本發(fā)明涉及包含偶聯(lián)到激活物基團的神經(jīng)降壓素或其類似物的新的化合物(也被稱為“活化的神經(jīng)降壓素”)、包含所述化合物的藥物組合物及其用途。本發(fā)明的化合物和組合物可用于在需要的哺乳動物中降低體溫(例如誘導受控的藥理學正常體溫或低體溫)，特別是誘導神經(jīng)保護。它們可以被特別用于減輕與例如缺血、創(chuàng)傷或癲癇發(fā)作相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷以及治療疼痛。本發(fā)明的化合物和組合物也可用于治療驚厥、過高體溫或能夠從神經(jīng)降壓素的生物活性獲益的任何病癥。

背景技術(shù)：

體溫降低(低體溫)是針對在各種不同情況例如與中風、心臟驟?；蛐律鷥喝毖嚓P(guān)的腦缺血、癲癇發(fā)作、嚴重創(chuàng)傷性腦和脊髓損傷或心臟手術(shù)中發(fā)生的損傷的強力神經(jīng)保護方法。在具有升高的體溫的病理情形(例如顱內(nèi)高壓(ICH)、缺血性或出血性中風、創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)、膿毒癥或伴有發(fā)熱的任何病毒、細菌或寄生蟲感染)中，將過高體溫降低到正常體溫也是有正當理由的。

用于降低體溫的物理方法已在本領(lǐng)域中使用，其包括外部方法例如冷卻材料或處理(例如冷卻毯、冰浴等)或內(nèi)部方法(例如冷卻探頭、冷流體的輸注等)或兩者。然而，這些物理方法難以實施，昂貴，可能使作用和/或瞬時效應(yīng)的開始延遲，并且可能引起不想要的副作用，例如使得必須施用附加治療包括麻痹或鎮(zhèn)靜劑的顫抖。

已經(jīng)提出了藥理學方法，其本質(zhì)上使用神經(jīng)降壓素或其類似物。神經(jīng)降壓素(NT)是一種直鏈十三肽，其氨基酸序列為pyroGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH。在哺乳動物中，內(nèi)源NT主要在CNS中表達，在那里它起到神經(jīng)遞質(zhì)和與多巴胺能系統(tǒng)相互作用的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的作用。NT也在外周組織中表達，主要是在胃腸道中，在那里它在腸動力中發(fā)揮作用。此外，已暗示NT系統(tǒng)的失調(diào)與許多神經(jīng)精神病學疾病以及幾種癌癥的病理生理學相關(guān)。當直接給藥到腦或脊髓中時，NT發(fā)揮強力的μ不依賴性鎮(zhèn)痛效果并降低體溫。盡管NT的臨床使用可以提供治療許多病理生理病癥的有趣且創(chuàng)新的手段，但它受到在系統(tǒng)性給藥后在血漿中非?？焖俚牡鞍姿馇懈畹淖璧K。此外，它的不良的血腦屏障(BBB)透過性阻礙了它的治療潛力，除非直接給藥到腦或脊髓中。因此，需要藥物化學方法，以允許設(shè)計能夠在系統(tǒng)性給藥后引發(fā)中樞活性的基于神經(jīng)降壓素的化合物。已經(jīng)提出了設(shè)計神經(jīng)降壓素類似物和/或?qū)⑸窠?jīng)降壓素或其類似物偶聯(lián)到遞送劑例如抗體(WO2011/127580)或轉(zhuǎn)運肽(WO2010/063122)。

然而，在本領(lǐng)域中對基于神經(jīng)降壓素的藥理學藥劑存在著需求，所述藥劑具有改進的效能和安全性情況，包括起效快速以及在不同病理生理病癥包括體溫過高、興奮性中毒過程、神經(jīng)炎癥、驚厥以及疼痛中具有生物活性。

發(fā)明概述

本發(fā)明公開了具有改進的治療性能的新的神經(jīng)降壓素化合物以及它們在哺乳動物、特別是人類對象中的用途。本發(fā)明是基于新分子的設(shè)計，所述分子包含共價偶聯(lián)到(b)激活物基團的(a)NT或其類似物。本發(fā)明的“活化的NT”化合物具有提高的BBB透過性和對蛋白水解切割的抗性，并展示出高度改進的生物活性。具體來說，在系統(tǒng)性給藥后，本發(fā)明的活化的NT化合物在各種不同的治療性病癥中誘導顯著的體內(nèi)治療效果包括低體溫，在癲癇持續(xù)狀態(tài)下誘導抗驚厥效果，以及誘導神經(jīng)保護性效果和抗神經(jīng)炎性效果。重要的是，本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出強的生物活性，起效非?？焖?，并具有相對短的作用持續(xù)時間和非常好的安全性情況。這些性質(zhì)為需要安全的治療性干預(yù)的急性病癥中生物學效應(yīng)的精細控制和調(diào)節(jié)提供了非常良好的藥效學和安全性先決條件。此外，本發(fā)明的化合物在重復給藥后保留一定活性，因此可用于重復的或亞慢性治療。

因此，本發(fā)明的目的涉及一種化合物，其包含共價偶聯(lián)到激活物基團的神經(jīng)降壓素多肽。所述激活物基團包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸或其類似物。與所述NT多肽的偶聯(lián)可以是直接的，或者可以是間接的，即通過連接物基團。

本發(fā)明的另一個目的涉及一種藥物組合物，其包含如上所定義的化合物和可藥用載體或賦形劑。

本發(fā)明的另一個目的是一種制造如上所定義的化合物的方法，所述方法包括將神經(jīng)降壓素多肽共價偶聯(lián)到如上所定義的激活物基團，優(yōu)選地通過使用連接物基團的間接共價偶聯(lián)。

本發(fā)明的另一個目的涉及如上所定義的化合物或組合物作為藥物的用途。所述化合物或組合物可用于在哺乳動物對象中降低體溫(例如誘導低體溫或正常體溫)、誘導神經(jīng)保護(例如減輕腦損傷)以及治療疼痛。

本發(fā)明的另一個目的涉及如上所定義的化合物或組合物的用途，其用于治療具有腦損傷的對象。

本發(fā)明的另一方面涉及一種在哺乳動物對象中誘導低體溫的方法，所述方法包括向所述對象系統(tǒng)性給藥如上所定義的化合物或組合物。

本發(fā)明的另一個目的是一種治療具有腦損傷的對象的方法，所述方法包括向所述對象系統(tǒng)性給藥如上所定義的化合物或組合物。

本發(fā)明可用于在任何哺乳動物對象例如人類患者中治療腦損傷(例如保護、防止或減輕其效應(yīng))。它特別適合于治療具有腦缺血、中風、心臟驟?；蛐律鷥喝毖d癇發(fā)作、嚴重創(chuàng)傷性頭部和脊髓損傷、心臟手術(shù)、ICH、膿毒癥或伴有發(fā)熱的任何病毒、細菌或寄生蟲感染的對象。它也適合于治療患有對標準的抗驚厥劑有抗性的癲癇發(fā)作或?qū)藴实耐藷崴幚韺W藥劑有抗性的體溫過高的對象，或者與標準的冷卻技術(shù)組合以更快地引發(fā)患者冷卻。

附圖說明

圖1.在以8mg/kg的NT摩爾當量(eq.)劑量靜脈內(nèi)注射(團注(bolus))后，鹽水(NaCl 0.9％)、NT或化合物I對Swiss(CD-1)小鼠的直腸體溫的影響。

圖2.在以0.5至8mg/kg范圍內(nèi)的NT eq.劑量i.v.注射(團注)的Swiss(CD-1)小鼠中，化合物I的低體溫劑量響應(yīng)關(guān)系。

圖3.化合物I、化合物II和化合物IV在Swiss(CD-1)小鼠中的低體溫響應(yīng)?；衔颕、II和IV以0.5mg/kg eq.NT的相同劑量水平i.v.注射(團注)到小鼠中。

圖4.在以0.03至10mg/kg范圍內(nèi)的NT eq.劑量i.v.注射(團注)的Swiss(CD-1)小鼠中，化合物II的低體溫劑量響應(yīng)關(guān)系。最低有效劑量(MED)為0.35mg/kg eq.NT，并且在10mg/kg eq.NT下觀察到最高效果。

圖5.使用原位腦灌注，[³H-Tyr3]-NT、[³H-Tyr3]-化合物I和[³H-Tyr3]-化合物XIV在小鼠中的BBB和血視網(wǎng)膜屏障(BRB)運輸。

圖6.NT、化合物I、化合物IV和化合物XIV的體外血液穩(wěn)定性。將肽在新鮮收集的Swiss(CD-1)小鼠血液中在37℃下溫育，并在指定的時間點使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)(LC-MS/MS)分析方法定量血漿級分中剩余的完整肽的百分率。

圖7.化合物II與本發(fā)明的包含NT的較短類似物的活化的神經(jīng)降壓素化合物在Swiss(CD-1)小鼠中的低體溫響應(yīng)的比較。化合物II、化合物V、化合物VI或化合物VII以0.5mg/kg eq.NT的相同劑量水平i.v.注射(團注)到小鼠中。所有偶聯(lián)物顯示出相似的體溫降低效力。

圖8.化合物II和VIII在Swiss(CD-1)小鼠中的體溫降低效果.化合物II或化合物VIII以10mg/kg eq.NT的相同劑量水平i.v.注射(團注)到小鼠中。

圖9.在N-端SEQ ID NO：9激活物基團與C-端NT(6-13)或NT(8-13)組成部分之間包含不同連接物的神經(jīng)降壓素偶聯(lián)物在Swiss(CD-1)小鼠中的低體溫響應(yīng)的比較。不含連接物基團(化合物IX)、包含GGG(化合物X)、Ahx(化合物XII)、PEG2(化合物XIII)或PEG6(化合物XIV)連接物的偶聯(lián)物以10mg/kg eq.NT的相同劑量水平i.v.注射(團注)到小鼠中。

圖10.包含NT(8-13)類似物的串聯(lián)的SEQ ID NO：9-NT(8-13)或SEQ ID NO：11-NT(8-13)偶聯(lián)物在Sprague-Dawley大鼠中的低體溫響應(yīng)的比較。在NT(8-13)序列中包含[Tle12](化合物XV)、[Lys8,Tle12](化合物XVI和化合物XX)、[Lys9,Tle12](化合物XVII)、[Trp11,Tle12](化合物XVIII)或[Lys8,Trp11,Tle12](化合物XIX)置換的偶聯(lián)物以5mg/kg eq.NT的相同劑量水平i.v.注射(團注)到大鼠中。

圖11.化合物XIV的重復給藥對體溫的影響。在4天期間，向Swiss(CD-1)小鼠以4mg/kg eq.NT的劑量每日i.v.注射(團注)給藥化合物XIV，并且每天在治療給藥后3小時期間評估低體溫響應(yīng)?；衔颴IV在多日中保留了顯著且穩(wěn)定的體溫降低效果。

圖12.化合物XIV在酵母誘導的體溫過高的小鼠模型中的退熱效果。在NMRI小鼠中皮下注射酵母懸液引起直腸溫度升高+0.8℃(基線2，體溫過高小鼠相比于首次用于實驗的小鼠)。以所指示的劑量水平i.v.注射(團注)的化合物XIV不僅顯示出退熱效果，而且在中等和高的劑量水平下誘導強烈且劑量依賴性的低體溫。

圖13：在癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)下化合物XIV對體溫和癲癇發(fā)作強度的影響。對小鼠給藥促驚厥藥物鉀鹽鎂釩(KA)，其在2小時后誘導SE特征性的5級或6級癲癇發(fā)作，并通常伴有體溫過高。在SE發(fā)作后30分鐘(SE30)以2或4mg/kg eq.NT的劑量給藥的化合物XIV總是引起瞬時的低體溫，其持續(xù)至少2hrs(圖13A)。在SE30+化合物XIV組中，由化合物XIV誘導的低體溫伴有癲癇發(fā)作的顯著減少。一部分動物被i.p.給藥高劑量的安定(DZP)，由于它的抗驚厥效果其在癲癇發(fā)作模型中被用作陽性對照。當在SE發(fā)作后30min給藥神經(jīng)降壓素(NT8-13)時，與SE動物相比沒有觀察到體溫或癲癇發(fā)作強度的顯著變化(圖13B)。

