本發(fā)明總體涉及免疫學(xué)的領(lǐng)域，并且具體地涉及結(jié)合亨德拉和尼帕病毒和/或抑制亨德拉和尼帕病毒活性的抗體及抗體片段。

發(fā)明背景

尼帕病毒(NiV)和亨德拉病毒(HeV)是組成亨尼帕病毒屬的密切相關(guān)的副粘病毒(Anonymous 1999MMWR Morb Mortal Wkly Rep Ward,J.W.編輯48:335-337；Chew,M.H.等2000J Infect Dis 181:1760-1763；Chua,K.B.等2000Ann Neurol 48:802-805；Eaton,B.T.2001Microbes Infect 3:277-278；Goh,K.J.等2000N Engl J Med 342:1229-1235；Lee,K.E.等1999Ann Neurol 46:428-432；Lim,C.C.等2000Am J Neuroradiol 21:455-461；Murray,K.等1995Science 268:94-97)。副粘病毒是含負(fù)義RNA的有包膜病毒并且包括多種重要的人和動(dòng)物病原體，包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、仙臺(tái)病毒、新城疫病毒、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒和猿猴病毒5(綜述于Lamb和Parks,2007,Fields Virology，編輯Knippe&Howley,Lippincott,Williams&Wilkins，第1449-1496頁中)。

與其它副粘病毒一樣，HeV和NiV在病毒顆粒的包膜中具有兩種主要的膜錨定糖蛋白。一種糖蛋白是宿主細(xì)胞受體識(shí)別和附著所需的，并且被命名為血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)、血凝素蛋白(H)，或在亨尼帕病毒(henipavirus)的情況下，既不具有血凝素活性也不具有神經(jīng)氨酸酶活性的糖蛋白(G)。另一種主要糖蛋白是融合(F)糖蛋白，其為含有兩個(gè)七肽重復(fù)(HR)區(qū)和疏水性融合肽(Fp)的三聚體I類促融合包膜糖蛋白。亨尼帕病毒F糖蛋白被合成為前體F₀，該前體F₀最可能在F的內(nèi)吞和再循環(huán)過程中被存在于內(nèi)體區(qū)室內(nèi)的宿主細(xì)胞組織蛋白酶L翻譯后裂解成成熟的促融合F₁(較大的羧基末端片段)+F₂(較小的氨基末端片段)亞單位，所述成熟的促融合F₁+F₂亞單位通過二硫鍵(通過保守的半胱氨酸殘基)保持在一起。參見Pager,C.T.等2006.Virology 346:251-7；Pager,C.T.等2005.J Virol 79:12714-20；Meulendyke,K.A.等2005,J Virol,79:12643-9；Diederich,S.M.等2005,J Biol Chem,280:29899-903。在F的成熟形式中，F(xiàn)p位于F₁的N末端，后接第一HR(HRA)，并且第二HR(HRB)位于F₁的C末端并位于其跨膜結(jié)構(gòu)域之前(綜述于Lamb和Parks,2007,Fields Virology，編輯Knippe&Howley,Lippincott,Williams&Wilkins，第1449-1496頁中)。

在通過G糖蛋白附著于宿主受體ephrin(EFN)B2或B3后，HeV和NiV通過不依賴于pH的膜融合過程感染細(xì)胞。對(duì)該過程仍然知之甚少，并且據(jù)信在受體結(jié)合后牽涉G的構(gòu)象變化，這導(dǎo)致F的激活和觸發(fā)。Lamb,R.A.等2006,Virology,344:30-7；Steffen,D.L.等2012,Viruses,4:280-308。觸發(fā)后，F(xiàn)經(jīng)歷明顯的構(gòu)象重排，這有利于所述融合肽插入靶膜，從而在病毒與細(xì)胞膜的融合過程中或緊接融合之后在六螺旋束結(jié)構(gòu)或發(fā)夾三聚體的形成中使兩個(gè)HR區(qū)合在一起。所述F驅(qū)動(dòng)的膜融合過程據(jù)認(rèn)為涉及從亞穩(wěn)定型，隨后通過后續(xù)的離散構(gòu)象變化至較低的能量狀態(tài)的不可逆折疊。觸發(fā)后該F重折疊的若干分子細(xì)節(jié)已在呼吸道病毒的融合后和融合前構(gòu)象的結(jié)構(gòu)解析中得以揭示。F.Yin,H.S.等2005,Proc Natl Acad Sci USA,102(26):9288-93；Yin,H.S.等2006,Nature 439:38-44。

雖然目前沒有臨床上批準(zhǔn)的針對(duì)HeV或NiV的疫苗或治療劑，但已顯示亨尼帕病毒G糖蛋白特異性中和單克隆抗體(mAb)m102.4，當(dāng)在晚至感染后72小時(shí)施用其時(shí)，保護(hù)非洲綠猴抵抗HeV而免受致死性疾病。Bossart,K.N.等2011,Sci Transl Med,3:105ra103?？贵w或抗體片段，諸如單克隆抗體(mAb)及其片段，可用于闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和理解與各種結(jié)構(gòu)域相關(guān)的功能，以及提供潛在的試劑以用作預(yù)防性和/或治療性試劑，如在抗G m102.4的情況下。迄今為止，存在極少數(shù)報(bào)導(dǎo)的抗亨尼帕病毒F mAb，并且沒有一種是從重組蛋白產(chǎn)生的。Aguilar,H.C.等2007,J Virol,81:4520-32；Guillaume,V.H.等2006,J Virol,80:1972-8。這些報(bào)道提供了關(guān)于所述分離的抗體的特異性特性的有限信息。中和抗F抗體及抗體片段的開發(fā)可用作另一種潛在的亨尼帕病毒感染的治療劑，所述治療劑當(dāng)與m102.4組合時(shí)可能更有效。所述抗F抗體及抗體片段還可提供有價(jià)值的工具來促進(jìn)亨尼帕病毒的F介導(dǎo)的融合的結(jié)構(gòu)和功能表征。

因此，針對(duì)NiV和HeV的中和或抑制抗體及抗體片段的開發(fā)可對(duì)預(yù)防和被動(dòng)免疫療法具有重要意義。另外，所述抗體和抗體片段的表位的表征以及NiV和HeV感染的中和和抑制的機(jī)制可為候選疫苗和藥物的開發(fā)提供有幫助的信息。最后，此類抗體和抗體片段還可用于診斷和用作研究試劑。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及結(jié)合、中和和/或抑制亨德拉病毒和/或尼帕病毒的抗體或抗體片段。具體地，本發(fā)明提供了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的抗體或其片段，其中所述抗體包含：包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的重鏈可變區(qū)，所述至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)具有選自由SEQ ID NO:35、37和39組成的組的氨基酸序列；和包含至少一個(gè)CDR的輕鏈可變區(qū)，所述至少一個(gè)CDR具有選自由SEQ ID NO:43、45和47組成的組的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的人源化抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:33具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.m5B3和ScFv構(gòu)建體的氨基酸序列的卡通圖。(A)m5B3的V_H和V_L的氨基酸序列。CDR區(qū)被標(biāo)記并加以下劃線，并且框架區(qū)(FR)也被標(biāo)記。m5B3、人源化5B3(h5B3)和人源化5B3.1(h5B3.1)的V_H和V_L由柔性接頭(例如連接體肽-(G₄S)₃-)間隔并被插入啟動(dòng)子增強(qiáng)的pcDNA載體，所述載體具有潮霉素選擇標(biāo)記、構(gòu)建體N末端上的免疫球蛋白輕鏈(lc)前導(dǎo)序列(Igk前導(dǎo)序列)、S肽標(biāo)簽(Stag)以及C末端上的六組氨酸標(biāo)簽(His)。

