是提供了一種用于體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的方法。

技術(shù)方案

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種血管祖細(xì)胞，所述血管祖細(xì)胞通過由將選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體引入至體細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)分化來誘導(dǎo)。

另外，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療缺血性血管疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療缺血性血管疾病的細(xì)胞治療劑，所述細(xì)胞治療劑包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種用于篩選用于治療缺血性血管疾病的藥物的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種用于制備用于治療缺血性血管疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物，所述3D打印生物材料組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種用于將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的方法，所述方法包括將選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體引入至體細(xì)胞。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明，血管祖細(xì)胞可由體細(xì)胞通過直接轉(zhuǎn)分化來制備，由此降低制備血管祖細(xì)胞所需的時(shí)間周期，并且避免是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的功能障礙的畸胎瘤的形成，最終使干細(xì)胞治療劑的副作用最小化。

附圖說明

圖1示出了編碼ETV2的互補(bǔ)DNA的慢病毒的切割圖；

圖2示出了編碼FLI1的互補(bǔ)DNA的慢病毒的切割圖；

圖3示出了在感染5天之后的ETV2和FLI1的表達(dá)的RT-PCR結(jié)果；

圖4示出了通過轉(zhuǎn)化ETV2、FLI1或ETV2/FLI1誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞隨時(shí)間的相差圖；

圖5是顯示作為誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞的分化標(biāo)志物的vWF、α-SMA和CD31的表達(dá)的免疫熒光圖；

圖6示出了，在將誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞移植進(jìn)小鼠之后，基于彩色直方圖像素計(jì)算的隨時(shí)間變化的血流量；以及

圖7示出了在將誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞移植進(jìn)小鼠之后的缺血性/非缺血性肢體血流量比率。

最佳模式

本發(fā)明提出了一種用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有被引入至其的所述核酸分子的載體，作為活性成分。

在本發(fā)明中，ETV2(ETS變體基因2)是ETS(E26轉(zhuǎn)化特異性因子或E-二十-六)家族的成員，并且以NCBI注冊號NM_014209.3注冊。已知ETS因子與胚胎血管發(fā)育相關(guān)。特別地，已知ETV2在血管內(nèi)皮的分化中執(zhí)行主要調(diào)控功能，但其用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的功能是完全未知的。

此外，F(xiàn)LI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)是ETS家族的成員，并且以NCBI注冊號NM_002017.4注冊。通過組成型活化在成紅血細(xì)胞中抑制紅細(xì)胞的分化是已知的。特別地，F(xiàn)LI1用于誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的功能如同ETV2一樣是完全未知的。

在本發(fā)明中，ETV2、FLI1或其組合可以以蛋白或編碼蛋白的核酸的形式來提供，且蛋白可包括來源于以下的任何ETV2或FLI1蛋白：人類或動(dòng)物，諸如小鼠、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊以及狗。此外，在本發(fā)明中使用的ETV2或FLI1蛋白不僅包括具有野生型氨基酸序列的蛋白，還包括ETV2或FLI1蛋白的蛋白變體。

術(shù)語“蛋白變體”指至少一個(gè)氨基酸殘基與ETV2或FLI1蛋白的天然氨基酸序列不同的蛋白，該不同起因于缺失、插入、非保守的或保守的取代或者其組合。變體可以是顯示與天然蛋白相同生物活性的功能等同物，可以是其中蛋白的物理和化學(xué)性質(zhì)根據(jù)需要被修改的變體，或可以是其的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性在某些物理或化學(xué)條件下增加或其的生理活性增加的變體。

在本發(fā)明中，編碼ETV2或FLI1的核酸可具有編碼野生型或變體型ETV2或FLI1蛋白的堿基序列，并且可通過使至少一個(gè)堿基經(jīng)歷取代、缺失、插入或其組合進(jìn)行突變。此外，它可經(jīng)由從天然提取或使用化學(xué)合成方法來制備。具有編碼ETV2或FLI1蛋白的堿基序列的核酸可以是單鏈或雙鏈，并且可以是DNA分子(基因組DNA、cDNA)或RNA分子。

在本發(fā)明中，載體可包括除了表達(dá)調(diào)控元件，諸如啟動(dòng)子、操縱基因、起始密碼子、終止密碼子、聚腺苷酸化信號或增強(qiáng)子，以外的信號序列或用于膜靶向或分泌的讀碼序列，并可被多樣地制造以便適用于一些目的。載體的啟動(dòng)子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。此外，表達(dá)載體包含用于選擇包含該載體的宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)志物，并且可復(fù)制的表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)。載體可以是自復(fù)制的，或者可被整合進(jìn)宿主DNA中。