圖14.化合物XIV在通過KA誘導的SE后具有嚴重興奮性中毒損傷和神經(jīng)炎癥的小鼠中的神經(jīng)保護和抗神經(jīng)炎性效果。使用免疫組織化學標記(圖14A)來評估來自于假處理(SHAM)(A、D、G)、SE(B、E、H)和SE+化合物XIV(SE+HT)(C、F、I)動物的海馬結(jié)構(gòu)的冠狀面中腦損傷的程度。在A、B和C中將神經(jīng)元用標記神經(jīng)元特異性核蛋白的抗NeuN抗體標記。箭頭指向CA1和CA3錐體細胞層中以及齒狀回(DG)的門區(qū)(H)中的神經(jīng)元。神經(jīng)炎癥使用分別監(jiān)測星形細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞反應(yīng)性的抗GFAP抗體(D、E、F)和抗IbaI抗體(G、H、I)來評估。小箭頭指向反應(yīng)性星形細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞。標尺條＝500μm。SE誘導的神經(jīng)膠質(zhì)變性涉及小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞類型。在假處理動物中，在海馬中檢測到GFAP和Iba1的基線標記(圖14A)。在SE動物中，在所有海馬層中出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的非常強的激活。當在SE發(fā)作后30min給藥化合物XIV(SE+HT)時，這種炎性響應(yīng)顯著降低。

NeuN和Fluoro-jade C標記被用于定量神經(jīng)元死亡和化合物XIV的效應(yīng)(圖14B)。在假處理動物中，在海馬中沒有觀察到神經(jīng)元死亡。在SE動物中，在CA1-3錐體細胞層和DG中觀察到主要的神經(jīng)元死亡。當在SE發(fā)作后30min給藥化合物XIV或DZP時，在SE動物中觀察到的神經(jīng)變性顯著減少，但是當給藥NT(8-13)時沒有觀察到變化(圖14B)。

圖15：在SE后8周，化合物XIV在海馬中減弱苔蘚纖維出芽。對門細胞損失做出響應(yīng)，苔蘚纖維這種齒狀回顆粒細胞的軸突的異常出芽發(fā)生在內(nèi)分子層(IML)中，并且在動物癲癇發(fā)作模型和人類中的癲癇中已被確立。在SE誘導后8周，使用用于鋅囊泡轉(zhuǎn)運體3(ZnT3)的免疫組織化學標記來評估化合物XIV對出芽的影響。在假處理動物中，苔蘚纖維末梢存在于CA3區(qū)的門和透明層中，并且在DG的IML中沒有觀察到末梢。在SE動物中，在IML內(nèi)觀察到苔蘚纖維末梢。與SE動物相比，在SE發(fā)作后30min給藥化合物XIV(SE+HT，圖15A)或DZP的動物中，神經(jīng)支配IML的末梢的數(shù)目相當大地減少，但是當給藥NT(8-13)時相對不變(圖15A、15B)。

圖16.在小鼠中，化合物XIV在扭體試驗中的鎮(zhèn)痛效果。將化合物XIV以0.5、1和5mg/kg eq.NT的逐漸增加的劑量水平i.v.注射(團注)到小鼠中，30min后腹膜內(nèi)注射10mL/kg的0.5％乙酸。在乙酸的i.p.注射后5min開始的10min時間段內(nèi)，測量每只小鼠中發(fā)生的腹部伸展的次數(shù)(扭動計數(shù)/10min)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了新的基于神經(jīng)降壓素的化合物、包含所述化合物的藥物組合物及其用途，例如用于在需要的對象中誘導體溫的受控降低(例如低體溫或正常體溫)、受控的抗驚厥效果或鎮(zhèn)痛。

更具體來說，本發(fā)明的目的在于一種包含共價偶聯(lián)到激活物基團的神經(jīng)降壓素多肽的化合物，所述激活物基團包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸殘基或其類似物。

正如在實驗部分中說明的，本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素化合物與天然NT相比時表現(xiàn)出高度改進的生物性能，包括提高的BBB透過性和對蛋白水解切割的高抗性兩者。所述化合物在低劑量水平下，在系統(tǒng)性給藥后表現(xiàn)出強的生物活性，起效非?？欤⑶揖哂懈叩哪褪苄院桶踩詡?cè)貌(profile)。具體來說，本發(fā)明的化合物i)誘導的中樞體溫降低效應(yīng)比使用天然NT獲得的效應(yīng)高出多達80倍，ii)不引起與低體溫相關(guān)的顫抖，iii)表現(xiàn)出防止?jié)撛谥滤佬缘倪^度低體溫的平臺效應(yīng)，iv)在靜脈內(nèi)注射(團注)后的最低有效劑量(MED)與最高耐受劑量(MTD)之間顯示出顯著的安全裕量，v)在重復的靜脈內(nèi)給藥后保持顯著的生物活性，證明了它們適合于需要重復或亞慢性治療的病癥，vi)表現(xiàn)出強的退熱活性，vii)有效地減輕或停止運動性癲癇發(fā)作，viii)表現(xiàn)出神經(jīng)保護和抗神經(jīng)炎性活性，ix)有效地減少癲癇發(fā)作后和癲癇中異常的軸突出芽，以及x)誘導顯著的鎮(zhèn)痛效果，在不同的病理生理狀況中表現(xiàn)出意料之外的有益效果和效能。

本發(fā)明的化合物本質(zhì)上包含共價偶聯(lián)到激活物基團的神經(jīng)降壓素多肽。所述激活物基團可以直接地或間接地、即通過連接物基團共價偶聯(lián)到所述神經(jīng)降壓素多肽。所述化合物也可以用下式(I)表示：

NT–連接物–AG (I)

其中NT表示具有神經(jīng)降壓素活性的任何多肽；連接物是具有至少兩個不同或相同的反應(yīng)性基團的交聯(lián)分子或平臺；AG是包含上面指定的氨基酸序列的激活物基團。應(yīng)該理解，為了提供優(yōu)化的活性，可以調(diào)整所述組成部分彼此之間的空間排列、連接策略和錨定點。

神經(jīng)降壓素多肽

術(shù)語神經(jīng)降壓素多肽是指具有神經(jīng)降壓素活性的任何多肽，例如神經(jīng)降壓素、神經(jīng)降壓素類似物或神經(jīng)降壓素受體的多肽激動劑。上面提到的術(shù)語“類似物”包括野生型神經(jīng)降壓素的保留了神經(jīng)降壓素的一種或幾種生物活性例如誘導低體溫或鎮(zhèn)痛的能力的任何變體或片段。更優(yōu)選地，神經(jīng)降壓素多肽是指天然的神經(jīng)降壓素或其類似物。在更優(yōu)選實施方式中，術(shù)語神經(jīng)降壓素多肽包括人類神經(jīng)降壓素或其保留了神經(jīng)降壓素的一種或幾種生物活性的片段或變體。

人類野生型神經(jīng)降壓素是一種13個氨基酸的肽，其具有下述序列：pELYENKPRRPYIL-OH(SEQ ID NO：1)。

因此，本發(fā)明的神經(jīng)降壓素多肽優(yōu)選地包括包含以下的任何多肽：

(i)SEQ ID NO：1，

(ii)(i)的天然變體，

(iii)(i)或(ii)的片段，或

(iv)(i)-(iii)的任一序列的類似物，優(yōu)選地包含一個或多個氨基酸置換或修飾，甚至更優(yōu)選地包含1、2、3、4、5、6或7個氨基酸殘基、甚至更優(yōu)選地1、2、3或4個氨基酸殘基的置換或修飾，

所述多肽具有引發(fā)神經(jīng)降壓素的一種或幾種生物活性例如低體溫或鎮(zhèn)痛的能力。

當在本文中使用時，序列的片段是指包含所述序列的至少4個、更優(yōu)選地至少5個連續(xù)氨基酸的任何片段。就此而言，符合本發(fā)明的優(yōu)選的神經(jīng)降壓素多肽包括至少包含人類神經(jīng)降壓素的8-13位氨基酸(“NT(8-13)”)或人類神經(jīng)降壓素的6-13位氨基酸(“NT(6-13)”)或人類神經(jīng)降壓素的2-13位氨基酸(“NT(2-13)”)的神經(jīng)降壓素片段。已報道這些至少包含C-端NT(8-13)片段的片段引發(fā)神經(jīng)降壓素的大部分生物活性，如果不是所有生物活性的話。相應(yīng)的氨基酸序列提供如下：

NT(8-13)：RRPYIL(SEQ ID NO：2)

NT(6-13)：KPRRPYIL(SEQ ID NO：3)

NT(2-13)：LYENKPRRPYIL(SEQ ID NO：4)

在特定實施方式中，符合本發(fā)明的神經(jīng)降壓素多肽的序列與野生型神經(jīng)降壓素多肽或其片段的序列相比包含1、2、3或4個氨基酸修飾(例如置換或插入或化學修飾)。就此而言，可以單個地或組合地對NT或其片段做出下述氨基酸置換和修飾，以產(chǎn)生在本發(fā)明中使用的神經(jīng)降壓素的生物活性類似物：

-N-端乙?；援a(chǎn)生例如乙?；?NT(2-13)或乙?；?NT(6-13)或乙?；?NT(8-13)，

-用(D)-Arg、Lys、(D)-Lys、HLys(高賴氨酸)、Dab(二氨基丁酸)、Orn(鳥氨酸)、(D)-Orn或用α-脫氨基-N,N-二甲基高賴氨酸置換Arg8，以產(chǎn)生例如[(D)-Lys8]NT(8-13)、[Lys8]NT(8-13)或[HLys8]NT(8-13)，

-用Lys、(D)-Lys、Orn、(D)-Orn、Dab、(D)-Arg、HLys(高賴氨酸)或用α-脫氨基-N,N-二甲基高賴氨酸置換Arg9，以產(chǎn)生例如[Lys9]NT、[Lys9]NT(8-13)、[(D)-Orn9]NT或[(D)-Orn9]NT(8-13)，

-用Trp、(D)-Trp、neoTrp、(D)-Tyr、Phe、(D)-Phe、Nal(萘基丙氨酸)或(D)-3,1-萘基-丙氨酸置換Tyr11，以產(chǎn)生例如[Trp11]NT(8-13)、[(D)-Tyr11]NT(8-13)、[Trp11]NT、[(D)-Tyr11]NT；

-用Tle(叔丁基-亮氨酸)置換Ile12，以產(chǎn)生例如[Tle12]NT(8-13)、[Tle12]NT；

-Arg8、Arg9、Tyr11和Ile12的組合置換，以產(chǎn)生例如[(D)-Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys8,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Tle12]NT(8-13)、[Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)或[HLys8,Tle12]NT(8-13)；

-用CH₂NH(psi)還原鍵修飾8-9、9-10、10-11、11-12或12-13位置處的肽鍵；和/或

-NT(8-13)二聚體的環(huán)化，其中帶有或不帶有任何上述可能的氨基酸置換或修飾。

在優(yōu)選實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽選自人類NT、NT(2-13)、NT(6-13)或NT(8-13)或其具有1至4個氨基酸修飾的類似物。

就此而言，在最優(yōu)選的實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽選自[Lys8]NT(8-13)、[Lys9]NT(8-13)、[HLys8]NT(8-13)、[(D)-Lys8]NT(8-13)、[(D)-Orn9]NT(8-13)、[Lys8,Lys9]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Lys9]NT(8-13)、[Trp11]NT(8-13)、[neoTrp11]NT(8-13)、[Tle12]NT(8-13)、[Trp11,Tle12]NT(8-13)、[neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys8,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Trp11]NT(8-13)、[(D)-Lys8,neoTrp11]NT(8-13)、[Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Lys9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Lys9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Trp11]NT(8-13)、[Lys9,neoTrp11]NT(8-13)、[Lys9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,Trp11]NT(8-13)、[HLys8,neoTrp11]NT(8-13)、[HLys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Trp11]NT(8-13)、[(D)-Orn9,neoTrp11]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、或[(D)-Orn9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)。