圖2.鼠5B3(m5B3)、人源化5B3(h5B3)和人源化5B3.1(h5B3.1)與F的結(jié)合。(A)m5B3、h5B3和h5B3.1ScFv與可溶性(sF)和全長(zhǎng)(FL)F的結(jié)合。將如圖1B中顯示的m5B3、h5B3和h5B3.1的ScFv構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲上清液。將來自人ScFv文庫的人ScFv用作對(duì)照(ctrl)。對(duì)于表達(dá)sF蛋白或FL F的細(xì)胞裂解物，添加等量的上清液，并用如所指示的Ni²⁺珠?；騍蛋白瓊脂糖進(jìn)行沉淀(IP)。(B)h5B3和h5B3.1IgG與FL F的結(jié)合。具有相同的Fc和CL片段的人抗HeV G mAb，m102.4用作對(duì)照mAb。將各自2μg的純化的mAb添加至表達(dá)FL F的細(xì)胞裂解物中，隨后利用蛋白G Sepharose進(jìn)行沉淀。在所有情況下，在SDS PAGE上分析所述沉淀的產(chǎn)物，隨后進(jìn)行免疫印跡，利用適當(dāng)?shù)目贵w探測(cè)(IB)所述印跡以檢測(cè)如所指示的條帶。IP：免疫沉淀；IB：免疫印跡；H：重鏈；L：輕鏈。

圖3.m5B3和h5B3的框架區(qū)(FR)與人ScFv文庫的框架區(qū)的比對(duì)以及h5B3.1的VH序列。(A)將m5B3的V_H和V_L的FR與人ScFv文庫的V_H和V_L的FR比對(duì)，并如比對(duì)上方的垂直箭頭所指示的，鑒定保守的人殘基。隨后將這些保守的殘基重新置于m5B3同源位置中以產(chǎn)生如在比對(duì)的第一行上顯示的h5B3的FR。(B)h5B3.1的氨基酸序列。CDR區(qū)被標(biāo)記并加以下劃線。CDR中的突出顯示的殘基指示在h5B3中被突變來產(chǎn)生h5B3.1的氨基酸。

圖4.用于產(chǎn)生pcDNA中的h5B3.1IgG1的載體以及純化的m5B3、h5B3和h5B3.1IgG的考馬斯染色的圖示。(A)將具有如箭頭所示位于pDR12的輕和重鏈ORF側(cè)翼的Xho I位點(diǎn)的PCR引物用于擴(kuò)增pDR12h5B3.1質(zhì)粒DNA，隨后消化所述PCR產(chǎn)物，并將其插入如所顯示的啟動(dòng)子增強(qiáng)的pcDNA3.I Hygro(+)中的Xho I位點(diǎn)。(B)在SDS PAGE上分析各自4μg的如所指示的純化的mAb，隨后進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色。垂直箭頭指示mAb的重(H)和輕(L)鏈。MW：分子量標(biāo)準(zhǔn)。

圖5.5B3鏈結(jié)合的測(cè)定。將表達(dá)如所指示的不同的S肽標(biāo)記的h5B3和人ScFv VH VL嵌合體的細(xì)胞的上清液添加至表達(dá)未標(biāo)記的F的細(xì)胞裂解物中，并利用S蛋白瓊脂糖進(jìn)行沉淀。在SDS PAGE上分析所沉淀的產(chǎn)物，隨后進(jìn)行免疫印跡，并用抗S肽抗體探測(cè)(IB)所述印跡以檢測(cè)ScFv或利用抗F抗體探測(cè)所述印跡以檢測(cè)F。

圖6.NiV和CedPV F嵌合體與不同的抗NiV F mAb的結(jié)合以及嵌合體的融合活性。(A)利用如所指示的不同的抗NiV F mAb或S蛋白瓊脂糖沉淀表達(dá)不同的S肽標(biāo)記的NiV和CedPV F嵌合體的細(xì)胞裂解物。在SDS PAGE上分析沉淀的產(chǎn)物，隨后進(jìn)行免疫印跡，并用抗S肽Ab探測(cè)所述印跡。正好低于64kDa標(biāo)記的頂部條帶為F₀，并且正好低于51kDa標(biāo)記的較低的條帶為F₁。所述嵌合體的示意圖示于印跡的左邊，其中紅色和藍(lán)色表示CedPV和NiV F區(qū)。1E11、12B2和5B3為針對(duì)F糖蛋白的鼠mAb。(B)使用允許的HeLa-ATCC細(xì)胞作為靶群體，通過在受體陰性HeLa-USU細(xì)胞中與NiV G共表達(dá)來在β-Gal報(bào)告細(xì)胞融合測(cè)定中測(cè)試不同的NiV和CedPV F嵌合體促進(jìn)細(xì)胞融合的能力。以一式三份進(jìn)行測(cè)定，并且將融合結(jié)果計(jì)算和表達(dá)為3-Gal活性(每分鐘570nm處的光密度的變化x 1,000)的平均速率。Ni：NiV；Ce：CedPV；Hd：F的球狀頭部；HRB：F的七肽重復(fù)B。

圖7.通過誘變進(jìn)行的5B3表位的定位。(A)鼠5B3缺陷型F突變體的沉淀和免疫印跡分析。產(chǎn)生一小組S肽標(biāo)記的NiV F突變體，并在293T細(xì)胞中表達(dá)。等分表達(dá)F的細(xì)胞裂解物，并分別用5B3、12B2和S蛋白瓊脂糖進(jìn)行沉淀。隨后添加mAb-F復(fù)合物與蛋白G Sepharose。在SDS PAGE上分析所沉淀的產(chǎn)物，隨后進(jìn)行免疫印跡，并用抗S肽Ab探測(cè)所述印跡。頂部條帶為F₀，并且較低的條帶為F₁。(B)5B3缺陷型NiV F突變體在β-Gal報(bào)告細(xì)胞融合測(cè)定中的融合活性。使用允許的HeLa-ATCC細(xì)胞作為靶群體，通過在受體陰性HeLa-USU細(xì)胞中與NiV G共表達(dá)來測(cè)試(A)中顯示的NiV F的突變體的促進(jìn)細(xì)胞融合的能力。所顯示的數(shù)據(jù)是利用總的表達(dá)(如通過免疫印跡條帶的光密度法測(cè)量的)標(biāo)準(zhǔn)化的，從3個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)計(jì)算的針對(duì)每一個(gè)突變體測(cè)量的WT融合水平的平均百分?jǐn)?shù)。條代表自多個(gè)實(shí)驗(yàn)的范圍。WT：野生型F。(C)映射至以表面表示顯示的NiV F三聚體結(jié)構(gòu)的5B3表位的位置。不同的灰色陰影標(biāo)記三聚體F的亞單位。有色殘基標(biāo)記在該研究中被突變的那些殘基。測(cè)試以橙色標(biāo)記的殘基，但其對(duì)5B3結(jié)合沒有影響。以粉色標(biāo)記的殘基是5B3和I2B2缺陷性的。紫紅色標(biāo)記為5B3缺陷性的但對(duì)12B2結(jié)合沒有影響的殘基。其中表位著色的亞單位的融合肽呈藍(lán)色。(D)(C)的標(biāo)記本研究中測(cè)試的所有殘基的圖像的放大。

圖8.5B3抑制的機(jī)制。(A)利用胰蛋白酶裂解sF以產(chǎn)生成熟F₁+F₂，并添加蛋白酶抑制劑以終止反應(yīng)。添加2μg的生物素化的FC2肽與不同量的如所指示的mAb。隨后將樣本加熱至50℃持續(xù)15分鐘以觸發(fā)F。隨后用抗生物素蛋白瓊脂沉淀FC2-sF復(fù)合物。(B)如(A)中所述利用m5B3和h5B3.1進(jìn)行測(cè)定，收集來自5μg mAb反應(yīng)的未結(jié)合的材料(從左邊開始的第4泳道)，并用蛋白G Sepharose進(jìn)行沉淀(從左開始的第5泳道)。(C)如(A)中所述，利用2μg的mAb和如針對(duì)熱處理所指示的遞升溫度進(jìn)行測(cè)定。收集來自所有反應(yīng)的未結(jié)合的材料，并用蛋白G Sepharose進(jìn)行沉淀。在所有上述情況下，在SDS PAGE上分析所沉淀的產(chǎn)物，隨后進(jìn)行免疫印跡，并利用抗F兔抗體探測(cè)所述印跡以檢測(cè)F。