載體包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、病毒載體以及附加型載體。優(yōu)選地有用的是病毒載體。病毒載體的實(shí)例可包括，但不限于，來源于以下的載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，HIV(人類免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽(Avian)肉瘤/白血病)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(勞斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺腫瘤病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、單純皰疹病毒等等。特別地，載體被用來增加直接轉(zhuǎn)分化的效率?？墒褂帽憩F(xiàn)出本發(fā)明的效果的任何載體，只要它使與待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相關(guān)的基因在典型的體細(xì)胞中被過表達(dá)。特別地，載體可通過表達(dá)ETV2或FLI1的慢病毒載體，且特別是基于SF的慢病毒載體作為SFFV啟動(dòng)子來例示。

此外，編碼ETV2或FLI1蛋白的核酸可使用本領(lǐng)域已知的任何方法被轉(zhuǎn)移或引入細(xì)胞中，例如，使用向量型裸DNA(vector-type naked DNA)，或使用脂質(zhì)體、陽離子聚合物等。

脂質(zhì)體是通過與用于基因遞送的陽離子磷脂諸如DOTMA或DOTAP混合得到的磷脂膜。當(dāng)陽離子脂質(zhì)體和陰離子核酸以預(yù)定的比率混合時(shí)，核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物可被形成，并由此可被引入進(jìn)細(xì)胞中。

特別在本發(fā)明中，編碼ETV2或FLI1蛋白的核酸分子被包含在病毒載體中，并由此包括編碼ETV2或FLI1蛋白的核酸的病毒載體可連同包裝缺陷型輔助質(zhì)粒一起被引入進(jìn)體細(xì)胞中。病毒的實(shí)例可包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、單純皰疹病毒等等。

如本文使用的，術(shù)語“體細(xì)胞”指除了生殖細(xì)胞以外的任何細(xì)胞。體細(xì)胞的實(shí)例可包括成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、G細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、B細(xì)胞、血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞以及臍帶血干細(xì)胞。然而，不管具體的組織細(xì)胞種類如何，只要它起始于體細(xì)胞，就可應(yīng)用直接轉(zhuǎn)分化，并且本發(fā)明不限于體細(xì)胞的以上實(shí)例。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，直接轉(zhuǎn)分化使用成纖維細(xì)胞來誘導(dǎo)。

如本文使用的，術(shù)語“血管祖細(xì)胞”指具有分化為構(gòu)成體內(nèi)血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞或血管細(xì)胞的能力的祖細(xì)胞。此外，在本發(fā)明中，“iVPC”表示誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，例如，根據(jù)本發(fā)明的方法由體細(xì)胞通過直接轉(zhuǎn)分化獲得的誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞。

另外，本發(fā)明提出了一種用于預(yù)防或治療缺血性血管疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提出了一種用于預(yù)防或治療缺血性血管疾病的細(xì)胞治療劑，所述細(xì)胞治療劑包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提出了一種用于篩選用于治療缺血性血管疾病的藥物的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

缺血性血管疾病指由于由外部或內(nèi)部原因的血管受損(impairment)引起血流紊亂的任何疾病且不限于體內(nèi)在特定部位處產(chǎn)生的。缺血性血管疾病的具體實(shí)例可包括，但不限于，腦血管疾病、心血管疾病、肢體缺血、外周血管疾病和缺血性肌壞死。更具體地，腦血管疾病可以是腦梗塞，中風(fēng)或腦出血，并且可包括可歸因于腦血管損害的任何血流紊亂，但本發(fā)明并不限于以上疾病的實(shí)例。此外，心血管疾病可以是動(dòng)脈硬化、缺血性再灌注損傷、再狹窄、動(dòng)脈炎、血管壁重塑、心室重塑、快速心室起搏、冠狀動(dòng)脈微栓塞、心動(dòng)過速、心動(dòng)過緩、壓力超負(fù)荷、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)、心律失常、中風(fēng)、心絞痛、心肌梗塞、心臟衰竭或高血壓，但可包括可歸因于心血管損害的任何血流紊亂，并且本發(fā)明并不限于以上疾病的實(shí)例。