在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的神經(jīng)降壓素多肽是包含任何上述氨基酸置換的全尺寸NT或NT(2-13)或NT(6-13)多肽。

在最優(yōu)選的實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽是NT(8-13)或其保留了神經(jīng)降壓素的一種或幾種生物活性的類似物。

適合用于本發(fā)明的其他神經(jīng)降壓素多肽或神經(jīng)降壓素置換描述在例如下述文獻中：Rivier等，J Med Chem 1977；Tokumura等，Chem Pharm Bull(Tokyo)1990；Labbé-Jullié等，J PharmExp Ther 1994；Tyler等，Brain Res.1998；Podstawka-Proniewicz等，J Phys Chem 2011；Kitabgi等，Mol.Pharm.18,11-19(1980)；專利申請US2009/0062212、WO2008/137720、WO 1999/52539、WO2007/070672、WO2010/063122或WO2012/000118。

激活物基團

本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素化合物包含增強它們的活性的激活物基團。一般情況下，所述激活物基團包含結(jié)合BBB上的LDL受體(LDLR)的任何肽序列。通過允許NT的LDLR介導的轉(zhuǎn)胞吞作用，本發(fā)明人產(chǎn)生了具有令人吃驚的生物活性的活化的化合物。就此而言，在更優(yōu)選的實施方式中，所述激活物基團包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸殘基(“P”)或其類似物。在上式中，M表示甲硫氨酸，R表示精氨酸，L表示亮氨酸。正如在實驗部分中所示，這種激活物基團為本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素分子提供了改進的生物活性和藥理活性形式。具體來說，這種活化基團的接枝產(chǎn)生了活化的神經(jīng)降壓素分子，其在靜脈內(nèi)給藥時與內(nèi)源NT相比在降低體溫方面的效力強出高達80倍。除了這種顯著的降低體溫效應(yīng)之外，所述化合物顯示出意料之外的退熱活性。它們還表現(xiàn)出減少或停止運動癲癇發(fā)作的潛力，并通過抑制與興奮性毒性相關(guān)的神經(jīng)元死亡和神經(jīng)炎癥和通過減少與驚厥和癲癇相關(guān)的異常軸突出芽，表現(xiàn)出強力且出人意料的神經(jīng)保護活性。此外，本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素分子表現(xiàn)出非常良好的藥物動力學和藥效學側(cè)貌，在系統(tǒng)性給藥后的快速起效，在低劑量水平下強的降低體溫活性，沒有與低體溫相關(guān)的顫抖的非常良好的安全性側(cè)貌，防止?jié)撛谥滤赖倪^度體溫降低的平臺效應(yīng)，以及MED與MTD之間400倍的安全裕量。最后，所述化合物通過靜脈內(nèi)給藥顯示出顯著的鎮(zhèn)痛效果。

因此，本發(fā)明涉及一種活化的神經(jīng)降壓素化合物，其中所述化合物包含激活物基團，所述激活物基團包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸殘基(“P”)或其類似物。優(yōu)選地，所述脯氨酸類似物選自Pip和Thz。Pip表示哌啶甲酸，Thz表示噻唑烷-4-甲酸。

根據(jù)優(yōu)選實施方式，所述激活物基團包含下列氨基酸序列之一：

M-P-R-L-R(SEQ ID NO：5)；

M-Pip-R-L-R(SEQ ID NO：6)；或

M-Thz-R-L-R(SEQ ID NO：7)。

在另一個特定實施方式中，所述激活物基團中的氨基酸序列包含另一個L或D構(gòu)型的N-端半胱氨酸殘基(“C”)，即包含氨基酸序列C-M-aa1-R-L-R或c-M-aa1-R-L-R，其中aa1如上所定義。在最優(yōu)選的實施方式中，所述N-端半胱氨酸殘基“C”是D構(gòu)型的。

在另一個特定實施方式中，所述激活物基團中的氨基酸序列包含包含另外兩個C-端殘基，即包含序列M-aa1-R-L-R-aa2-aa3，優(yōu)選為c-M-aa1-R-L-R-aa2-aa3，其中aa1如上所定義，aa2是Gly或其類似物Sar(肌氨酸)，aa3是Cys或其類似物Pen(青霉胺)。

特別和最優(yōu)選的激活物基團包含下列氨基酸序列之一：

c-M-P-R-L-R-G-C(SEQ ID NO：8)

c-M-Pip-R-L-R-Sar-C(SEQ ID NO：9)

c-M-Thz-R-L-R-G-Pen(SEQ ID NO：10)

c-M-Pip-R-L-R-Sar-Pen(SEQ ID NO：11)

活化的神經(jīng)降壓素的設(shè)計

本發(fā)明的優(yōu)選的活化的神經(jīng)降壓素分子包含一個神經(jīng)降壓素多肽和一個激活物基團。然而，在可替選實施方式中，將幾個NT分子與一個激活物基團組合，或者反過來，可能是有利的。就此而言，本發(fā)明的特定化合物具有結(jié)構(gòu)式(NT)_l–連接物–AG或NT–連接物–(AG)_l，其中l(wèi)是2至5之間的整數(shù)，通常為2或3。

所述激活物基團優(yōu)選被共價連接到所述神經(jīng)降壓素分子。偶聯(lián)可以通過本身在本領(lǐng)域中公知的任何反應(yīng)或過程例如化學、生物化學或酶反應(yīng)來進行，或者當所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團只包含天然氨基酸時，通過遺傳工程來進行。

偶聯(lián)可以在所述激活物基團和神經(jīng)降壓素多肽的天然存在或引入有反應(yīng)性官能團例如-OH、-SH、-CO₂H、-NH₂、-SO₃H、-CN、-N3、-NCS、-馬來酰亞胺或琥珀酰亞胺酯或-PO₂H的任何位點處進行。因此，偶聯(lián)可以在N-端或C-端處和/或在側(cè)鏈攜帶的反應(yīng)性基團處做出。所述激活物基團可以通過共價鍵直接偶聯(lián)到所述神經(jīng)降壓素多肽?；蛘撸黾せ钗锘鶊F也可以利用連接物基團間接地偶聯(lián)。共價化學偶聯(lián)優(yōu)選地包括使用含有烷基、芳基或肽基團的雙功能或多功能試劑，通過酯類、醛類或烷基或芳基酸、酮類、酸酐、巰基或羥基、源自于溴化氰或氯化氰的基團、疊氮化物、腈類、馬來酰亞胺類、羰基二咪唑、琥珀酰亞胺酯或磺酰鹵。優(yōu)選的化學偶聯(lián)劑是磺基-EMCS(N-ε-馬來酰亞胺己?；?氧磺酰琥珀酰亞胺酯)，其可以被添加到例如所述神經(jīng)降壓素多肽，并隨后用于共價連接所述激活物基團。

適合的連接物的實例包括單、二、三或多氨基酸，包含例如Lys、Glu、Asp、聚Lys、二肽例如Gly-Lys或多氨基酸例如GGG或G₄S。其他連接物包括例如琥珀酸、Ahx(氨基己酸)或PEG(聚乙二醇)分子。

在優(yōu)選實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團使用選自PEG分子的連接物來偶聯(lián)。可以使用任何PEG分子，例如特別是PEG2(12-氨基-4,7,10-三氧雜十二烷酸)、PEG3、PEG4、PEG5或PEG6(21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧雜二十一烷酸)。更優(yōu)選地，所述連接物包含PEG2或PEG6分子，甚至更優(yōu)選地PEG6。

在另一個優(yōu)選實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團利用肽鍵直接偶聯(lián)。

在另一個優(yōu)選實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團使用柔性連接物來偶聯(lián)，所述柔性連接物選自聚G分子，更優(yōu)選為G氨基酸或GGG三肽或直鏈氨基己酸。

在另一個優(yōu)選實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團使用可切開的二硫鍵來偶聯(lián)。

在另一個優(yōu)選實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團使用異雙功能交聯(lián)劑、更優(yōu)選為磺基-EMCS試劑來偶聯(lián)。

本發(fā)明的最優(yōu)選的活化的神經(jīng)降壓素分子的名單提供在下面的表A中。

表A

生產(chǎn)本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素分子的詳細方法公開在實驗部分中。就此而言，本發(fā)明還涉及一種用于制備活化的神經(jīng)降壓素分子的方法，所述方法包括在如上所定義的神經(jīng)降壓素多肽與激活物基團之間進行共價(直接或間接)偶聯(lián)的步驟。所述方法可以包括另一個收集或純化所述活化的神經(jīng)降壓素的步驟，和/或另一個修飾所述活化的神經(jīng)降壓素的任選步驟，和/或另一個用可接受的賦形劑配制所述活化的神經(jīng)降壓素的任選步驟。

在特定實施方式中，首先分開地合成所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團，然后通過例如化學、酶或生物化學偶聯(lián)將它們共價連接。正如上文公開的，偶聯(lián)可以通過所述神經(jīng)降壓素和/或激活物基團中存在和/或插入的各種不同的反應(yīng)性官能團，并任選地使用適合的連接物來進行。

在另一個特定實施方式中，所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團被直接合成為單一分子。例如，所述活化的神經(jīng)降壓素分子可以作為獨一無二的分子實體在多肽合成儀上合成?；蛘?，所述活化的神經(jīng)降壓素分子可以通過基因融合和在重組宿主細胞中表達來生產(chǎn)。當兩種組分都包含天然氨基酸時，這種方法是可行的。

就此而言，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素的核酸分子，其中所述神經(jīng)降壓素多肽和激活物基團包含天然存在的氨基酸并通過氨基酸鍵或連接物偶聯(lián)。

本發(fā)明的另一個目的是包含這種核酸分子的克隆或表達載體(例如質(zhì)粒、噬菌體、病毒、粘粒等)，以及包含這種核酸或載體的重組宿主細胞。

本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素分子可以使用本身在本領(lǐng)域中已知的技術(shù)進行修飾，以進一步提高它們的活性或改進藥物動力學性質(zhì)。例如，可以將它們連接到聚合物(PEG、白蛋白)，或通過添加親脂性取代基或通過添加化學反應(yīng)性基團進行修飾。也可以將天然存在的氨基酸用肽模擬物或氨基酸類似物替換，和/或可以產(chǎn)生環(huán)狀多肽。

藥物組合物和方法

本發(fā)明還涉及包含如上所定義的活化的神經(jīng)降壓素分子和一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。

所述活化的神經(jīng)降壓素可以以任何可藥用鹽的形式使用。例如并且非限制性地，表述“可藥用鹽”是指可藥用堿或酸加成鹽、水合物、酯、溶劑化物、前體、代謝物或立體異構(gòu)體。

表述“可藥用鹽”優(yōu)選是指無毒性鹽，其通?？梢酝ㄟ^將游離堿與適合的有機或無機酸反應(yīng)來制備。這些鹽保留了游離堿的生物有效性和性能。這類鹽的代表性實例包括水溶性和水不溶性鹽，例如乙酸鹽、N-甲基葡糖胺銨鹽、安索酸鹽(amsonate)(4,4-二氨基二苯乙烯-2,2’-二磺酸鹽)、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、氫溴酸鹽、溴化物、丁酸鹽、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、鹽酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、克拉維酸鹽、二鹽酸鹽、二磷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二胺四乙酸鈣、乙二磺酸鹽、丙酸酯月桂硫酸酯(estolate)、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、谷氨酸鹽、羥乙?；北诫纤猁}(glycolylarsanylate)、六氟磷酸鹽、己基間苯二酚酸鹽、海巴明、羥基萘酸鹽、碘化物、異硫代硫酸鹽(isothionate)、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、3-羥基-2-萘甲酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽(1,1-亞甲基-雙-2-羥基-3-萘甲酸鹽或emboate)、泛酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、對甲苯磺酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、磺基水楊酸鹽、suramate、單寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(teoclate)、甲苯磺酸鹽、三乙基碘化物、三氟乙酸鹽和戊酸鹽。

