用于活化和綴合生物分子的方法
【專利說明】用于活化和綴合生物分子的方法
[0001] 本申請是基于申請日為2011年2月21日，優(yōu)先權(quán)日為2010年2月21日，申請?zhí)枮?201180020149.0,發(fā)明名稱為："用于活化和綴合生物分子的方法"的專利申請的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及用于生成生物分子綴合物的方法，其中將該方法整合入單一單元操作 (single unit operation)中。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 隨著生物技術(shù)的進(jìn)展，已經(jīng)開發(fā)出生物藥物來滿足未滿足的醫(yī)學(xué)需要。然而，其短 的體內(nèi)半衰期需要患者服用頻繁和/或大劑量的運(yùn)些生物藥物來實現(xiàn)祀標(biāo)治療或預(yù)防目 的。長的靜脈內(nèi)療法或頻繁的注射可W影響患者的生命質(zhì)量。多種聚合物諸如聚乙二醇 (PEG)可W與生物分子（例如，蛋白質(zhì)）綴合W提高許多生物分子的半衰期和生物活性 (Reddy ,Ann.Pharmacother .34:915-923,2000)。聚合物綴合物的其它益處包括(a)在制造 過程期間改善的產(chǎn)品穩(wěn)定性；（b)降低的腎清除(Fung等，Polym.Pr邱r. 38:565-566，1997); 改善的腫瘤勒!向（Yowell等，(^incer IYeat .Rev. 28Su卵1 .A: 3-6,2002);降低的抗原性和免 疫原性（Muller 等，Br. J.化 ematol. 110:379-384,2000; AbsMre 等，Blood96:1709-1715, 2000);和更大的可耐受性（Safra 等，Ann.Oncol . 11: 1029-1033,2000;化 dson 等， Eur. J. Cancer 37:870-877,2001KPEG 化已經(jīng)應(yīng)用于人生長因子化 im 等，Biomaterials 23 : 2311-2317，2002 ; Wu等，Protein E邱r .Purif. 48 : 24-27，2006)、生長激素釋放因子 (Piquet等，J. Qiromatogr. 944:141-148,2002)、腺病毒載體化to等，Int. J.Pharm. 354:3-8,2008)和質(zhì)粒DNA化osseinldiani等 J.Control Release ,97:157-171,2004)。由于PEG化 的益處，已經(jīng)開發(fā)出許多綴合反應(yīng)化學(xué)（RobertS等.，Adv.Drug Deliv.Rev. 54:459-476, 2002)和聚合物衍生物(歐洲專利No. 1578841)。隨著生物分子-聚合物綴合物的應(yīng)用增加， 有必要開發(fā)簡單的、可再現(xiàn)的、且可縮放的（scalable)單元操作來滿足制造需要。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明設(shè)及一種用于生成生物分子綴合物的方法，包括下列步驟:通過與活化劑 接觸活化生物分子;除去所述活化劑;并通過將所述生物分子與活化的聚合物起反應(yīng)綴合 所述生物分子;其中將該方法的步驟整合入單一單元操作中。該方法可W進(jìn)一步包括分開 所述生物分子綴合物與未綴合的生物分子的步驟。在一個實施方案中，通過大小排阻層析 或離子交換層析分開所述生物分子綴合物與未綴合的生物分子。
[0007] 在一個實施方案中，單一單元操作是集成的切向流過濾系統(tǒng)。在另一個實施方案 中，活化劑選自緩沖液更換、抑調(diào)節(jié)、或還原劑。在又一個實施方案中，還原劑是二硫蘇糖醇 或S2-簇乙基麟（tris 2-ca;rboxyethyl phosphine)。在其它實施方案中，聚合物是聚乙二 醇，且生物分子選自：蛋白質(zhì)、多糖和核酸。在又一個實施方案中，所述蛋白質(zhì)選自凝固因 子、抗體、激素、生長因子和酶。
[000引附圖簡述
[0009]圖1:PEG化對照運(yùn)行的陽離子交換層析洗脫譜(profile)。
[0010] 圖2:來自陽G化對照運(yùn)行的陽離子交換層析洗脫峰的SDS-PAGE。
[0011] 圖3:來自PEG化對照的陽離子交換層析洗脫峰的大小排阻層析。
[0012] 圖4: WTFF模式實施的陽G化的陽離子交換層析洗脫譜。
[0013] 圖5:實驗室規(guī)模TFF運(yùn)行的陽離子交換層析洗脫譜。
[0014] 圖6:由實驗室規(guī)模TFF運(yùn)行生成的PEG化巧VIII的SEC譜。
[0015] 圖7:試驗(pilot)規(guī)模TFF運(yùn)行的陽離子交換層析洗脫譜。
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所描述的具體裝置或部分，并且因此可W有所變化。還應(yīng) 當(dāng)理解，本文中所使用的術(shù)語僅為了描述具體的實施方案，而并不意圖限制本發(fā)明的范圍， 其僅由所附權(quán)利要求書限制。
[0018] 必須注意到，如本文中和所附權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式"一個"、"一種"和 "該/所述"包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文另有明確規(guī)定。如此，例如，提及"藥劑"指提及一種 或多種藥劑(agent),并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。除非另有定義，本文 中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的 意義。