如本文使用的，術(shù)語“細(xì)胞治療劑”指用于用通過在從人類分離之后培養(yǎng)及專門的任務(wù)制備的細(xì)胞或組織治療、診斷或預(yù)防疾病的目的的藥物(美國FDA規(guī)定的)，特別是用于通過在體外增殖或篩選自體、異體或異種活細(xì)胞或以其他方式改變細(xì)胞的生物學(xué)特性以恢復(fù)細(xì)胞或組織的功能來治療、診斷或預(yù)防疾病的目的的藥物。

另外，本發(fā)明提出了一種用于制備用于治療缺血性血管疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物，所述3D打印生物材料組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提出了一種用于將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為血管祖細(xì)胞的方法，所述方法包括，將選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有被引入至其的所述核酸分子的載體引入體細(xì)胞。

更具體地，該方法包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)體細(xì)胞，用包含ETV2、FLI1或其組合的基因的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)的體細(xì)胞，并且在用于誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)分化的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)被感染的體細(xì)胞。

用于培養(yǎng)體細(xì)胞的培養(yǎng)基包括通常在本領(lǐng)域中培養(yǎng)不僅體細(xì)胞而且干細(xì)胞和祖細(xì)胞中有用的任何培養(yǎng)基。培養(yǎng)基通常包含碳源、氮源以及少量的元素。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞被培養(yǎng)在補(bǔ)充有硫酸魚精蛋白(Sigma)的培養(yǎng)基中，但除了硫酸魚精蛋白以外可包含用于培養(yǎng)細(xì)胞必需的元素而不受限制。

此外，用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化的培養(yǎng)條件可包括通常在本領(lǐng)域中被用來誘導(dǎo)體細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)分化的任何培養(yǎng)基。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，有用的是用于生長血管祖細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括含10％FBS的最低必需培養(yǎng)基(MEM)、2mM L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、青霉素/鏈霉素及10ng/ml VEGF₁₆₅。

在本發(fā)明中，通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞與現(xiàn)存的血管分化和相關(guān)血管細(xì)胞增殖相關(guān)，因此有助于新血管形成，并且可增加血管細(xì)胞的數(shù)量和密度兩者，由此表現(xiàn)出對缺血性疾病的優(yōu)異的治療效果。

發(fā)明模式

可通過以下實(shí)施例獲得本發(fā)明的更好的理解，陳述以下實(shí)施例以進(jìn)行說明，但不被理解為限制本發(fā)明的范圍。提供本發(fā)明的實(shí)施例以向具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通知識的那些技術(shù)人員充分地描述本發(fā)明。

實(shí)施例1.誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞(iVPC)的制備

將皮膚成纖維細(xì)胞在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(含10％FBS的DMEM高葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1x MEM非必需氨基酸、β-巰基乙醇、1x青霉素/鏈霉素)中培養(yǎng)。

293細(xì)胞使用Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)用SFFV啟動(dòng)子，即，編碼ETV2和FLI1的互補(bǔ)DNA的基于SF的慢病毒載體，及用包裝缺陷型輔助質(zhì)粒進(jìn)行感染。在48小時(shí)之后，根據(jù)Zaehres,H.&Daley,G.Q.,(2006),Methods Enzymol 420,49-64中公開的方法獲得病毒上清液。

將皮膚成纖維細(xì)胞以1x10⁴個(gè)細(xì)胞的密度等分進(jìn)0.1％明膠涂覆的6孔板中，并連同包含ETV2和FLI1(1:1)的病毒上清液一起培養(yǎng)24小時(shí)，并補(bǔ)充有6μg/ml硫酸魚精蛋白(Sigma)。轉(zhuǎn)染效率使用SF-GFP對照病毒進(jìn)行計(jì)算。

在注射兩天之后，將細(xì)胞再次等分進(jìn)新的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且培養(yǎng)基用血管祖細(xì)胞生長培養(yǎng)基(含10％FBS的最低必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、2mM L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、青霉素/鏈霉素、10ng/ml VEGF₁₆₅(Peprotech))來替換。此后，以三天的時(shí)間間隔用新的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，并且將集落物理分離以用于增殖。

實(shí)施例2.使用RT-PCR和相差顯微鏡檢查ETV2和FLI1的表達(dá)

在感染五天之后，使用RT-PCR觀察ETV2和FLI1的表達(dá)。

具體地，在感染五天之后，總RNA使用RNeasy試劑盒(Qiagen)從各細(xì)胞提取，且cDNA使用Omniscript RT(Qiagen)來合成。PCR使用重組Taq DNA聚合酶(Invitrogen)來進(jìn)行。