本發(fā)明還涉及包含如上所定義的核酸、載體或宿主細胞和一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。

有利情況下，本發(fā)明的組合物包含的可藥用賦形劑可以選自在制藥工業(yè)中常用的賦形劑，例如稀釋劑、固體載體、穩(wěn)定劑、防腐劑、表面活性劑等。所述組合物可以配制成固體、半固體或液體形式。

液體組合物是優(yōu)選的。這種液體制劑、特別是可注射制劑，可以通過例如將活化的神經(jīng)降壓素分子溶解或分散在可藥用溶劑例如水、生理鹽水溶液、含水右旋糖、甘油、乙醇、油及其類似物中來制備。

對于固體組合物例如片劑、丸劑、粉劑或顆粒劑來說，可以將活性物質(zhì)與下述組分組合：a)稀釋劑，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纖維素和/或甘氨酸；b)潤滑劑，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸及其鎂鹽或鈣鹽和/或聚乙二醇；c)粘合劑，例如硅酸鎂和硅酸鋁、淀粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮；d)崩解劑，例如淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽或泡騰混合物；和/或d)吸收劑、染料、調(diào)味劑和甜味劑。賦形劑可以是例如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂和藥用級類似物。

對于半固體組合物例如栓劑來說，賦形劑可以是例如乳劑或油性懸劑，或者是基于聚亞烷基二醇例如聚丙二醇的。

適合在本發(fā)明中使用的其他賦形劑是在WO 2012/090070或US2012/0172454中所描述的化合物。

本發(fā)明還涉及藥劑盒，其包含含有如上所定義的組合物的容器和藥物遞送裝置或手冊。所述藥物遞送裝置優(yōu)選為注射器。

本發(fā)明的組合物可以通過任何適合的途徑給藥，例如但不限于通過腸胃外、口、直腸、表面或鼻內(nèi)途徑。

腸胃外給藥可以通過注射來進行，使用例如腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、眼內(nèi)或肌肉內(nèi)注射，任選地使用延長或延遲釋放或受控釋放?？诜o藥(或經(jīng)口)可以使用例如采取包衣或未包衣片劑、明膠膠囊、粉劑、球丸、懸劑或口服溶液形式的制劑來進行(一種這類用于口服給藥的形式可以使用立即釋放或使用延長、延遲釋放或受控釋放)。直腸途徑可以使用例如采取栓劑形式的制劑。其他途徑包括表面途徑，特別是通過透皮途徑，例如采取貼片、膏(pomade)或凝膠的形式；鼻內(nèi)途徑，例如采取氣溶膠和噴劑的形式；經(jīng)舌途徑；眼內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑。

所述藥物組合物通常包含有效劑量的本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素。本文中所描述的“治療有效劑量”是指對于給定病癥和給藥安排來說提供治療效果的劑量。它通常是被給藥以明顯獲得負責或有助于改善與疾病或病理狀態(tài)相關(guān)的某些癥狀的預(yù)期生物效果的活性物質(zhì)的平均劑量。例如，在治療CNS的病變或障礙中，減輕、阻止、延遲、消除或停止所述疾病或障礙的病因或癥狀之一的劑量將是治療有效的?；钚晕镔|(zhì)的“治療有效劑量”不必定治愈疾病或障礙，但是將為該疾病或障礙提供治療，以使它的出現(xiàn)被延遲、阻礙或阻止，或者它的癥狀被弱化，或者它的期限被改變或例如嚴重性降低，或者患者的恢復被加速。

應(yīng)該理解，對于具體的個人來說，“治療有效劑量”取決于各種不同因素，包括活性物質(zhì)的活性/有效性、它的給藥時間、它的給藥途徑、它的消除速率和它的代謝和在防止或治愈的基礎(chǔ)上待治療的疾病(或障礙)的嚴重性，以及患者的年齡、體重、總體健康、性別和/或飲食。因此，所述有效劑量可以由專業(yè)技術(shù)人員調(diào)整。然而，一般來說，所述有效劑量(以相對于神經(jīng)降壓素的摩爾當量表示)在0.001至10mg/kg之間，更優(yōu)選地在0.002至5mg/kg之間。在優(yōu)選的范圍內(nèi)，所述有效劑量在0.01至2mg/kg之間。這種劑量范圍特別適合于腸胃外注射，特別是適合于靜脈內(nèi)注射(團注)。

本發(fā)明的分子和組合物可用于在哺乳動物中誘導藥理學低體溫，并用于治療可以從低體溫獲益的任何疾病或病癥。

本發(fā)明特別適合于治療與整體、局灶性和新生兒CNS缺血、CNS創(chuàng)傷、心臟手術(shù)、疼痛和過高體溫相關(guān)的CNS障礙。更具體來說，本發(fā)明適合于防止或減輕或最小化由心臟驟停、中風、新生兒缺血、癲癇發(fā)作、嚴重創(chuàng)傷性頭部和脊髓損傷、心臟手術(shù)在對象的CNS中引起的興奮性毒性神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥，適合于降低與ICH、膿毒癥或伴有發(fā)熱的任何病毒、細菌或寄生蟲感染相關(guān)的過高體溫，并且適合于減輕疼痛。

本發(fā)明的一個目的涉及使用如上所定義的化合物或組合物在哺乳動物對象中誘導低體溫和/或治療具有腦損傷的對象。

本發(fā)明的另一個目的涉及一種在哺乳動物對象中誘導低體溫的方法，所述方法包括向所述對象系統(tǒng)性給藥如上所定義的化合物或組合物。

本發(fā)明的另一方面涉及一種在哺乳動物對象中降低體溫的方法，所述方法包括向所述對象系統(tǒng)性給藥如上所定義的化合物或組合物。

本發(fā)明的另一個目的是一種治療具有腦損傷的對象的方法，所述方法包括向所述對象系統(tǒng)性給藥如上所定義的化合物或組合物。

本發(fā)明的另一個目的是一種在對象中減輕疼痛的方法，所述方法包括向所述對象系統(tǒng)性給藥如上所定義的化合物或組合物。

本發(fā)明的另一個目的是一種在對象中減輕癲癇發(fā)作的方法，所述方法包括向所述對象系統(tǒng)性給藥如上所定義的化合物或組合物。

本發(fā)明可用于在任何哺乳動物對象例如人類患者中治療(例如保護、防止或減輕)腦損傷的影響。它特別適用于治療心臟驟停后、具有中風、新生兒缺血、癲癇發(fā)作、嚴重創(chuàng)傷性頭部和脊髓損傷后、心臟手術(shù)期間的對象，以降低與ICH、膿毒癥或伴有發(fā)熱的任何病毒、細菌或寄生蟲感染相關(guān)的過高體溫，以減輕疼痛。

術(shù)語“治療”和其他類似的表述是指實現(xiàn)藥理和/或生理效果，例如體溫的降低和對患者狀況的任何間接的有益效果。所述效果可以是預(yù)防性或防止性的，以便完全或部分防止疾病或癥狀在患病個體中的惡化或它在健康對象中的傳播，和/或可以是治療性的，以便完全或部分治療疾病和/或其相關(guān)的有害效應(yīng)。當在本文件中使用時，術(shù)語“治療”覆蓋了哺乳動物中、更特別為人類對象中疾病的任何治療，并且包括：(a)在對該病理或障礙易感但尚未被陽性診斷的人中能夠發(fā)生的疾病或病癥的防止；(b)疾病的減緩(例如通過終止它的發(fā)展)；或(c)疾病的緩解(例如通過減輕與疾病相關(guān)的癥狀)。術(shù)語“治療”還涵蓋活性物質(zhì)的任何給藥，以便在個體或患者中照管、治愈、緩解、改善、減輕或抑制病癥。

本發(fā)明還涉及一種降低對象體溫的方法，所述方法包括向需要的對象以足以降低所述對象的體溫的量給藥如上所定義的化合物或組合物。所述對象可能正患有或可能最近患過例如心臟驟停、中風、新生兒缺血、腦或脊髓損傷、癲癇發(fā)作、過高體溫，可能正經(jīng)歷心臟手術(shù)，并且可能需要神經(jīng)保護。

在考察了下面的實施例后，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點將變得顯而易見，所述實施例在本質(zhì)上僅僅是說明性的，并且不限制本申請的范圍。

實施例

實施例1

通過NT-Lys6合成活化的NT(1-13)-AG藥物

在第一步中，將全尺寸的神經(jīng)降壓素pELYENKPRRPYIL-OH(NT)偶聯(lián)到本發(fā)明人開發(fā)的各種不同激活物基團(AG)。目的是選擇最佳的AG/NT組合。為了合成這些分子，我們利用了神經(jīng)降壓素序列中6位賴氨酸側(cè)鏈的胺反應(yīng)性。將商品化磺基-EMCS(N-ε-馬來酰亞胺己酰基-氧磺酰琥珀酰亞胺酯)通過它的琥珀酰亞胺酯組成部分偶聯(lián)到6位賴氨酸上。在純化后，將官能化的神經(jīng)降壓素(NT-EMCS)偶聯(lián)到不同的硫醇化AG。

因此，進行了三個步驟以獲得最終的所需偶聯(lián)物：兩種官能化組成部分NT-EMCS和硫醇化AG的合成，以及它們的偶聯(lián)。這些步驟示意顯示如下：

分析和純化方法：

·反應(yīng)進程和純度監(jiān)測在裝備有C18Kinetex^TM(5μm，150mm x 4.6mm)的Dionex3000系統(tǒng)上進行。檢測在214nm處完成。洗脫系統(tǒng)由H₂O/0.1％TFA(溶液A)和MeCN/0.1％TFA(溶液B)構(gòu)成。流速為2mL/min，梯度為4min內(nèi)0-100％B。

·粗產(chǎn)物在裝備有C18Luna^TM(5μm，100mm x 21.2mm)的Dionex3000系統(tǒng)上，通過RP-HPLC進行純化。檢測在214nm處完成。洗脫系統(tǒng)由H₂O/0.1％TFA(溶液A)和MeCN/0.1％TFA(溶液B)構(gòu)成。流速為20mL/min。

1.NT-EMCS合成：

全尺寸NT購自Biochem AG，而磺基-EMCS(N-ε-馬來酰亞胺己?；?氧磺酰琥珀酰亞胺酯)購自Thermo Scientific(Pierce Biotechnology)。

如下所述制備官能化的NT-EMCS：向NT溶液(25mg，15μmol，1eq.，在1.25mL PBS 4X pH＝7.4中)添加磺基-EMCS溶液(9.2mg，15μmol，1eq.，在1mL PBS 4X pH＝7.4中)。允許反應(yīng)混合物在室溫下攪拌。反應(yīng)的監(jiān)測通過分析型RP-HPLC進行。在攪拌過夜后，將粗混合物通過制備型RP-HPLC進行純化，使用30min內(nèi)21-30％B的梯度。收集純度超過95％的級分并冷凍干燥，以給出純的白色粉末(m＝21mg，得率＝75％，純度>95％)。質(zhì)量通過MALDI-TOF MS分析來確認：m/z[M+H]⁺，計算值為1865.98，實測值為1865.97。

2.硫醇化的AG的合成

為了將AG偶聯(lián)到官能化的NT的馬來酰亞胺組成部分，在每個候選AG上引入硫醇反應(yīng)性基團。

肽Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH的合成：

肽Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH通過固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成儀上，使用Fmoc/tBu策略和購自Iris Biotech的Fmoc-Gly-Wang樹脂(100-200目，1％DVB，載樣量0.7mmol/g)來合成。這種樹脂允許合成在其側(cè)鏈和C-端末端上完全去保護的肽。

選擇具有標準的正交側(cè)鏈保護的N-α-Fmoc保護的氨基酸：Fmoc-Cys(Trt)-OH(采取D或L構(gòu)型)，F(xiàn)moc-Pen(Trt)-OH(采取D或L構(gòu)型)，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pip-OH，F(xiàn)moc-Thz-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH和Fmoc-Sar-OH。它們以及哌啶、三氟乙酸(TFA)、二異丙基乙胺(DIEA)、乙二硫醇(EDT)、三異丙基甲硅烷(TIS)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-β]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HATU)都購自Iris Biotech。二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)和丙酸酐(Pr₂O)購自Sigma-Aldrich。