[0019] 生物分子的綴合，諸如PEG化可W是隨機(jī)綴合或位點特異性綴合物。在運(yùn)兩種情況 中，通?；罨锓肿覹容許聚合物，諸如PEG的有效偶聯(lián)。在隨機(jī)PEG化中，PEG可W與隨機(jī) 活化的氨基酸殘基共價綴合。它通常導(dǎo)致單-PEG化的和多-PEG化的生物分子的混合物。對 于位點特異性PEG化，生物分子可W遺傳修飾為使得PEG分子可W與生物分子的表面上的特 定位點綴合。此方法使副產(chǎn)物形成最小化，并且減輕分開產(chǎn)物與副產(chǎn)物的隨后的純化步驟 的負(fù)擔(dān)。
[0020] 可W通過調(diào)節(jié)溶液的抑或者通過使用還原劑諸如二硫蘇糖醇(DTT)或S2-簇乙基 麟(TCEP)活化生物分子上溶劑暴露的殘基。還原后，可W經(jīng)由共價連接將陽G分子附接于活 化的殘基。若使用還原劑，則可能有必要在綴合反應(yīng)前除去還原劑。大小排阻層析(SEC)是 一種用于實驗室規(guī)模還原劑除去的常見技術(shù)。
[0021 ]有效的現(xiàn)有技術(shù)生物分子綴合一般要求多單元操作，例如，
[0022] -經(jīng)由與還原劑一起溫育/受控混合活化，其通常在混合式容器諸如攬拌式活化罐 中實施；
[0023] -除去活化劑，其通常通過大小排阻層析或其它層析法進(jìn)行；
[0024] -經(jīng)由與活化的聚合物(諸如PEG) -起溫育/受控混合來綴合，其通常在攬拌式綴 合罐中實施;并
[0025] -通過層析諸如離子交換層析分開綴合的生物分子與未反應(yīng)的分子和副產(chǎn)物。
[0026] 此類方法需要多個系統(tǒng)和(在商業(yè)規(guī)模上)相當(dāng)大的空間和單元操作間手工處理/ 轉(zhuǎn)移。另外，SEC難W在商業(yè)規(guī)模制造中執(zhí)行，并且要求設(shè)置為獨(dú)立單元操作。
[0027] 本發(fā)明的方法通過利用集成切向流過濾來接觸/混合及隨后除去反應(yīng)物將活化、 除去活化劑、和綴合步驟整合入一個單一單元操作中。雖然通過利用合適的分子量截留膜 保留祀生物分子，但是可W在活化/綴合之前、期間、或之后改變物理化學(xué)條件諸如濃度、 pH、電導(dǎo)率、和緩沖液種類。系統(tǒng)中水動力學(xué)的調(diào)節(jié)容許調(diào)節(jié)最佳的濃度，及任選地實現(xiàn)膜 表面上局部更高的接觸濃度W進(jìn)一步優(yōu)化活化和綴合過程。此方法是操作簡單的、可再現(xiàn) 的、可縮放的、且可用于商業(yè)規(guī)模藥物生產(chǎn)。
[0028] 可W在本發(fā)明的方法中使用的聚合物的例子包括但不限于聚燒撐氧 (polya化ylene oxide)諸如聚乙二醇、右旋糖巧、多聚乙酷神經(jīng)氨酸、或其它基于碳水化合 物的聚合物、氨基酸的聚合物、生物素衍生物、聚乙締醇(PVA)、聚簇酸醋、聚乙締化咯燒酬、 聚乙締-馬來酸酸酢共聚物、聚苯乙締-蘋果酸酸酢共聚物、聚口惡挫嘟、聚丙締酷嗎嘟、肝 素、清蛋白、纖維素、殼聚糖的水解產(chǎn)物、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、普魯分支葡聚糖 (pullulan)、菊粉、黃原膠(xanthan gum)、角叉藻聚糖karrageenan)、果膠、褐藻酸水解產(chǎn) 物及其任何等同物。聚乙二醇的例子是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其它有用的聚燒撐二醇化 合物是聚丙二醇(PPG)、聚下二醇(PBG)、PEG-縮水甘油基酸化POX-PEG)、PEG-氧幾基咪挫 (COl-PEG)、分支的聚乙二醇、線性聚乙二醇、叉狀的聚乙二醇和多臂的或超分支的聚乙二 醇（星-陽G)。
[0029] 聚乙二醇（PEG)包括任何水溶性聚（環(huán)氧乙燒）。通常，PEG包含下列結(jié)構(gòu) (OC出C此)一"，其中（n)是2至4000。如本文中所使用的，PEG還包括"--C此C此一0(C此C出0)-C出C出和(OC出C出)0--"，運(yùn)取決于末端氧是否已經(jīng)被置換。
[0030] 聚乙二醇還包括具有各種末端或末端加帽基團(tuán)，諸如但不限于徑基或C120烷氧基 基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。聚乙二醇還意指含有大部分，也就是說，大于50%的--0CH2CH2--重復(fù)亞單元 的聚合物。就特定形式而言，PEG可W采用眾多分子量，W及構(gòu)建或幾何學(xué)諸如分支的、線性 的、叉狀的、和多功能的。
[0031] 生物分子的例子包括例如任何蛋白質(zhì)、多糖或核酸。蛋白質(zhì)包括但不限于凝固因 子、抗體、激素、生長因子和酶。
[0032] 本文中所描述的方法和材料意圖是本發(fā)明的代表性例子，并且應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明 的范圍不限于例子的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)可，本發(fā)明可W用公開的方法和材料的變 型實施，并且認(rèn)為此類變型在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 實施例
[0033] 為了使本發(fā)明可W得到更好的理解，列出W下實施例。運(yùn)些實施例僅為了例示目 的，而不應(yīng)W任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過提及而完整收錄本文中提及的所有 出版物。
[0034] 實施例1: PEG化
[0035] 在對照中，將S2-簇乙基麟(TCEP)儲備溶液