優(yōu)選實(shí)施方案的詳述

定義

除非另外定義，否則本文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如由本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。參見，例如，Singleton P和Sainsbury D.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版，J.Wiley&Sons,Chichester,New York,2001，和Fields Virology第4版，Knipe D.M.和Howley P.M.編輯，Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia 2001。

如本文中所用，術(shù)語“抗體”是指可具有特異性結(jié)合特定抗原的能力的免疫球蛋白分子。抗體可具有不同的稱為同種型或種類的變體，諸如但不限于稱為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的5個(gè)基本抗體同種型。抗體片段可包含免疫球蛋白分子的部分或免疫球蛋白分子的部分的組合?？贵w片段可保留抗原結(jié)合能力?？贵w片段可包括抗原結(jié)合活性片段諸如但不限于公知的活性片段F(ab’)₂、Fab、Fv、Fc和Fd，以及融合肽諸如ScFv?？贵w及抗體片段對(duì)于免疫科學(xué)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員來說是公知的?？贵w及抗體片段被常規(guī)地用于體外和體內(nèi)研究及方法中。

如此處所用，術(shù)語“重鏈”和“輕鏈”是指公知的免疫球蛋白亞單位以及指抗體的部分和所述亞單位的片段。在它們的完整形式中，重鏈通常是比輕鏈長(zhǎng)的多肽。重鏈可包含對(duì)于結(jié)合抗原是重要的一個(gè)重鏈可變區(qū)(V_H)，并且輕鏈可包含對(duì)于結(jié)合抗原是重要的一個(gè)輕鏈可變區(qū)(V_L)。

Fab片段(抗原-結(jié)合片段)是結(jié)合抗原的抗體的區(qū)域。Fab可包含重鏈和輕鏈的每一個(gè)的一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域和一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域塑造單體的氨基端末端上的互補(bǔ)位—抗原-結(jié)合位點(diǎn)的形狀。兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合它們的特異性抗原上的表位。F(ab’)₂是指包含F(xiàn)ab的二聚體的抗體片段。Fab和F(ab’)₂可通過重組技術(shù)或通過抗體或抗體的片段的裂解來產(chǎn)生。如在本領(lǐng)域中已知的，只有一部分抗體分子(互補(bǔ)位)參與抗體對(duì)抗原表位的結(jié)合。pFc’和Fc區(qū)域(可結(jié)晶的片段區(qū)域)，例如，是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的效應(yīng)子，但不參與抗原結(jié)合。

如此處所用，ScFv(單鏈可變片段)是通過連接體或接頭肽連接的免疫球蛋白的重鏈(V_H)和輕鏈(V_L)的可變區(qū)的融合肽。在一些實(shí)施方案中，所述連接體肽在約2個(gè)氨基酸至約50個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述連接體肽在約10個(gè)氨基酸至約25個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。ScFv可保留原始免疫球蛋白分子的抗原結(jié)合能力。此處，ScFv被認(rèn)為是抗體片段。

如此處所用，所述Fd片段可包含F(xiàn)ab片段的重鏈部分。所述Fd片段可通過酶促裂解或重組技術(shù)產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，所述Fd片段是抗體特異性的主要決定簇(單個(gè)Fd片段可與多達(dá)10個(gè)不同的輕鏈締合而不改變抗體特異性)并且Fd片段在分離時(shí)保留表位結(jié)合能力。

互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)的肽區(qū)域。CDR可直接與抗原的表位相互作用，并且是抗體特異性的主要決定簇。框架區(qū)(FR)是維持互補(bǔ)位的三級(jí)結(jié)構(gòu)的抗體的抗原結(jié)合部分中的肽區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，在重鏈可變區(qū)(V_H)和輕鏈可變區(qū)(V_L)中，存在各自被3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1至CDR3)分隔的4個(gè)框架區(qū)(FR1至FR4)。CDR，具體地CDR3區(qū)域中，更具體地重鏈CDR3可在很大程度上負(fù)責(zé)抗體特異性。

如本文中所用，術(shù)語“亨德拉病毒性疾病”和“尼帕病毒性疾病”是指由亨德拉或尼帕病毒直接或間接引起的疾病。廣泛的種類向性以及在動(dòng)物和人中引起致命疾病的能力已將亨德拉病毒(HeV)和尼帕病毒(NiV)與所有其它已知的副粘病毒相區(qū)別(Eaton B.T.2001Microbes Infect 3:277-278)。這些病毒可被擴(kuò)增，并在大型動(dòng)物中致病，并且可被傳播至人，其中感染表現(xiàn)為嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病和/或發(fā)熱性腦炎。

如本文中針對(duì)多肽所使用的，術(shù)語“大體上純的”意指多肽基本上不含可與它們一起在自然界或體內(nèi)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)的其它物質(zhì)至對(duì)于它們預(yù)期用途是實(shí)際和適當(dāng)?shù)某潭?。具體地，多肽是足夠純的，并且充分不含它們的宿主細(xì)胞的其它生物組分，以用于，例如，生成抗體、測(cè)序或產(chǎn)生藥物制劑。通過本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，可根據(jù)本文中公開的多核苷酸和氨基酸序列產(chǎn)生大體上純的多肽。因?yàn)榭蓪⒋篌w上純的本發(fā)明的多肽與藥學(xué)上可接受的載體中在藥物制劑中混合，因此所述多肽可僅組成制劑的一定重量百分比。盡管如此，所述多肽仍然是大體上純的，因?yàn)槠湟雅c可與其在生命系統(tǒng)中締合的物質(zhì)大體上分離。

如本文中所用，“序列同一性”是核苷酸序列或氨基酸序列相較于參照核苷酸或氨基酸序列的同一性的量度。具有與參照氨基酸序列例如SEQ ID NO:1具有至少，例如，約95％的“序列同一性”的氨基酸序列的多肽被理解為意指：除所述氨基酸序列可包括多達(dá)每100個(gè)參照氨基酸序列的氨基酸約5個(gè)修飾外，所述多肽的氨基酸序列與參照序列相同。換句話說，為了獲得與參照氨基酸序列具有至少約95％序列同一性的肽，可缺失或用另一種氨基酸取代多達(dá)約5％的參照序列的氨基酸殘基，或可將多達(dá)參照序列中的總氨基酸的約5％的眾多氨基酸插入?yún)⒄招蛄小⒄招蛄械倪@些修飾可發(fā)生在參照氨基酸序列的N-末端或C-末端位置或這些末端位置之間的任何地方，單個(gè)地間插在參照序列中的氨基酸之間或以一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的組間插在參照序列內(nèi)。

一般地，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，以便獲得最高的順序匹配?！靶蛄型恍浴北旧砭哂斜绢I(lǐng)域公認(rèn)的含義，并且可以使用公知的技術(shù)來計(jì)算。雖然有多種方法來測(cè)量?jī)蓚€(gè)多核苷酸或多肽序列之間的同一性，但術(shù)語“同一性”對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的(Carillo(1988)J.Applied Math.48,1073)。測(cè)定兩個(gè)序列之間的序列同一性和相似性的計(jì)算機(jī)程序方法的實(shí)例包括，但不限于GCG程序包(Devereux(1984)Nucleic Acids Research 12,387)、BLASTP、ExPASy、BLASTN、FASTA(Atschul(1990)J.Mol.Biol.215,403)和FASTDB。測(cè)定序列同一性和相似性的方法的實(shí)例論述于Michaels(2011)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley&Sons中。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于測(cè)定兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸之間的序列同一性的算法為BLASTP。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于測(cè)定兩個(gè)或更多個(gè)多肽之間的序列同一性的算法為FASTDB，其基于Brutlag(1990)Comp.App.Biosci.6,237-245)的算法。在FASTDB序列比對(duì)中，查詢和參照序列是氨基酸序列。序列比對(duì)的結(jié)果以序列同一性百分比表示。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用于氨基酸序列的FASTDB比對(duì)以計(jì)算序列同一性百分比的參數(shù)包括，但不限于：矩陣＝PAM，k-tuple＝2，錯(cuò)配罰分＝1，加入罰分＝20，隨機(jī)組長(zhǎng)度＝0，截止分?jǐn)?shù)＝1，缺口罰分＝5，缺口大小罰分0.05，窗口大?。?00或目標(biāo)氨基酸序列中較短者的長(zhǎng)度。