在0.25mmol規(guī)模的合成中使用aa/DIEA/HBTU:4/4/8當量(相對于樹脂來說)并且在0.1mmol規(guī)模的合成中使用aa/DIEA/HBTU:5/5/10當量(相對于樹脂來說)，通過第n+1個氨基酸的酸官能團的微波活化對氨基酸進行偶聯(lián)。偶聯(lián)時間被調(diào)整到10min。在aa1引入后，甲硫氨酸和半胱氨酸的摻入需要雙倍偶聯(lián)。由此偶聯(lián)的新氨基酸的Fmoc基團的去保護，使用DMF中的20％哌啶來進行。使用DCM中的50％丙酸酐或乙酸酐將肽延長期間偶聯(lián)的最后一個氨基酸丙酰化或乙?；?。N-端封端的目的是使合成的新肽穩(wěn)定，但是也例如在C-端位置中的共價偶聯(lián)期間降低二次反應(yīng)的風險。為了保持N-端化學結(jié)構(gòu)類似于某些放射性標記的肽的結(jié)構(gòu)，所述放射性標記的肽有時使用氚化的丙?；牾啺孵ピ贜-端氨基酸上標記，選擇丙?；皇且阴；M成部分。然后使用由TFA/TIS/H2O/EDT：94/2/2/2構(gòu)成的溶液在室溫(RT)下對樹脂結(jié)合的肽進行切割至少2小時。每克樹脂使用至少15mL的切割溶液。然后使用冰冷的乙醚將粗品肽沉淀，以3000rpm離心8min，并在H₂O/0.1％TFA中冷凍干燥。獲得白色固體并且不用進一步純化將其用于下一步驟中。

肽Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH的環(huán)化：

二硫橋通過采取L或D構(gòu)型的兩個被適合地保護的Cys或Pen的兩個硫醇官能團的分子內(nèi)環(huán)化來獲得。

AcOH、K₃[Fe(CN)₆]和碳酸銨購自Sigma-Aldrich。

將粗品Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH肽溶解在AcOH 0.5％中以得到0.5mg/mL的終濃度。向所述肽溶液添加碳酸銨(2N)以達到8-9的接近堿性的pH。然后向反應(yīng)混合物添加K₃[Fe(CN)₆](0.01N)，直至觀察到明亮且持久的黃色。反應(yīng)的監(jiān)測通過分析型RP-HPLC進行。通常在不到30min內(nèi)反應(yīng)是定量的。將反應(yīng)混合物在0.45μm膜上過濾并通過制備型RP-HPLC進行純化。收集純度高于95％的級分并冷凍干燥，以給出純的白色粉末(最終純度>95％)。詳細的梯度、得率和質(zhì)量分析在下面給出。

環(huán)化的Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH肽上半胱胺的偶聯(lián)：

2-三苯甲硫基-1-乙胺鹽酸鹽(Trt-半胱胺)購自Iris Biotech，而其他反應(yīng)物的購買已在上文描述。

制備Trt-半胱胺(2eq.)、DIEA(4eq.)和含有游離C-端的環(huán)化的肽(1eq.)在無水DMF中的溶液(對于肽來說0.05M)。最后向混合物添加PyBop(1.1eq，在無水DMF中0.13M)。幾乎立即達到反應(yīng)完成，因為在2min后的HPLC監(jiān)測顯示起始肽完全消失。在真空下蒸發(fā)掉DMF，得到淺黃色油狀物。為了除去三苯甲基硫醇保護，加入DCM/TIS/TFA：3/1/1溶液(約0.5mL/mg起始肽)。允許反應(yīng)混合物在RT下攪拌。反應(yīng)的監(jiān)測通過分析型RP-HPLC進行。然后使用惰性氣體鼓泡蒸發(fā)掉DCM和TFA，并且Et₂O使得粗品肽沉淀。在以3000rpm離心8min后，將粗品肽在H₂O/0.1％TFA中冷凍干燥并通過制備型RP-HPLC進行純化。收集純度高于95％的級分并冷凍干燥，給出純的白色粉末(最終純度>95％)。詳細的梯度、得率和質(zhì)量分析在下面給出。

3.通過NT-EMCS與硫醇化AG的偶聯(lián)合成NT(1-13)-AG：

將含有硫醇反應(yīng)性基團的AG溶解在PBS 1X中(1eq.，0.003M，pH 7.4)并添加到NT-EMCS(1eq)。允許反應(yīng)混合物在RT下攪拌。通常，超聲波有助于NT-EMCS的溶解。反應(yīng)的監(jiān)測通過分析型RP-HPLC進行。在反應(yīng)完成后，將粗產(chǎn)物通過制備型RP-HPLC進行純化。收集純度高于95％的級分并冷凍干燥，給出純的白色粉末(最終純度>95％)。詳細的梯度、得率和質(zhì)量分析在下面給出。

實施例2

本發(fā)明的活化的NT藥物的體外結(jié)合親和性

神經(jīng)降壓素的中樞低體溫效應(yīng)通過NTR-1受體的活化來介導。為了引發(fā)生物活性例如低體溫活性，神經(jīng)降壓素偶聯(lián)物應(yīng)該以至少與天然神經(jīng)降壓素、即NT(1-13)相近的親和性結(jié)合NTR-1。

神經(jīng)降壓素偶聯(lián)物的結(jié)合親和性使用競爭性結(jié)合測定法，利用人類和大鼠1型神經(jīng)降壓素受體(hNTR-1、rNTR-1)兩者來評估。富含hNTR-1的細胞膜購自Perkin Elmer。大鼠NTR-1通過用大鼠NTSR1質(zhì)粒構(gòu)建物(Origene,Rockville,USA)轉(zhuǎn)染HEK 293細胞來獲得。

活化的NT藥物對hNTR-1的結(jié)合親和性按照制造商的說明書(Perkin Elmer)來進行，并作出了輕微修改。詳細來說，使用終濃度為0.5μg/孔的從穩(wěn)定表達人類NTR-1的CHO細胞制備的膜勻漿物和濃度為3nM的放射性標記配體[³H]-神經(jīng)降壓素(比活性為99.8Ci.mmol^-1；Perkin-Elmer)，測量NTR-1結(jié)合。放射性標記配體的特異性結(jié)合被確定為K_D值為0.81nM和B_max為34pmol每mg膜蛋白。非特異性結(jié)合在5μM神經(jīng)降壓素存在下測定。

對于使用大鼠1型神經(jīng)降壓素受體(rNTR1)的測定法來說，我們使用終濃度為0.75μg/孔的來自于表達rNTR-1的HEK 293細胞的膜勻漿物。放射性標記配體在這些勻漿物上的特異性結(jié)合被確定為K_D值為0.93nM和B_max為2.5pmol每mg膜蛋白。

每個測定在96孔板中，在100μL總反應(yīng)體積中，在結(jié)合緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7.4，0.1％BSA)中進行。隨后將所述測定體系在室溫下溫育24h。將每個孔的內(nèi)含物使用MicroBeta FilterMate-96收獲器(Perkin-Elmer)通過(Perkin-Elmer，用25μL 0.5％聚乙烯亞胺預(yù)先浸漬)快速過濾，然后將每個孔用清洗緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.2)漂洗5次。通過添加25μL MicroScint^TM-O(Perkin)測量每個干燥濾器的放射活性(cpm)，并使用TopCount NXT^TM微孔板閃爍和發(fā)光計數(shù)器(Perkin-Elmer)定量。特異性結(jié)合通常為總結(jié)合的90％或更高。使用KaleidaGraph進行劑量響應(yīng)曲線作圖，以確定IC50值。測定進行一式兩份。使用Cheng-Prusoff轉(zhuǎn)換從IC50平均值確定Ki值。

ND：未測定

這些結(jié)果顯示，本發(fā)明的活化的分子保留了在納摩爾或甚至更低的范圍內(nèi)的對NTR-1的非常高的親和性。事實上，在大多數(shù)情況下，AG顯著提高不同NT藥物對NTR-1的親和性。這種結(jié)果是引人注目和出人意料的，因為更可能預(yù)期偶聯(lián)將負面干擾受體結(jié)合。

實施例3

本發(fā)明的活化的NT藥物的體內(nèi)評估

通過在Swiss(CD-1)小鼠中監(jiān)測低體溫響應(yīng)，調(diào)查了本發(fā)明的活化的NT藥物對神經(jīng)降壓素的中樞藥理學活性的有益效果(圖1)。在以8mg/kg劑量靜脈內(nèi)給藥(團注)NT后，小鼠顯示出直腸體溫的少量但明顯的降低，最大效果為注射后15min時距基線-1℃。在24mg/kg劑量下這種效果增加，達到注射后30min時-2.6℃的最大效果。相反，化合物I、即本發(fā)明的包含SEQ ID NO：8作為激活物基團的活化的NT藥物以8mg/kg的摩爾當量劑量(8mg/kg eq.NT)的靜脈內(nèi)給藥誘導快速和更強的體溫降低，在注射后15min時顯著，并且在注射后30至60min之間達到-3.7℃的最大效果。隨后這種藥理學低體溫逐漸減小，直至在注射后3小時返回到基線溫度。在實驗期間，在這些小鼠中沒有觀察到顫抖。

較低劑量水平的化合物I的評估顯示出劑量依賴性低體溫效應(yīng)，其中最低有效劑量(MED)為0.5mg/kg eq.NT，ED₅₀為1.21mg/kg eq.NT，在4mg/kg eq.NT下觀察到約-4℃的最大效果，在8mg/kg eq.NT下沒有更強的效果(圖2)。使用較高劑量水平時達到最大效果的時間增加，從較低劑量水平下的注射后15min到較高劑量水平下的注射后30-60min。當與表現(xiàn)出8mg/kg的MED的單獨的NT相比時，這種活化的NT藥物顯示出中樞低體溫效應(yīng)的16倍的增加.

然后試驗了本發(fā)明的可替選的活化基團(AG)。當在0.5mg/kg eq.NT的相同劑量水平下與化合物I相比時，包含例如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11作為激活物基團的活化的NT藥物，即化合物II(NT-SEQ ID NO：9)和化合物IV(NT-SEQ ID NO：11)，在小鼠中誘導了甚至更大的低體溫響應(yīng)，最大效果分別為在注射后30min時的-4.1℃和-3.4℃(圖3)。選擇化合物II用于進一步研究。

化合物II的劑量響應(yīng)關(guān)系的評估證實了0.1mg/kg eq.NT的MED，其比單獨的NT低80倍，并且ED₅₀為1.25mg/kg eq.NT(圖4)。在高劑量水平下，化合物II誘導甚至更強的低體溫，在10mg/kg eq.NT下在注射后60min時達到-7℃的最大效果。在這種高劑量水平下，小鼠顯示出減少的自主活動，其在時間上與低體溫效應(yīng)平行，但是保留了對不同種類刺激的充分響應(yīng)性。同樣地，甚至在表現(xiàn)出30℃左右的體溫的小鼠中，也沒有觀察到顫抖。

實施例4

本發(fā)明的活化的NT藥物的BBB運輸

我們評估了本發(fā)明的活化的神經(jīng)降壓素藥物的BBB透過性和體外血液穩(wěn)定性。

本發(fā)明的偶聯(lián)物在BBB和血視網(wǎng)膜屏障(BRB)處的運輸動力學，在成年雄性C57Bl/6小鼠中使用原位腦灌注技術(shù)來評估。通過將[3H]Tyr3-NT與AG偶聯(lián)或通過將氚化的AG偶聯(lián)到NT分子，獲得放射性標記的活化的NT化合物。NT通過使用氚氣對碘代Tyr3-NT進行催化脫鹵來放射性標記，而AG通過將氚化的丙?；牾啺孵ヅ悸?lián)到其N-端進行放射性標記。比放射活性(SRA)通常在50Ci/mmol的范圍內(nèi)。為每次合成準備的放射活性的總量一般在100至1000μCi之間。