在RT-PCR之后，通過使用GAPDH作為對照，負(fù)載到瓊脂糖凝膠上證實(shí)表達(dá)(圖3)。

如在圖4中示出的，使用相差顯微鏡，在感染之后10至11天內(nèi)，集落開始出現(xiàn)在用ETV2和ETV2/FLI1感染的細(xì)胞群中，并且集落的數(shù)目隨時(shí)間增加。

在感染之后30天內(nèi)，本發(fā)明人觀察到在用FLI1感染的細(xì)胞群中的集落。為了增殖集落，將細(xì)胞群物理分離并在明膠涂覆的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。

實(shí)施例3.使用免疫細(xì)胞化學(xué)體外分析血管祖細(xì)胞

為了進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)，將細(xì)胞在4％多聚甲醛中固定10min，并用0.1％Triton X-100處理10min以成為可滲透的。將細(xì)胞在4％FBS/PBS封閉溶液中培養(yǎng)30min，并然后在室溫與用封閉溶液稀釋的一抗反應(yīng)1小時(shí)。使用的一抗體如下：vWF(1:400,Abcam)、CD31(1:200,Chemicon)和α-SMA(1:200,Abcam)。

在與一抗反應(yīng)之后，用0.05％PBST(吐溫20/PBS)將細(xì)胞洗滌三次。此后，第二熒光抗體用PBS稀釋，并然后與細(xì)胞反應(yīng)1小時(shí)(Alexa Fluor 488和568；1:1000,Molecular Probes)。細(xì)胞用0.05％PBST洗滌三次，且細(xì)胞核使用Hoechst 33342(Thermo Scientific)復(fù)染15秒。在染色之后，細(xì)胞使用Olympus Cell^TIRF(UOBC center,UNIST)顯微鏡進(jìn)行觀察。

血管祖細(xì)胞具有使得它們能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的性質(zhì)，并且CD31和vWF被用作血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，且α-SMA被用作平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物。通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析證實(shí)了通過ETV2、FLI1和ETV2/FLI1的每個(gè)轉(zhuǎn)化獲得的誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞(iVPC)(圖5)。

實(shí)施例4.誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞對缺血性疾病的治療的效果

在缺血性肢體模式中，評價(jià)了通過用ETV2、FLI1和ETV2/FLI1轉(zhuǎn)化獲得的誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞(誘導(dǎo)的-VPC、iVPC)對恢復(fù)血流是否有效。為此，將誘導(dǎo)的血管祖細(xì)胞移植進(jìn)該模式中。在預(yù)定的時(shí)間周期之后，測量血流量。

具體地，無胸腺的裸小鼠(雄性、8至10周齡、體重17g至22g)用160mg/kg戊巴比妥進(jìn)行麻醉，以用于切開股動(dòng)脈和激光多普勒灌注成像。將股動(dòng)脈切開至股動(dòng)脈從近端組織分為大隱靜脈和腘靜脈作為髂外動(dòng)脈的分支的遠(yuǎn)心點(diǎn)。在動(dòng)脈結(jié)扎后，將小鼠分為以下測試組：ETV2、FLI1和ETV2/FLI1iVPC及對照(HBSS；鹽水注射)(每組n＝8)。

在移植之前，細(xì)胞用CM-Dil(Invitrogen)標(biāo)記。此后，各小鼠的大腿中央內(nèi)的股薄肌的四個(gè)點(diǎn)用1x10⁶個(gè)細(xì)胞(80μL)或HBSS肌內(nèi)注射。在細(xì)胞移植進(jìn)缺血性和正常的肢體之后的第7天、第14天和第28天，以及在移植的當(dāng)天，測量使用激光多普勒灌注成像(LDPI)分析儀(Moor instruments,Devon,UK)來進(jìn)行(圖6)。

缺血和非缺血肢體的血流量基于彩色直方圖的像素來計(jì)算。紅色和藍(lán)色分別指示高血流量和低血流量。血流量通過相應(yīng)于缺血/非缺血肢體血流量比率的LDPI指數(shù)來代表。在圖7中，在手術(shù)之前的比率1指示兩種肢體內(nèi)相同的血流量。

關(guān)于測量結(jié)果，如在圖6和7中示出的，在缺血性肢體模型中，所有移植iVPC的組表現(xiàn)出血流量恢復(fù)。特別地，與對照相比，ETV2/FLI1組顯示顯著增加的血流量恢復(fù)。