如果參照序列因N末端或C末端添加或缺失而非因內(nèi)部添加或缺失而比查詢序列短或長(zhǎng)，則可進(jìn)行手動(dòng)校正，因?yàn)楫?dāng)計(jì)算序列同一性百分比時(shí)，F(xiàn)ASTDB程序不負(fù)責(zé)參照序列的N末端和C末端截短或添加。對(duì)于相對(duì)于參照序列在N或C末端被截短的查詢序列，通過將未被匹配/對(duì)齊的處于參照序列的N和C末端的查詢序列的殘基的數(shù)目計(jì)算為占查詢序列的總堿基的百分比來校正序列同一性百分比。FASTDB序列比對(duì)的結(jié)果確定匹配/比對(duì)。隨后從序列同一性百分比(使用指定的參數(shù)通過上述FASTDB程序計(jì)算的)扣除比對(duì)百分?jǐn)?shù)，以獲得最終的序列同一性百分比評(píng)分。該校正的評(píng)分可用于確定比對(duì)如何彼此“對(duì)應(yīng)”，以及序列同一性百分?jǐn)?shù)的目的。延伸通過查詢序列的N或C末端的參考序列的殘基可被考慮用于手動(dòng)調(diào)整序列同一性百分比評(píng)分的目的。也就是說，當(dāng)手動(dòng)調(diào)整序列同一性百分比評(píng)分或比對(duì)編號(hào)時(shí)，可對(duì)與比較序列的N或C末端不匹配/對(duì)齊的殘基進(jìn)行計(jì)數(shù)。

例如，將90個(gè)氨基酸殘基的查詢序列與100個(gè)殘基的參考序列對(duì)齊，以測(cè)定同一性百分比。缺失發(fā)生在查詢序列的N末端，因此，F(xiàn)ASTDB比對(duì)不顯示在N末端上的前10個(gè)殘基的匹配/比對(duì)。10個(gè)未配對(duì)的殘基代表10％的參照序列(不匹配的N和C末端上的殘基的數(shù)目/參照序列中的殘基的總數(shù))，因此從通過FASTDB程序計(jì)算的序列同一性百分比評(píng)分扣除10％。如果剩余的90個(gè)殘基完全匹配(100％對(duì)齊)，則最終的序列同一性百分比為90％(100％對(duì)齊-10％未匹配的突出)。在另一實(shí)例中，除缺失是內(nèi)部缺失外，將90個(gè)殘基的查詢序列與100個(gè)殘基的參照序列相比較。在該情況下，不對(duì)通過FASTDB計(jì)算的序列同一性百分比進(jìn)行手動(dòng)校正，因?yàn)樵谀繕?biāo)序列的N或C末端上不存在與查詢序列不匹配/對(duì)齊的殘基。在另一個(gè)實(shí)例中，將110個(gè)氨基酸的查詢序列與100個(gè)殘基的參照序列比對(duì)，以測(cè)定序列同一性百分比。查詢序列中的添加發(fā)生在該查詢序列的N末端，因此，F(xiàn)ASTDB比對(duì)可以不顯示N-末端上的前10個(gè)殘基的匹配/對(duì)齊。如果查詢序列的其余100個(gè)氨基酸殘基與參照序列的整個(gè)長(zhǎng)度具有95％序列同一性，則查詢序列的N末端添加將被忽略，且查詢序列與對(duì)參照序列的同一性百分比將為95％。

如此處所用，術(shù)語“保守取代”是指由另一個(gè)生物學(xué)相似的殘基對(duì)氨基酸殘基的替代。用于該目的的保守取代可被定義為如下表中所示的?？筛鶕?jù)物理性質(zhì)以及對(duì)二級(jí)和三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)來對(duì)氨基酸進(jìn)行分類。保守取代在本領(lǐng)域被公認(rèn)為一個(gè)氨基酸對(duì)具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸的取代。示例性保守取代在下面示于表I中。

表I:保守取代

或者，可如Lehninger(1975)Biochemistry，第2版；Worth Publishers，第71-77頁中所述對(duì)保守氨基酸進(jìn)行分組，如下面表II中所示的。

表II：保守取代

還有其它替代方案，示例性保守取代示于下面表III中。

表III:保守取代

如本文中針對(duì)多肽和多核苷酸所用的，術(shù)語“分離的”意指：(i)通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體外擴(kuò)增的；(ii)通過克隆重組產(chǎn)生的；(iii)如通過裂解和凝膠分離純化的；或(iv)通過例如化學(xué)合成法合成的。分離的多核苷酸是可通過本領(lǐng)域中公知的重組DNA技術(shù)容易地操作的多核苷酸。因此，其中5’和3’限制性位點(diǎn)是已知的或針對(duì)其的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列已被公開的載體中所含的核苷酸序列，被認(rèn)為是分離的，但以其天然狀態(tài)存在于其天然宿主中的多核苷酸序列被認(rèn)為不是分離的。分離的多肽和多核苷酸可以是基本上純化的，但不必是基本上純化的。例如，在克隆或表達(dá)載體內(nèi)分離的多核苷酸不是純的，因?yàn)槠淇稍谄渌嬖诘募?xì)胞中只包含極少百分?jǐn)?shù)的材料。然而，正如所述術(shù)語在本文中所使用的，這樣的多核苷酸是分離的，因?yàn)槠淇赏ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來容易地操作。

如本文中所用，當(dāng)將編碼序列與調(diào)控序列以諸如將所述編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄置于所述調(diào)控序列的影響或控制之下的此類方式共價(jià)連接時(shí)，它們被認(rèn)為是“可操作地連接的”。如果期望編碼序列被翻譯成功能性蛋白質(zhì)，則如果在5’調(diào)控序列中引入啟動(dòng)子導(dǎo)致編碼序列的轉(zhuǎn)錄，以及如果兩個(gè)DNA序列之間的鍵聯(lián)的性質(zhì)不(1)導(dǎo)致移碼突變，(2)干擾啟動(dòng)子區(qū)指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾對(duì)應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)的能力，則兩個(gè)DNA序列被認(rèn)為被可操作地連接。因此，如果啟動(dòng)子區(qū)能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA序列的轉(zhuǎn)錄以便所得的轉(zhuǎn)錄物可被翻譯成所需的蛋白質(zhì)或多肽，則所述啟動(dòng)子區(qū)可被可操作地連接于所述編碼序列。

基因表達(dá)所需的調(diào)控序列的精確性質(zhì)在物種或細(xì)胞類型之間可變化，但通常根據(jù)需要可包括分別牽涉轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始的5’非轉(zhuǎn)錄序列和5’非翻譯序列，諸如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特別地，此類5’非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包括啟動(dòng)子區(qū)，其包括用于可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子序列。調(diào)控序列還可按需要包括增強(qiáng)子序列或上游激活子序列。