原位腦灌注技術(shù)能夠?qū)θ嗽旃嘧⒁旱慕M成進行全面控制，以便將腦的細胞和血管化維持在動物內(nèi)的正常生理和解剖條件下，而沒有破壞系統(tǒng)性分布的因素。原位腦灌注最初在大鼠中開發(fā)，并由Dagenais等人改編以適應(yīng)于小鼠(Dagenais等，2000,J Cereb Blood Flow Metab.,20(2),381-6)。這允許在目標受體、酶或不同類型的內(nèi)流或外流轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)基因和KO突變小鼠中，評估化合物跨過BBB和BRB的運輸動力學。

放射性標記的本發(fā)明的化合物的原位腦灌注在120s期間，使用2mL/min的灌注液流速來進行。初始運輸被表示成轉(zhuǎn)移系數(shù)K_in(對血管體積校正過的試驗化合物的分布體積與腦灌注時間之間的關(guān)系)。放射性標記的蔗糖這種正常情況下不跨過BBB的化合物的共同灌注，也允許評估BBB的物理完整性以及因此試驗化合物的急性毒性的不存在。

與文獻中發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)相一致，NT在腦中顯示出非常低的初始運輸，K_in值為～0.4x 10^-4mL/s/g腦組織。NT在眼中的運輸甚至更低(圖5，白色條)。重要的是，使用放射性標記的本發(fā)明的活化的NT藥物獲得的結(jié)果一致地顯示出在腦和眼中明顯更高的運輸動力學，證實了用本發(fā)明的激活物基團活化NT特異性地增強它在這些否則不可透過的器官中的運輸。具體來說，化合物XIV在腦中顯示出～3.65x 10^-4mL/s/g的K_in值，其與游離NT相比提高9倍，在眼中的K_in值為～32.0x 10^-4mL/s/g(圖5，黑灰色條)。此外，化合物I不改變BBB的完整性，因為蔗糖的腦分布體積與對照值相近。

實施例5

本發(fā)明的活化的NT藥物的體外穩(wěn)定性

評估本發(fā)明的藥物的體外血液穩(wěn)定性(半衰期或t_1/2)并與單獨的NT進行比較。簡單來說，將每種肽在2μM的標稱濃度下，在新鮮收集的Swiss(CD-1)小鼠血液中在37℃下溫育最多3小時。在幾個時間點使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)(LC-MS/MS)分析方法定量血漿級分中的被分析物。體外半衰期(t_1/2)從每個動力學曲線(一級反應(yīng)動力學：C(t)＝C₀.e^-kt)的對數(shù)回歸估算并由t_1/2＝ln2/k給出。

結(jié)果驗證了天然NT對血漿降解的非常低的抗性，體外半衰期僅為7min(圖6)。這與內(nèi)源肽和一般而言，僅含有天然氨基酸的小的線性肽的快速酶促蛋白水解相一致(Foltz等，2010,J Nutr.,Jan；140(1):117-8)。形成鮮明對比的是，本發(fā)明的所有活化的NT藥物在小鼠血液中顯示出極大增加的t_1/2，通常超過1小時。

BBB運輸動力學、在血液中的體外穩(wěn)定性和提高的中樞低體溫效果，合在一起證實了本發(fā)明的活化的NT藥物的引人注目和出人意料的有益效果。

實施例6

基于NT(x-13)的活化的神經(jīng)降壓素分子的合成

實施例1-5顯示了SEQ ID NO：9在活化全尺寸NT中特別有效。在本實施例和下面的實施例中，試驗了SEQ ID NO：9在NT片段的基礎(chǔ)上產(chǎn)生強效的活化的神經(jīng)降壓素分子的能力。

在文獻中報道了某些截短的神經(jīng)降壓素類似物與全長內(nèi)源神經(jīng)肽同樣強效，特別是當對應(yīng)于8-13位氨基酸的最小序列存在時。在此基礎(chǔ)上，使用尺寸減小的NT類似物制備了新的活化的NT藥物，其目的是產(chǎn)生更強效的藥物，同時最小化生產(chǎn)成本，并允許串聯(lián)偶聯(lián)在NT的N-端部分上。

偶聯(lián)物使用與用于包含全尺寸神經(jīng)降壓素的偶聯(lián)物(參見實施例1)相同的偶聯(lián)方法來合成，焦點在于三個神經(jīng)降壓素片段：NT(2-13)，其中只有焦谷氨酸丟失；NT(6-13)和Lys-NT(8-13)，其包含最小活性序列并且還至少含有6位賴氨酸，用于偶聯(lián)到AG。分析和純化方法如實施例1中所述來進行。

1.NT(x-13)肽合成：

截短的神經(jīng)降壓素類似物通過固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成儀上，使用Fmoc/tBu策略來合成。氨基酸偶聯(lián)從人工預(yù)裝載的Fmoc-Leu-Wang樹脂(100-200目，1％DVB)進行。這種樹脂允許合成在其側(cè)鏈和C-端末端上完全去保護的肽。

Wang樹脂(載量0.2mmol/g)購自Iris Biotech。其他原材料已經(jīng)在前面描述。

為了樹脂預(yù)裝載，向樹脂添加Fmoc-Leu-OH/HOBt/DIC(6eq./6eq./6eq.)在DMF中的溶液(相對于aa來說0.055M)。然后添加DMAP(1eq.)。在過夜機械攪拌后，洗滌所述樹脂并評估它的載量。通常載量在0.1至0.16mmol/g之間。

肽延長按照已經(jīng)描述過的來進行。使用DCM中的50％乙酸酐將肽的N-端乙酰化，以模擬在內(nèi)源肽中存在的肽鍵并提高代謝穩(wěn)定性。使用與前述相同的程序切下樹脂結(jié)合的肽，并通過RP-HPLC進行純化。收集純度高于95％的級分并冷凍干燥，以提供純的白色粉末(最終純度>95％)。詳細的梯度、得率和質(zhì)量分析在下面給出。

ND：未測定

2.NT(x-13)-EMCS合成

NT(x-13)官能化使用與實施例1中描述的用于全尺寸NT的相同的程序來進行。肽被產(chǎn)生為純的白色粉末，純度為至少95％。詳細的梯度、得率和質(zhì)量分析在下面給出。

3.硫醇化的SEQ ID NO：9的合成：

硫醇化的SEQ ID NO：9如實施例1中所述來合成。

4.偶聯(lián)物NT(x-13)-SEQ ID NO：9的合成：

NT(x-13)-EMCS與SEQ ID NO：9的偶聯(lián)程序與實施例1中詳細描述的用于NT(1-13)-AG合成的程序相同。偶聯(lián)物被產(chǎn)生為純的白色粉末，純度為至少95％。詳細的梯度、得率和質(zhì)量分析在下面給出。

實施例7

本發(fā)明的活化的NT(x-13)藥物的低體溫響應(yīng)

活化的藥物的低體溫響應(yīng)通過將每種偶聯(lián)物以0.5mg/kg eq.NT的相同劑量水平在Swiss(CD-1)小鼠中靜脈內(nèi)注射(團注)來評估。

所有截短的基于NT的藥物在小鼠中誘導類似程度的低體溫，體溫的最大降低為注射后30min時的約-2.5℃(圖7)。這些結(jié)果顯示，在本發(fā)明的活化的藥物的情形中，最短的C-端NT(8-13)片段足以引發(fā)強效生物活性。

實施例8

使用二硫橋合成活化的NT藥物偶聯(lián)物

在實施例1和4中描述的本發(fā)明的活化的NT藥物偶聯(lián)物，使用EMCS連接物和NT序列中天然存在或引入的賴氨酸殘基來合成。在評估新的連接策略的嘗試中，將NT(8-13)和SEQ ID NO：9通過二硫橋偶聯(lián)。這種可切開的連接物在系統(tǒng)循環(huán)中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，同時它可以在某些細胞內(nèi)區(qū)室、特別是BBB的內(nèi)皮細胞中的細胞內(nèi)區(qū)室的還原環(huán)境中切開，潛在地引起完整活性的NT(8-13)在腦實質(zhì)中的釋放。此外，改變連接物產(chǎn)生具有不同的和潛在有益的PK、處置和代謝性質(zhì)的新藥物。

二硫橋從天然存在或引入到待偶聯(lián)的兩個組成部分上的兩個硫醇基團制成。在本發(fā)明的情形中，所述待偶聯(lián)的兩個組成部分不存在游離的半胱氨酸，因此將兩個硫醇官能團化學引入到AG和NT上。為此目的，將受到硫醇活化的Npys保護的半胱氨酸殘基引入到NT(8-13)的N-端處。Npys衍生的Cys對游離硫醇具有特異性反應(yīng)性，因此有利于異二硫橋的形成。硫醇化的SEQ ID NO：9通過以與用于偶聯(lián)到NT-EMCS的相同的方式用半胱胺進行C-端官能化來產(chǎn)生。兩個組成部分被獨立地產(chǎn)生，然后在最后一步中彼此偶聯(lián)。偶聯(lián)步驟示意顯示如下：

分析和純化方法如實施例1中所述。

1.肽C(Npys)-NT(8-13)的合成

Boc-Cys(Npys)-OH和DIC(二異丙基碳二亞胺)購自Iris Biotech。

H-NT(8-13)如實施例6中所述來制備，區(qū)別在于N-端不封端。將Boc-Cys(Npys)-OH(5eq.)和DIC(5eq.)在無水DMF中的溶液(0.33M)在RT下預(yù)先活化10min，然后添加到樹脂。在過夜機械攪拌后，將樹脂用DMF和DCM清洗，使用與前面實施例中描述的相同的程序?qū)渲Y(jié)合的肽進行切開并處理。使用30min內(nèi)17-26％B的梯度純化粗品肽，產(chǎn)生純的淺黃色粉末(m＝25.9mg，得率＝24％，純度>95％)。質(zhì)量通過MALDI-TOF MS分析來驗證：m/z[M+H]⁺，計算值為1074.49，實測值為1074.47。由于在分析期間Npys保護在MALDI-TOF中被切下，因此也觀察到?jīng)]有所述基團的產(chǎn)物：[M-Npys+H+H]⁺，計算值為920.51，實測值為920.475。

2.硫醇化的SEQ ID NO：9的合成

硫醇化的SEQ ID NO：9如實施例1中所公開的來產(chǎn)生。

3.活化的NT偶聯(lián)物NT(8-13)-SS-SEQ ID NO：9(化合物VIII)的合成

將C(Npys)-NT(8-13)(1.3eq.)在惰性氣氛下溶解在脫氣的10％乙酸溶液中(0.02M)。將硫醇化的SEQ ID NO：9(1eq.)在惰性氣氛下溶解在脫氣的10％乙酸溶液中(0.015M)并立即添加到所述C(Npys)-NT(8-13)溶液。允許反應(yīng)混合物在惰性氣氛下在RT下攪拌。反應(yīng)的監(jiān)測通過分析型RP-HPLC來進行。在攪拌48小時后，再次向反應(yīng)混合物添加C(Npys)-NT(8-13)(0.45eq.)。在反應(yīng)完成后，通過制備型RP-HPLC，使用30min內(nèi)17-27％B的梯度進行粗品混合物的純化。獲得純的白色粉末(m＝7.8mg，得率＝52％，純度>95％)。質(zhì)量通過MALDI-TOF MS分析來驗證：m/z[M+H]⁺，計算值為2050.00，實測值為2051.08。

實施例9

活化的藥物偶聯(lián)物NT(8-13)-SS-SEQ ID NO：9的低體溫響應(yīng)

NT(8-13)-SS-SEQ ID NO：9(化合物VIII)的低體溫響應(yīng)通過以10mg/kg eq.NT的劑量水平在Swiss(CD-1)小鼠中靜脈內(nèi)注射(團注)來評估，并與使用半胱胺-EMCS連接物獲得的藥物、即化合物II的響應(yīng)進行比較。

化合物VIII在小鼠中誘導強烈低體溫，其程度類似于化合物II。兩種化合物在注射后45min和1hr時分別誘導-5.8℃和-6.7℃的最大體溫降低(圖8)。因此，NT(8-13)的使用二硫化物連接物的偶聯(lián)似乎是足以活化NT并在同時推測可能允許NT在還原環(huán)境例如腦毛細血管內(nèi)皮細胞中釋放的策略。

實施例10

串聯(lián)的AG-NT活化藥物的合成

在前面實施例中公開的活化的NT藥物通過NT和AG組成部分的獨立制備和官能化以及它們隨后的偶聯(lián)來合成。在本實施例中，使用串聯(lián)合成和SPPA相容性間隔物生產(chǎn)了新的一系列活化的NT藥物?；蛘?，利用肽鍵將NT和AG組成部分直接偶聯(lián)。這些藥物的合成可以使用僅僅兩個步驟串聯(lián)進行：支持物上的肽延長和AG二硫鍵形成。使用這種策略，制備了基于最優(yōu)選的NT(8-13)片段及其類似物的活化的NT藥物，總體得率高達35％。此外，串聯(lián)合成允許使用許多連接物作為AG組成部分與NT多肽之間的間隔物。重要的是，NT多肽被引入到偶聯(lián)物的C-端處，因為游離的羧基端對于結(jié)合到NT受體來說是必需的。這些共同的連接物中包括基于氨基酸的連接物例如三聚甘氨酸。氨基己酸也被選中。這種非天然氨基酸是常見的疏水連接物，被用于增加肽與另一個組成部分之間的距離。最后，還評估了兩種PEG間隔物，以使偶聯(lián)物更加親水并因此水溶性和生物耐受性更高。試驗了兩種PEG分子以評估AG與NT多肽之間的距離對其生物活性的影響。引入到藥物偶聯(lián)物中的所有連接物/間隔物為所述藥物提供了柔性，這對于靶-受體通過NT多肽的最適識別來說是重要的。分析和純化方法如實施例1中所述來進行。

1.SEQ ID NO：9-NT(8-13)、SEQ ID NO：9-GGG-NT(6-13)、SEQ ID NO：9-Ahx-NT(6-13)和SEQ ID NO：9-Ahx-NT(8-13)的合成

化合物IX(SEQ ID NO：9-NT(8-13))、化合物X(SEQ ID NO：9-GGG-NT(6-13))、化合物XI(SEQ ID NO：9-Ahx-NT(6-13))和化合物XII(SEQ ID NO：9-Ahx-NT(8-13))通過固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成儀上，使用Fmoc/tBu策略和如上所述手動預(yù)先裝載的Fmoc-Leu-Wang樹脂(100-200目，1％DVB，載量0.09mmol/g)來合成。

Fmoc-Ahx-OH購自Iris Biotech。其他原材料已在上文描述。

肽延長、切割和處理使用與前面實施例中所描述的相同的程序來進行。對于D-Cys、Met和NT-Arg9氨基酸來說，進行雙重偶聯(lián)。使用DCM中的50％丙酸酐將肽的N-端丙?；４制冯腟EQ ID NO：9-GGG-NT(6-13)通過制備型RP-HPLC進行純化，使用30min中15-25％B的梯度。不含間隔物(只有肽鍵)或包含Ahx間隔物的粗品肽不需進一步純化直接用于下一個環(huán)化步驟中。

二硫橋使用與實施例1中詳細描述的相同的方案，通過來自于AG中包含的兩個半胱氨酸(1和8位)的分子內(nèi)環(huán)化來獲得。純的藥物作為白色粉末獲得(最終純度>95％)。詳細的梯度、得率和質(zhì)量分析在下面給出。

2.SEQ ID NO：9-PEG2-NT(8-13)和SEQ ID NO：9-PEG6-NT(8-13)的合成

化合物XIII(SEQ ID NO：9-PEG2-NT(8-13))和化合物XIV(SEQ ID NO：9-PEG6-NT(8-13))通過固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成儀上合成，區(qū)別在于人工引入PEG間隔物。使用Fmoc/tBu策略和如上所述手動預(yù)先裝載的Fmoc-Leu-Wang樹脂(100-200目，1％DVB，載量0.09mmol/g)。

Fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧雜十二烷酸(Fmoc-PEG2-OH)和Fmoc--21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧雜二十一烷酸(Fmoc-PEG6-OH)購自PoluPeptide Laboratories。其他原材料已在上文描述。

在PEG引入之前及其手動引入之后，如前所述使用微波Liberty^TM合成儀進行肽延長。對于D-Cys、Met和NT-Arg9氨基酸來說，進行雙重偶聯(lián)。對于手動偶聯(lián)來說，將PEG氨基酸(2eq.)用無水DMF中的COMU(2eq.)和DIEA(4eq.)(相對于PEG來說0.2M)預(yù)先活化5min。然后將活化的PEG添加到樹脂并允許混合物在RT下機械攪拌過夜。使用DCM中的50％丙酸酐將肽的N-端丙?；?。在照常切割和處理后，將粗品肽不需進一步純化直接用于下一個環(huán)化步驟中。

二硫橋使用與實施例1中所述的相同的方案，通過來自于AG中1和8位中包含的兩個半胱氨酸的分子內(nèi)環(huán)化來獲得。純的偶聯(lián)物作為白色粉末獲得(最終純度>95％)。詳細的梯度、得率和質(zhì)量分析在下面給出。

3.SEQ ID NO：9-[Tle12]NT(8-13)、SEQ ID NO：9-[Lys8,Tle12]NT(8-13)、SEQ ID NO：9-[Lys9,Tle12]NT(8-13)、SEQ ID NO：9-[Trp11,Tle12]NT(8-13)、SEQ ID NO：9-[Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)和SEQ ID NO：11-[Lys8,Tle12]NT(8-13)的合成

化合物XV(SEQ ID NO：9-[Tle12]NT(8-13))、化合物XVI(SEQ ID NO：9-[Lys8,Tle12]NT(8-13))、化合物XVII(SEQ ID NO：9-[Lys9,Tle12]NT(8-13))、化合物XVIII(SEQ ID NO：9-[Trp11,Tle12]NT(8-13))、化合物XIX(SEQ ID NO：9-[Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13))和化合物XX(SEQ ID NO：11-[Lys8,Tle12]NT(8-13))如對化合物IX(SEQ ID NO：9-NT(8-13))所述，通過固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成儀上，使用Fmoc/tBu策略和如上所述手動預(yù)先裝載的Fmoc-Leu-Wang樹脂(100-200目，1％DVB，載量0.09mmol/g)來合成。

Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Tle-OH購自Iris Biotech。其他原材料已在上文描述。

肽延長、切割和處理使用與前面實施例中所述相同的程序來進行。對于D-Cys、Met和NT-Arg9氨基酸來說，進行雙重偶聯(lián)。使用DCM中的50％丙酸酐將肽的N-端丙?；?。在照常切割和處理后，將粗品肽不需進一步純化直接用于下一個環(huán)化步驟中。

實施例11

串聯(lián)AG-NT活化藥物的低體溫響應(yīng)

為了確定使用串聯(lián)合成程序獲得的活化的NT藥物的低體溫效果，將每種藥物以及化合物II以10mg/kg eq.NT的劑量靜脈內(nèi)注射(團注)到Swiss(CD-1)小鼠中，并在注射后3小時內(nèi)監(jiān)測直腸體溫。

試驗的所有藥物在小鼠中誘導強力且相似的低體溫響應(yīng)，具有可比的最大體溫降低和動力學，在注射后60min時達到約-6/-7℃(圖9)。

在這個劑量水平下，化合物XIV表現(xiàn)出最好的耐受性側(cè)貌，同時表現(xiàn)出強的低體溫效果，在注射后60min時達到-6.7℃?；衔颴IV的ED₅₀為1.53mg/kg eq.NT，這與為化合物I和化合物II所測量到的相近。當與化合物I相比時，化合物XIV在腦和眼中顯示出增加的K_in，分別達到3.65x 10^-4mL/s/g和3.30x 10^-4mL/s/g(圖5，黑色條)，以及更高的血液穩(wěn)定性，估算半衰期為96min(圖6)。當以20mg/kg eq.NT在小鼠中注射時，化合物XIV仍然良好地耐受，沒有另外的安全性顧慮。在這個劑量水平下沒有觀察到體溫的進一步降低，表明藥理學低體溫響應(yīng)在10mg/kg eq.NT下飽和。最高耐受劑量(MTD)為40mg/kg eq.NT，LD₅₀(致死劑量，50％)沒有達到(>40mg/kg eq.NT)。考慮到MED約為0.1mg/kg eq.NT，這種藥效學/毒性側(cè)貌構(gòu)成了出色的安全性先決條件，因為i)它防止了由加重的藥理學低體溫造成的潛在致死的過高劑量，并且ii)使用靜脈內(nèi)(團注)給藥模式，被表示成MED與MTD之間的倍率增加的治療窗約為400，在引發(fā)最大低體溫響應(yīng)的劑量水平與誘導輕度/非致死毒性的劑量水平之間具有4倍的安全保證。

實施例12

包含置換的NT的串聯(lián)活化藥物的低體溫響應(yīng)

為了確定使用串聯(lián)合成程序獲得的含有置換版本的NT(8-13)的活化的NT藥物的低體溫效果，將每種藥物以及無置換的化合物IX以5mg/kg eq.NT靜脈內(nèi)注射(團注)到Sprague-Dawley大鼠中，并在注射后3小時內(nèi)監(jiān)測直腸體溫。

當與無置換的化合物IX相比時，在NT(8-13)序列中包含穩(wěn)定化置換的所有藥物在大鼠中誘導更高的低體溫響應(yīng)(圖10)。在5mg/kg eq.NT下的最大體溫降低，對于化合物IX來說是注射后30min時-1.2℃，對于化合物XV、XVI、XVII和XX來說是注射后60至90min時-2℃左右，對于化合物XVIII和XIX來說是注射后90min時-2.8℃左右。

實施例13

本發(fā)明的活化的NT藥物的重復給藥

為了確定小鼠在重復給藥本發(fā)明的活化的NT后的低體溫響應(yīng)性，將Swiss(CD-1)小鼠通過以4mg/kg eq.NT的劑量每天靜脈內(nèi)(團注)給藥化合物XIV共四天進行激惹。每天在注射后3小時內(nèi)監(jiān)測直腸體溫。

在第1天，小鼠通常在注射后45min時顯示出-5.5℃的最大體溫降低(圖11)。盡管第2天低體溫響應(yīng)略微降低，但隨后(從第2天到第4天)所述效應(yīng)保持顯著且穩(wěn)定，在注射后30min時平均體溫降低為-3℃。

與在重復給藥3天后沒有顯示出效果的穩(wěn)定的NT類似物(Boules等，2003,Brain Res.,987(1):39-48)相反，這些結(jié)果證實本發(fā)明的活化的NT藥物表現(xiàn)出獨一無二的藥效學性質(zhì)和有限的耐受性，允許以有效且安全的劑量水平重復地或亞慢性給藥。

實施例14

本發(fā)明的活化的NT藥物的退熱效果

除了在靜脈內(nèi)注射到首次用于實驗的小鼠中時引發(fā)強烈的低體溫效果之外，我們在具有酵母誘導的過高體溫的小鼠中評估了本發(fā)明的活化的NT藥物的退熱效果。簡單來說，首先在試驗前14小時使用直腸探頭測量雄性NMRI小鼠的直腸溫度(基線1，間隔至少5min的兩次獨立測量值)。然后將小鼠皮下注射酵母懸液(512mg/kg)以誘導體溫過高響應(yīng)，或注射0.9％鹽水中的羥丙基甲基纖維素(HPMC)。14小時后，再次測量小鼠的直腸溫度(基線2，間隔至少5min的兩次獨立測量值)，以便評估酵母或HPMC注射對基線溫度的影響。然后將小鼠隨機分組，用活化的神經(jīng)降壓素分子(化合物XIV)或?qū)φ?0.9％鹽水)i.v.注射，并在15、30、45、60、120和180分鐘后再次測量直腸溫度。