如本文中所用，“載體”可以是可通過限制和連接向其中插入所需序列，以在不同遺傳環(huán)境之間運(yùn)輸或用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的許多多核苷酸中的任何多核苷酸。載體通常由DNA組成，盡管RNA載體也是可用的。載體包括，但不限于，質(zhì)粒和噬菌粒?？寺≥d體是能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制，并且可被一個(gè)或多個(gè)內(nèi)切核酸酶限制性位點(diǎn)進(jìn)一步表征的載體，在所述內(nèi)切核酸酶限制性位點(diǎn)上，可以以可確定的方式切割載體，并可將所需的DNA序列連接于其中，以便新的重組載體保留其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力。在質(zhì)粒的情況下，所需序列的復(fù)制可隨著質(zhì)粒在宿主細(xì)菌內(nèi)的拷貝數(shù)增加發(fā)生許多次，或在宿主通過有絲分裂復(fù)制之前每宿主只發(fā)生一次。在噬菌體的情況下，復(fù)制可在裂解期中主動(dòng)發(fā)生或在溶原期中被動(dòng)地發(fā)生。表達(dá)載體是可通過限制和連接向其中插入所需的DNA序列，以便其被可操作地連接于調(diào)控序列并可被表達(dá)為RNA轉(zhuǎn)錄物的載體。載體還可含有一個(gè)或多個(gè)適合用于鑒定和選擇已用載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的標(biāo)志序列。標(biāo)志包括例如編碼增強(qiáng)或減弱對(duì)抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白質(zhì)的基因，編碼其活性可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定來檢測(cè)的酶(例如，β-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶)的基因，和明顯影響轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、宿主、菌落或噬斑的表型的基因。在一些實(shí)施方案中，所述載體能夠自主復(fù)制和表達(dá)存在于與它們可操作地連接的DNA區(qū)段中的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物。

新型抗HeV和NiV F糖蛋白抗體或抗體片段

本發(fā)明部分地來源于選擇性結(jié)合并抑制亨德拉和尼帕病毒的新型抗體或抗體片段的開發(fā)、分離和表征。如在下文中更全面描述的，已顯示這些抗體或抗體片段結(jié)合F糖蛋白，并減少或阻斷亨德拉和尼帕病毒的感染。與HeV和NiV糖蛋白F上的中和表位締合的抗HeV和NiV Fab片段的互補(bǔ)位由表A和SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:48中描述的免疫球蛋白重鏈和輕鏈區(qū)的氨基酸(aa)序列來界定。另外的抗體、抗體片段以及相關(guān)序列通過SEQ ID NO:49-80來公開。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離形式的和藥物制劑形式的選擇性結(jié)合亨德拉和尼帕F糖蛋白的全長(zhǎng)抗體或其抗體片段。類似地，如下文中所述，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸、載體、利用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及包含分離的多肽的組合物和藥物制劑，所述分離的多核苷酸編碼全長(zhǎng)亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體和/或抗體片段。最后，本發(fā)明提供了如在下文中更全面描述的方法，所述方法將這些抗體和多核苷酸應(yīng)用于亨德拉病毒性疾病或尼帕病毒性疾病的體外和體內(nèi)診斷、預(yù)防和治療中。

亨德拉和尼帕單克隆抗體m5B3(鼠5B3)、h5B3(人源化5B3)和h5B3.1(人源化5B3.1)的抗原結(jié)合Fab部分以及相關(guān)的V_H、V_L、FR和CDR區(qū)的完整氨基酸序列列于表A中和公開于本文中。SEQ ID NO:1、17和33公開了亨德拉和尼帕單克隆抗體的Fd片段的氨基酸序列。重鏈FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4區(qū)的氨基酸序列公開為(FR1，SEQ ID NO:2、18和34)；(CDR1，SEQ ID NO:3、19和35)；(FR2，SEQ ID NO:4、20和36)；(CDR2，SEQ ID NO:5、21和37)；(FR3，SEQ ID NO:6、22和38)；(CDR3，SEQ ID NO:7、23和39)；以及(FR4，SEQ ID NO:8、24和40)。SEQ ID NO:9、25和41公開了亨德拉和尼帕抗體的輕鏈可變片段的氨基酸序列。輕鏈FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4區(qū)的氨基酸序列被公開為(FR1，SEQ ID NO:10、26和42)；(CDR1，SEQ ID NO:11、27和43)；(FR2，SEQ ID NO:12、28和44)；(CDR2，SEQ ID NO:13、29和45)；(FR3，SEQ ID NO:14、30和46)；(CDR3，SEQ ID NO:15、31和47)；(FR4，SEQ ID NO:16、32和48)。

現(xiàn)于本領(lǐng)域中已被確認(rèn)的是，哺乳動(dòng)物抗體的非CDR區(qū)可被同種或異種抗體的相似區(qū)域替代，同時(shí)保留原始抗體的表位特異性。這在其中將非人CDR共價(jià)連接于人FR和/或Fc/pFc’區(qū)以產(chǎn)生功能性抗體的“人源化”抗體的開發(fā)和使用中得到最明確的證明。因此，例如，PCT國(guó)際公開號(hào)WO 92/04381教導(dǎo)了其中至少一部分鼠FR區(qū)已被人的FR區(qū)替代的人源化鼠RSV抗體的產(chǎn)生和使用。

因此，如對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的，本發(fā)明還提供了亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體的F(ab’)₂、Fab、Fv、Fd和ScFv片段；其中亨德拉和尼帕抗體的Fc和/或FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4和/或CDR1和/或CDR2和/或CDR3區(qū)已被同源的人或非人序列替代的嵌合抗體；其中亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體的FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4和/或CDR1和/或CDR2和/或CDR3區(qū)已被同源的人或非人序列替代的嵌合F(ab')₂片段；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或CDR3區(qū)已被同源的人或非人序列替代的嵌合Fab片段；其中FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4和/或CDR1和/或CDR2和/或CDR3區(qū)已被同源的人或非人序列取代的嵌合Fd片段抗體；和其中FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4和/或CDR1和/或CDR2和/或CDR3區(qū)已被同源的人或非人序列替代的ScFv。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過構(gòu)建含有所有公開的重鏈和輕鏈V-區(qū)CDR氨基酸序列或其部分的CDR移植的或嵌合的抗體或抗體片段來改變亨德拉和尼帕抗體(Jones,P.T.等1986Nature 321:522-525；Verhoeyen,M.等1988Science 39:1534-1536；和Tempest,P.R.等1991Biotechnology 9:266-271)，而不破壞抗體對(duì)于F糖蛋白表位的特異性。此類FR或CDR移植的或嵌合的抗體或抗體片段在動(dòng)物(例如，馬)和人的亨德拉或尼帕病毒感染的預(yù)防和治療中是有效的。

在一些實(shí)施方案中，可產(chǎn)生其中亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體的一些或全部FR區(qū)已被其它同源的人FR區(qū)替代的抗體和/或抗體片段。另外，可替代Fc部分以產(chǎn)生具有亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體的一些或全部CDR的IgA或IgM以及IgG抗體。特別重要的是包含亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體重鏈CDR，其次是包含亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體的其它CDR。此類人源化抗體和/或抗體片段具有特殊效用，因?yàn)樗鼈儾徽T發(fā)針對(duì)抗體本身的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的抗體或其抗體片段，其中所述抗體包含：包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的重鏈可變區(qū)，所述互補(bǔ)決定區(qū)具有選自由SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、35、37和39組成的組的氨基酸序列；和包含至少一個(gè)CDR的輕鏈可變區(qū)，所述CDR具有選自由SEQ ID NO:11、13、15、27、29、31、43、45和47組成的組的氨基酸序列。具體地，本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的抗體或其抗體片段，其中所述抗體包含：包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的重鏈可變區(qū)，所述互補(bǔ)決定區(qū)具有選自由SEQ ID NO:35、37和39組成的組的氨基酸序列；和包含至少一個(gè)CDR的輕鏈可變區(qū)，所述CDR具有選自由SEQ ID NO:43、45和47組成的組的氨基酸序列。

本發(fā)明公開了可包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重鏈CDR1的抗體或抗體片段，可包含含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重鏈CDR2的抗體或抗體片段；和/或可包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重鏈CDR3的抗體或抗體片段。另外，本發(fā)明公開了可包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的輕鏈CDR1的抗體或抗體片段，可包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的輕鏈CDR2的抗體或抗體片段；和/或可包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的輕鏈CDR3的抗體或抗體片段。

本發(fā)明公開了包含與SEQ ID NO:1、17或33具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重鏈可變區(qū)的抗體或抗體片段。本發(fā)明公開了包含具有SEQ ID NO:1、17或33的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，所述抗體片段是ScFv、Fab、F(ab’)₂或Fd。

本發(fā)明公開了包含與SEQ ID NO:19、25或41具有至少90％或99％序列同一性的輕鏈可變區(qū)的抗體或抗體片段。本發(fā)明公開了包含具有SEQ ID NO:9、25或41的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，所述抗體片段是ScFv、Fab或F(ab’)₂。

本發(fā)明公開了包含具有SEQ ID NO:1、17或33的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及具有SEQ ID NO:9、25或41的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體或抗體片段。

本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段包含含有選自由以下序列組成的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的重鏈：包含SEQ ID NO:2、18或34的FR1區(qū)、包含SEQ ID NO:4、20或36的FR2區(qū)、包含SEQ ID NO:6、22或38的FR3區(qū)和包含SEQ ID NO:8、24或40的FR4區(qū)。另外，本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段包含含有選自由以下序列組成的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的輕鏈：包含SEQ ID NO:10、26或42的FR1區(qū)、包含SEQ ID NO:12、28或44的FR2區(qū)、包含SEQ ID NO:14、30或46的FR3區(qū)以及包含SEQ ID NO:16、32或48的FR4區(qū)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了包含V_H和V_L的ScFv抗體片段，所述V_H和V_L具有選自由SEQ ID NO:1,17、33、9、25和41組成的組的序列。所述V_H與V_L可通過具有2-50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度的連接體肽連接。在一些實(shí)施方案中，所述ScFv片段可包含SEQ ID NO:33的V_H和SEQ ID NO:41的V_L，其中所述連接體肽可包含10-25個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述連接體肽可包含SEQ ID NO:52。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段包含含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的重鏈，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列選自由以下序列組成的組：包含SEQ ID NO:34的FR1區(qū)、包含SEQ ID NO:36的FR2區(qū)、包含SEQ ID NO:38的FR3區(qū)和包含SEQ ID NO:40的FR4區(qū)，以及包含含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的輕鏈，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列選自由以下序列組成的組：包含SEQ ID NO:42的FR1區(qū)、包含SEQ ID NO:44的FR2區(qū)、包含SEQ ID NO:46的FR3區(qū)和包含SEQ ID NO:48的FR4區(qū)。

本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的人源化抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:17或33具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段包含具有SEQ ID NO:17或33的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白的人源化抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:25或41具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段包含具有SEQ ID NO:25或41的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了包含重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈和/或輕鏈可變區(qū)與以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏號(hào)PTA-120575保藏的FreeStyle^TM 293細(xì)胞中包含的質(zhì)粒上編碼的抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了包含重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)具有與以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏號(hào)PTA-120575保藏的FreeStyle^TM 293細(xì)胞中包含的質(zhì)粒上編碼的抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)相同的序列。

本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白表位的人源化抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段抑制亨德拉或尼帕病毒感染。本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白表位的人源化抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段破壞病毒宿主膜融合。本發(fā)明公開了選擇性結(jié)合亨德拉病毒或尼帕病毒F糖蛋白表位的人源化抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段阻斷F糖蛋白折疊。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段通過破壞病毒宿主膜融合抑制亨德拉或尼帕病毒感染。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段通過阻斷F糖蛋白折疊破壞病毒宿主膜融合。

根據(jù)本發(fā)明，還可能產(chǎn)生包含非人序列的嵌合抗體或抗體片段。因此，可使用例如鼠、羊、馬、牛或其它哺乳動(dòng)物Fc或FR序列來替代亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體的一些或全部Fc或FR區(qū)。同樣地可替代一些CDR。此類嵌合抗體或抗體片段具有與人亨德拉和尼帕F糖蛋白抗體的CDR混合的非人免疫球蛋白序列。這些抗體或抗體片段可以，除其它以外，進(jìn)行短期使用或用于經(jīng)免疫抑制的個(gè)體。亨德拉和尼帕病毒也感染動(dòng)物，因而此類抗體可短期使用或用于經(jīng)免疫抑制的受試者。

對(duì)于接種或預(yù)防使用，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是包括Fc區(qū)域的全長(zhǎng)抗體分子。此類全長(zhǎng)抗體可具有比較小的抗體片段(例如，F(xiàn)ab)更長(zhǎng)的半衰期，并且更加適合用于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或經(jīng)皮膚施用。

在一些實(shí)施方案中，可使用Fab片段和其它抗體片段，包括但不限于嵌合Fab片段。對(duì)于該治療模式，F(xiàn)ab提供優(yōu)于F(ab’)₂和完整免疫球蛋白分子的若干優(yōu)勢(shì)。首先，因?yàn)镕ab只具有一個(gè)針對(duì)它們的同源抗原的結(jié)合位點(diǎn)，從而排除了免疫復(fù)合物的形成，然而當(dāng)雙價(jià)F(ab’)₂和完整的免疫球蛋白分子遇到它們的靶抗原時(shí)，可生成此類復(fù)合物。這具有一定的重要意義，因?yàn)槌练e在組織中的免疫復(fù)合物可產(chǎn)生不良炎癥反應(yīng)。第二，因?yàn)镕ab片段缺乏Fc區(qū)，所以它們一般不能觸發(fā)由Fc激活的不良炎癥反應(yīng)，諸如補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的激活。第三，小的Fab分子的組織穿透力可能比較大的完整抗體的組織穿透力好得多。第四，可在細(xì)菌諸如大腸桿菌(E.coli,)中容易且廉價(jià)地產(chǎn)生Fab片段，然而完整的免疫球蛋白抗體分子需要哺乳動(dòng)物細(xì)胞來用于以有用的量產(chǎn)生它們。后者必需將免疫球蛋白序列轉(zhuǎn)染進(jìn)具有所得的轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。隨后必須通過嚴(yán)格選擇方法來實(shí)現(xiàn)這些序列的擴(kuò)增，并且必須鑒定和維持穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。必須通過培養(yǎng)物中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的高表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生完整的免疫球蛋白分子，這伴隨含血清培養(yǎng)基的問題。相反地，在大腸桿菌中生產(chǎn)Fab消除了這些困難，并且使得可能在大發(fā)酵罐中產(chǎn)生這些抗體片段，其比細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的產(chǎn)物便宜。

除了Fab片段以外，還可將具有對(duì)于由亨德拉和尼帕抗體確定的表位的結(jié)合特異性的較小的抗體片段和表位結(jié)合肽用于結(jié)合或抑制所述病毒。例如，可按照屬于Ladner等的美國(guó)專利號(hào)4,946,778的方法構(gòu)建單鏈抗體。單鏈抗體片段(例如ScFv)包含通過柔性接頭部分聯(lián)接的輕鏈和重鏈的可變區(qū)。甚至更小的是稱為單結(jié)構(gòu)域抗體或Fd的抗體片段，其包含分離的V_H單結(jié)構(gòu)域。用于獲得具有至少一定的它們所源自的全長(zhǎng)抗體的結(jié)合特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。

有可能在無需過度實(shí)驗(yàn)的情況下，確定改變的或嵌合的抗體或抗體片段是否具有與亨德拉和尼帕抗體相同的特異性(通過確定前者是否阻斷后者與F糖蛋白的結(jié)合)。如果所測(cè)試的抗體或其片段與已知的亨德拉或尼帕抗體競(jìng)爭(zhēng)(如通過亨德拉或尼帕抗體的結(jié)合的減少顯示的)，則所述兩種抗體和/或抗體片段可能結(jié)合相同的或緊密間隔的表位。確定抗體是否具有已知的亨德拉和尼帕抗體或抗體片段的特異性的另一種方式是將已知的亨德拉或尼帕抗體和通常與其具有反應(yīng)性的F糖蛋白預(yù)溫育，隨后添加所測(cè)試的抗體或抗體片段以確定所測(cè)試的抗體或抗體片段在其結(jié)合F糖蛋白的能力方面是否被抑制。如果所測(cè)試的抗體或抗體片段被抑制，則完全有可能地，其可能具有與本發(fā)明的已知的亨德拉和尼帕抗體或抗體片段相同或功能上等同的表位和特異性。還可通過利用亨德拉或尼帕病毒和確定mAb是否中和所述病毒來進(jìn)行亨德拉和尼帕抗體或抗體片段的篩選。