用酵母懸液注射并接受鹽水的對照小鼠顯示出典型的0.6-1℃的過高體溫。本發(fā)明的活化的NT分子的退熱效果根據(jù)它逆轉(zhuǎn)所述誘導的過高體溫的能力進行排序。結(jié)果顯示，化合物XIV自2mg/kg eq.NT起在小鼠中明顯逆轉(zhuǎn)過高體溫并且起效快，在注射后15min時與同一動物的基線2相比或與用鹽水處理的時間匹配的動物相比最大效果為-2.2℃(圖12)?；衔颴IV的退熱效果顯示出劑量響應(yīng)關(guān)系，并且在6mg/kg eq.NT的劑量水平下可能進一步降低體溫至4.7℃。這個引人注目的結(jié)果顯示，由本發(fā)明的活化的NT分子誘導的受控的正常體溫或甚至適度的治療性低體溫，可以在伴有過高體溫的急性病癥例如局灶性腦缺血、嚴重創(chuàng)傷性腦損傷、ICH、病毒、細菌或寄生蟲感染和其中局部炎性反應(yīng)可能誘導過高體溫的任何急性病癥中用于神經(jīng)保護。

實施例15

活化的NT藥物在癲癇和興奮性毒性神經(jīng)元死亡的小鼠模型中的抗驚厥、神經(jīng)保護和抗神經(jīng)炎性效果

在本實施例中，我們評估了本發(fā)明的活化的NT藥物在與驚厥和癲癇發(fā)作相關(guān)的興奮性毒性后促進神經(jīng)保護的潛力。遠超過任何其他細胞，神經(jīng)元對氧和葡萄糖剝奪這種誘導神經(jīng)元的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的大量釋放的情形特別敏感。由神經(jīng)元釋放的過量谷氨酸進而誘導過度的神經(jīng)元活性，其引起快速神經(jīng)元死亡和有害的神經(jīng)炎癥。這個興奮性毒性過程對于所有形式的腦缺血即心臟驟停后(全腦缺血)、中風后(局灶性缺血)和新生兒缺血來說是常見的。在癲癇發(fā)作期間和癲癇中以及腦和脊髓創(chuàng)傷后，也發(fā)生興奮性毒性。在所有情況下，在神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元對興奮性毒性特別敏感的區(qū)域例如海馬中觀察到的快速神經(jīng)元死亡，引起不可逆的神經(jīng)元損傷，具有通常嚴重的障礙或死亡。癲癇發(fā)作也可能伴有異常軸突出芽，特別是在癲癇發(fā)作后幾周內(nèi)海馬的苔蘚纖維的異常軸突出芽。

在本發(fā)明的情形中，興奮性毒性由皮下(s.c.)注射卡英酸(KA)引起，這是一種促驚厥劑，已知誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)并伴有可以在KA給藥后3至7天觀察到的海馬中的興奮性毒性、神經(jīng)炎癥和嚴重神經(jīng)元損傷，并伴有可以在KA給藥后7-8周時觀察到的齒狀回苔蘚纖維的異常軸突出芽。我們試驗了化合物XIV對i)癲癇活性(復發(fā)性癲癇發(fā)作的持久性)，ii)神經(jīng)變性、神經(jīng)炎癥和引起的腦組織損傷以及iii)齒狀回苔蘚纖維的異常軸突出芽的影響。

對FVB/N成年雄性小鼠注射單劑KA(40-45mg/kg s.c.)，以產(chǎn)生具有作為SE的標志的自發(fā)性復發(fā)性癲癇發(fā)作的小鼠。小鼠的陰性對照組被給藥0.9％鹽水代替KA，并且沒有其他處理(“假處理”，n＝5)。SE發(fā)作后30分鐘，小鼠接受劑量為4mg/kg eq.NT的化合物XIV(治療組“SE+HT”，n＝5)或0.9％鹽水(“SE”組，n＝5)的靜脈內(nèi)(尾靜脈)團注或15mg/kg的高劑量的強力抗驚厥和抗癲癇藥物安定(DZP)(陽性對照組“SE+DZP”)。在KA注射前及其后6小時內(nèi)每15min，使用直腸探頭監(jiān)測體溫。在此期間，評估小鼠的運動性癲癇發(fā)作的出現(xiàn)和嚴重性。一周后，將動物處死，用于冠狀面上神經(jīng)元細胞死亡的組織學評估，在該興奮性毒性模型中，所述海馬結(jié)構(gòu)是腦中顯示出組織損傷的主要結(jié)構(gòu)。另一組進行相同處理的動物在8周后處死，用于齒狀回苔蘚纖維的異常軸突出芽的組織學評估。

1)活化的NT藥物對癲癇持續(xù)狀態(tài)中的體溫和發(fā)作強度的影響：化合物XIV具有抗驚厥性能

KA(40-45mg/kg；s.c.)的給藥引起特征性的順序性行為變化。緊接注射之后，所述動物不能移動(階段1)。在KA注射后30分鐘內(nèi)，觀察到伴有點頭、前肢陣攣和轉(zhuǎn)圈行為的自動癥(階段2-3。然后，大多數(shù)動物進展到間歇性(階段4)然后是連續(xù)性(階段5)起立并伴有前肢陣攣和跌倒行為。一些小鼠表現(xiàn)出嚴重的全面性強直陣攣性癲癇(階段6)。只有至少達到Racine 5級癲癇發(fā)作的動物被包含在本研究中。在KA注射后2小時左右發(fā)生的SE，以5-6級癲癇發(fā)作為特征并通常伴有過高體溫(圖13A)。在SE發(fā)作后30min(SE30)給藥的化合物XIV總是引起暫時的低體溫(圖13A)，其持續(xù)至少2hrs。與SE動物相比，為SE30+化合物XIV動物分別記錄到-2.5℃和-3.6℃的平均體溫(BT)降低(F＝52.34；***P<0.001)。這種低體溫伴有SE30+化合物XIV組中與SE組相比癲癇發(fā)作的明顯減少(F＝823.96；***P<0.001；圖13B)。在剩余的實驗期間，SE30+化合物XIV動物表現(xiàn)出平均2級或更低的癲癇發(fā)作。一部分動物被i.p.給藥高劑量安定(DZP)。與SE30+化合物XIV動物的情況相同，DZP治療的動物在剩余的實驗期間快速顯示出1-2級癲癇發(fā)作，并且在這些動物中也觀察到低體溫(F＝823.96；***P<0.001；圖13A、B)。與SE動物相比，當在SE發(fā)作后30min給藥神經(jīng)降壓素NT(8-13)時，沒有觀察到BT或癲癇發(fā)作強度的顯著變化。因此，在SE動物中以4mg/kg eq.NT的劑量給藥化合物XIV(SE+HT組)誘導了運動性癲癇發(fā)作的明顯減少或甚至抑制，證實了所述藥物的強力抗驚厥效果。這種效果與～2.5小時期間-3至-6℃的體溫降低相關(guān)。

2)在癲癇持續(xù)狀態(tài)后活化的NT藥物在海馬中促進神經(jīng)保護

使用分別標記神經(jīng)元特異性核蛋白和神經(jīng)元死亡的抗NeuN抗體和Fluoro-jade C，我們觀察到與假處理動物(圖14A-圖A)相比，對照SE動物(圖14A-圖B)的海馬中CA1和CA3錐體細胞以及一些齒狀門神經(jīng)元的廣泛損失。當在SE發(fā)作后30min給藥化合物XIV或DZP時，在SE動物中觀察到的神經(jīng)變性顯著降低(圖14A、B)，但是當給藥NT(8-13)時沒有觀察到變化。對SE30+化合物XIV動物獲得的結(jié)果與在SE30+NT(8-13)組中觀察到的結(jié)果有顯著差異，但是與在SE30+DZP小鼠中觀察到的結(jié)果沒有差異。

3)在癲癇持續(xù)狀態(tài)后，NT-活化的藥物在海馬中減弱神經(jīng)膠質(zhì)細胞介導的炎性反應(yīng)。

SE誘導的神經(jīng)膠質(zhì)增生涉及小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞類型。我們使用GFAP和Iba1免疫標記來估算化合物XIV對神經(jīng)炎癥的影響。在假處理動物中，檢測HF中GFAP和Iba1的基線標記(圖14A，圖D)。在SE動物中，在所有海馬層中出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的非常強的激活(圖14，圖E、H)。當在SE發(fā)作后30min給藥化合物XIV或DZP時，這種炎性反應(yīng)被顯著降低(圖14，圖F、I)，但是當給藥NT(8-13)時沒有觀察到變化。對SE30+化合物XIV動物獲得的結(jié)果與在SE30+NT(8-13)組中觀察到的結(jié)果有顯著差異，但是與在SE30+DZP小鼠中觀察到的結(jié)果沒有差異。

4)在癲癇持續(xù)狀態(tài)后，NT-活化的藥物在海馬中減少苔蘚纖維出芽

苔蘚纖維這種齒狀回顆粒細胞的軸突的出芽，在KA處理的小鼠和總的來說癲癇中已被確立。已提出，這種異常出芽在對門細胞損失做出響應(yīng)時在內(nèi)分子層(IML)中出現(xiàn)。為了進一步調(diào)查化合物XIV的神經(jīng)保護效果，我們評估了SE后8周時苔蘚纖維出芽的程度。苔蘚纖維末梢高度富含鋅離子，我們使用用于鋅囊泡轉(zhuǎn)運體3(ZnT3)的免疫組織化學標記來檢測苔蘚纖維出芽，如圖15中所示。在所有假處理動物中，苔蘚纖維末梢存在于CA3區(qū)的門和透明層中，并且在DG的IML中沒有觀察到末梢(圖15A-圖A、B，圖15B)。在SE動物中，不僅與假處理小鼠中相同在門和CA3區(qū)中，而且在IML內(nèi)觀察到苔蘚纖維末梢(圖15A-圖C、D，圖15B)。與SE動物相比，在SE發(fā)作后30min給藥化合物XIV(圖15A-圖E、F，圖15B)或DZP的動物中神經(jīng)支配IML的末梢的數(shù)目明顯減少，但是當給藥NT(8-13)時沒有顯著變化(圖15B)。

所有這些結(jié)果清楚地證實，本發(fā)明的活化的NT分子不僅代表了防止由興奮性毒性神經(jīng)元死亡和神經(jīng)炎癥引起的腦組織損傷的有吸引力的方法，而且具有抑制運動性癲癇發(fā)作的潛力，其據(jù)推測是通過經(jīng)低體溫來降低神經(jīng)元活性。

實施例16

串聯(lián)的活化的NT藥物的鎮(zhèn)痛效果

為了評估活化的NT藥物的鎮(zhèn)痛潛力，在小鼠中的實驗性疼痛模型中試驗了化合物XIV。使用扭體試驗作為急性內(nèi)臟痛的模型來評估化合物XIV在靜脈內(nèi)給藥后的效果?？紤]到在接受化合物XIV的小鼠中達到最大體溫降低的時間在注射后45min左右，我們假設(shè)在這種疼痛模型中具有類似的藥效學動力學。小鼠首先接受劑量水平逐漸增加的化合物XIV的靜脈內(nèi)注射(團注)，在30min后接著進行0.7％乙酸的腹膜內(nèi)注射(10mL/kg)。在對照小鼠中，乙酸的腹膜內(nèi)注射早在注射后2-3分鐘產(chǎn)生特征性和可定量的腹部伸展(身體的延長和前肢的伸長)，并在注射后5至15min之間達到峰值。因此將該時間窗用于在給藥鹽水或0.5、1或5mg/kg eq.NT的化合物XIV的小鼠中評估腹部伸展的次數(shù)(在10min觀察期內(nèi)的扭動計數(shù))。

化合物XIV在該模型中產(chǎn)生顯著且劑量依賴性的鎮(zhèn)痛效果，在0.5mg/kg eq.NT下沒有效果，在1和5mg/kg eq.NT下扭動計數(shù)分別減少50％和64％(圖16)。