通過使用本發(fā)明的抗體或抗體片段，現(xiàn)可能產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體或抗體片段，所述抗獨(dú)特型抗體或抗體片段可用于篩選其它抗體或抗體片段以鑒定所述抗體或抗體片段是否具有與本發(fā)明的抗體相同的結(jié)合特異性。另外，此類抗獨(dú)特型抗體或抗體片段可用于主動(dòng)免疫(Herlyn,D.等1986Science 232:100-102)?？墒褂霉碾s交瘤技術(shù)(Kohler,G.和Milstein,C.1975Nature 256:495-497)產(chǎn)生此類抗獨(dú)特型抗體或抗體片段?？躬?dú)特型抗體或抗體片段是識(shí)別存在于由目標(biāo)細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體上的獨(dú)特決定簇的抗體或抗體片段。這些決定簇位于抗體的高變區(qū)。正是該結(jié)合給定的表位的區(qū)域負(fù)責(zé)抗體的特異性。可通過用目標(biāo)抗體或抗體片段免疫動(dòng)物來制備抗獨(dú)特型抗體。所述免疫的動(dòng)物將識(shí)別并響應(yīng)于所述免疫抗體的獨(dú)特型決定簇，并產(chǎn)生針對(duì)這些獨(dú)特型決定簇的抗體。通過使用免疫動(dòng)物的抗獨(dú)特型抗體或抗體片段(所述抗體或抗體片段對(duì)于本發(fā)明的抗體或抗體片段是特異的)，有可能鑒定具有與用于免疫的雜交瘤的抗體或抗體片段相同的獨(dú)特型的其它克隆。兩個(gè)細(xì)胞系的抗體或抗體片段之間的獨(dú)特型同一性證明兩個(gè)抗體和/或抗體片段在它們對(duì)相同表位決定簇的識(shí)別方面是相同的。因此，通過使用抗同種型抗體或抗體片段，有可能鑒定表達(dá)具有相同表位特異性的抗體或抗體片段的其它雜交瘤。

還可能使用抗獨(dú)特型技術(shù)來產(chǎn)生模擬表位的抗體或抗體片段。例如，針對(duì)第一抗體產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體或抗體片段將在高變區(qū)中具有為由所述第一抗體結(jié)合的表位的影像的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，所述抗獨(dú)特型抗體可用于免疫，因?yàn)榭躬?dú)特型抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域有效地用作抗原。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)及其保守取代的F糖蛋白抗體和/或抗體片段。上文中描述了所述抗體或抗體片段的特定序列。在一個(gè)方面，所述取代在性質(zhì)上是保守的；然而，本發(fā)明包括也是非保守的取代。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的肽或多肽的定義意欲包括具有除氨基酸殘基的插入、缺失或取代外的修飾的多肽。作為示例，所述修飾在性質(zhì)上可以是共價(jià)的，并且包括例如與聚合物、脂質(zhì)或其它有機(jī)和無機(jī)部分的化學(xué)結(jié)合。此類衍生物可被制備來增加多肽的循環(huán)半衰期，或可被設(shè)計(jì)來提高所述多肽對(duì)于所需細(xì)胞、組織或器官的靶向能力。類似地，本發(fā)明還包括已被共價(jià)地修飾來包括一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物連接物(諸如聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇)的FGFBP3或其變體。

編碼抗HeV和NiV F糖蛋白抗體或抗體片段的多核苷酸

鑒于本文中的針對(duì)F糖蛋白的亨德拉和尼帕抗體或抗體片段的重鏈Fd和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員現(xiàn)使得能夠產(chǎn)生編碼該抗體或編碼上述各種抗體片段或嵌合抗體的多核苷酸。設(shè)想此類多核苷酸將被可操作地聯(lián)接于其它多核苷酸，從而形成用于克隆或表達(dá)本發(fā)明的抗體的重組載體。本發(fā)明包括含有編碼序列或其部分的任何重組載體，無論用于原核生物還是真核生物的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或基因療法。此類載體可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)來制備，并且可包含亨德拉和尼帕抗體的免疫球蛋白V區(qū)(包括框架和CDR或其部分)的DNA編碼序列，和具有(Whittle,N.等1987Protein Eng 1:499-505和Burton,D.R.等1994Science266:1024-1027)或不具有(Marasco,W.A.等1993Proc Natl Acad Sci USA90:7889-7893和Duan,L.等1994Proc Natl Acad Sci USA 91:5075-5079)用于輸出或分泌的信號(hào)序列的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，將此類載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入原核(Huse,W.D.等1989Science 246:1275-1281；Ward,S.等1989Nature 341:544-546；Marks,J.D.等1991J Mol Biol 222:581-597；和Barbas,C.F.等1991Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982)或真核(Whittle,N.等1987Protein Eng 1:499-505和Burton,D.R.等1994Science 266:1024-1027)細(xì)胞，或用于基因療法(Marasco,W.A.等1993Proc Natl Acad Sci USA 90:7889-7893和Duan,L.等1994Proc Natl Acad Sci USA 91:5075-5079)。

本發(fā)明的表達(dá)載體包括可操作地聯(lián)接于編碼本發(fā)明的抗體之一的核苷酸序列的調(diào)控序列。如本文中所用，術(shù)語“調(diào)控序列”意指為編碼所需的多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄所必需的或有助于所述轉(zhuǎn)錄的，和/或?yàn)樗玫霓D(zhuǎn)錄物至所需的多肽的翻譯所必需的或有助于所述翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列包括，但不限于，5’序列諸如操縱子、啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合序列，以及3’序列諸如多腺苷酸化信號(hào)。本發(fā)明的載體可任選地包括5’前導(dǎo)序列或信號(hào)序列，編碼幫助蛋白質(zhì)純化的融合產(chǎn)物的5’或3’序列和幫助轉(zhuǎn)化體的鑒定或選擇的各種標(biāo)記。適當(dāng)?shù)妮d體的選擇和設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力和判定能力內(nèi)?？贵w的隨后純化可通過本領(lǐng)域中已知的多種標(biāo)準(zhǔn)方法中的任何一種來實(shí)現(xiàn)。

在一些實(shí)施方案中，用于篩選抗體或抗體片段的載體可以是含有編碼融合多肽并且能夠表達(dá)其的核苷酸序列的重組DNA分子，所述融合多肽以氨基末端至羧基末端的方向包含：(1)原核生物分泌信號(hào)結(jié)構(gòu)域，(2)本發(fā)明的多肽和，任選地，(3)融合蛋白結(jié)構(gòu)域。所述載體可以包括或可以不包括用于表達(dá)所述融合多肽的DNA調(diào)控序列，例如原核生物調(diào)控序列。此類載體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建，并且已由Smith,G.P.等(1985,Science 228:13151317)；Clackson,T.等(1991,Nature352:624-628)；Kang等(1991,Methods:A Companion to Methods in Enzymology，第2卷，R.A.Lerner和D.R.Burton，編輯Academic Press,NY，第111-118頁)；Barbas,C.F.等(1991,Proc Natl Acad Sci USA88:7978-7982)；Roberts,B.L.等(1992,Proc Natl Acad Sci USA89:2429-2433)描述。

融合多肽可用于本發(fā)明的抗體或抗體片段的純化。所述融合結(jié)構(gòu)域可以例如包括允許在Ni⁺柱或麥芽糖結(jié)合蛋白上純化商購可得的載體pMAL(New England BioLabs,Beverly,MA)的多聚-His尾。在一些實(shí)施方案中，所述融合結(jié)構(gòu)域是絲狀噬菌體膜錨著點(diǎn)。該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诤Y選單克隆抗體的噬菌體展示文庫是特別有用的，但對(duì)于抗體的大量產(chǎn)生可能不太實(shí)用。在一些實(shí)施方案中，所述絲狀噬菌體膜錨著點(diǎn)是能夠與絲狀噬菌體顆粒的基質(zhì)締合的cpIII或cpVIII外殼蛋白的結(jié)構(gòu)域，從而將所述融合多肽并入至噬菌體表面上，以使得能夠?qū)μ囟乖虮砦贿M(jìn)行固相結(jié)合，并從而允許富集和選擇由噬菌粒載體編碼的特定抗體或片段。

所述分泌信號(hào)通常是將蛋白質(zhì)靶向宿主細(xì)胞的膜，諸如革蘭陰性細(xì)菌的周質(zhì)膜的蛋白質(zhì)的前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，大腸桿菌的分泌信號(hào)是pelB分泌信號(hào)。pelB蛋白的前導(dǎo)序列先前已被用作融合蛋白的分泌信號(hào)(Better,M.等1988Science 240:1041-1043；Sastry,L.等1989Proc Natl Acad Sci USA 86:5728-5732；和Mullinax,R.L.等，1990Proc Natl Acad Sci USA 87:8095-8099)。用于本發(fā)明的來自大腸桿菌的其它分泌信號(hào)多肽結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基序列可見于Neidhard,F.C.(編輯),1987in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium:Typhimurium Cellular and Molecular Biology,American Society for Microbiology,Washington,D.C。

為了在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高水平的基因表達(dá)，可能必需不僅使用強(qiáng)啟動(dòng)子來生成大量mRNA，而且還要使用核糖結(jié)合位點(diǎn)來確保所述mRNA被高效翻譯。在大腸桿菌中，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括起始密碼子(AUG)和位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸的3-9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列(Shine J.和Dalgarno L.1975Nature 254:34-38)。被稱為Shine-Dalgarno(SD)序列的序列與大腸桿菌16S rRNA的3’末端互補(bǔ)。核糖體對(duì)mRNA和mRNA的3’末端上的序列的結(jié)合可受若干因素影響：SD序列與16S rRNA的3’末端之間的互補(bǔ)性的程度；存在于SD序列與AUG之間的間距；和AUG之后的核苷酸序列，其影響核糖體結(jié)合。所述3’調(diào)控序列確定至少一個(gè)與異源融合多肽在框內(nèi)并與其可操作地聯(lián)接的終止(中止)密碼子。

在關(guān)于原核生物表達(dá)宿主的一些實(shí)施方案中，所使用的載體包括原核生物復(fù)制起始點(diǎn)或復(fù)制子，即，具有指導(dǎo)重組DNA分子在利用其轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞，諸如細(xì)菌宿主細(xì)胞中染色體外自主復(fù)制和維持的能力的DNA序列。此類復(fù)制起始點(diǎn)在本領(lǐng)域中是公知的。在一些實(shí)施方案中，所述復(fù)制起始點(diǎn)是在宿主生物體中是高效的那些復(fù)制起始點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在一些實(shí)施方案中，為了載體在大腸桿菌中的使用，所述復(fù)制起始點(diǎn)是在pBR322和多種其它常用質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的ColEI。在一些實(shí)施方案中，所述起始點(diǎn)是在pACYC及其衍生物中發(fā)現(xiàn)的p15A復(fù)制起始點(diǎn)。所述ColEI和p15A復(fù)制子已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)，可在多種質(zhì)粒上獲得，并且由Sambrook等，1989，于Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press中進(jìn)行了描述。

另外，包括原核生物復(fù)制子的那些實(shí)施方案還可包括其表達(dá)賦予利用其轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主選擇優(yōu)勢(shì)(諸如藥物抗性)的基因。典型的細(xì)菌藥物抗性基因是賦予對(duì)氨芐青霉素、四環(huán)素、新霉素/卡那霉素或氯霉素的抗性的那些基因。載體通常還含有用于插入可翻譯的DNA序列的方便的限制性位點(diǎn)。示例性載體是質(zhì)粒pUC18和pUC19及衍生的載體，諸如可從提供商諸如Invitrogen(San Diego,CA)商購獲得的那些載體。

當(dāng)本發(fā)明的抗體或抗體片段包括重鏈和輕鏈序列時(shí)，可在分開的載體上編碼這些序列，或更方便地，所述序列可由單個(gè)載體表達(dá)。所述重鏈和輕鏈可以在翻譯后或分泌后形成天然抗體分子的異二聚體結(jié)構(gòu)。這樣的異二聚體抗體可以通過或可以不通過重鏈與輕鏈之間的二硫鍵來穩(wěn)定。

用于異二聚體抗體或抗體片段，諸如本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體或本發(fā)明的ScFv、F(ab’)₂、Fab或Fv片段抗體的表達(dá)的載體，是經(jīng)改造適用于接受和表達(dá)可翻譯的第一和第二DNA序列的重組DNA分子。即，用于表達(dá)異二聚體抗體的DNA表達(dá)載體提供了用于獨(dú)立地將兩個(gè)可翻譯的DNA序列克隆(插入)進(jìn)存在于載體中的兩個(gè)單獨(dú)的盒中，以形成用于表達(dá)異二聚體抗體的第一和第二多肽的兩個(gè)分開的順反子。用于表達(dá)兩個(gè)順反子的DNA表達(dá)載體被稱為雙順反子表達(dá)載體。

在一些實(shí)施方案中，所述載體包含第一盒，其包括通過經(jīng)改造適用于插入DNA的定向連接的核苷酸序列可操作地聯(lián)接的上游和下游DNA調(diào)控序列。所述上游可翻譯序列可編碼如上所述的分泌信號(hào)。所述盒包括用于表達(dá)第一抗體多肽的DNA調(diào)控序列，當(dāng)可翻譯插入DNA序列(插入DNA)通過經(jīng)改造適用于定向連接的核苷酸序列被定向插入盒中時(shí)，產(chǎn)生所述第一抗體多肽。

所述雙順反子表達(dá)盒還含有用于表達(dá)第二抗體多肽的第二盒。所述第二盒包括第二可翻譯DNA序列，其可編碼如上所述的通過經(jīng)改造適用于定向連接載體的下游DNA序列的核苷酸序列可操作地聯(lián)接在其3’末端的分泌信號(hào)，所述下游DNA序列通常確定所述盒的閱讀框架內(nèi)的至少一個(gè)終止密碼子。可將所述第二可翻譯DNA序列在其5’末端可操作地聯(lián)接于DNA調(diào)控序列，從而形成5’元件。所述第二盒，在插入可翻譯DNA序列(插入DNA)后，能夠表達(dá)包含分泌信號(hào)與由所述插入DNA編碼的多肽的第二融合多肽。

本發(fā)明的抗體或抗體片段可另外地由真核生物細(xì)胞諸如CHO細(xì)胞、人或小鼠雜交瘤、永生化B淋巴母細(xì)胞等產(chǎn)生。在該情況下，構(gòu)建其中將真核生物調(diào)控序列可操作地聯(lián)接于編碼所述抗體多肽或多個(gè)多肽的核苷酸序列的載體。適當(dāng)?shù)恼婧松镙d體的設(shè)計(jì)和選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力和判定能力之內(nèi)。所述抗體的隨后純化可通過本領(lǐng)域中已知的多種標(biāo)準(zhǔn)方法中的任一種來實(shí)現(xiàn)。

還可在植物中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或抗體片段。在1989年，Hiatt A.等1989Nature 342:76-78首先證明了可在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生功能性抗體。自此以后，已在開發(fā)用于抗體(或“植物抗體”)產(chǎn)生的植物中投入了相當(dāng)大量的努力(關(guān)于綜述，參見Giddings,G.等2000Nat Biotechnol18:1151-1155；Fischer,R.和Emans,N.2000Transgenic Res 9:279-299)?？蓪⒅亟M抗體靶向種子、根莖或果實(shí)，從而使得于此類植物組織中進(jìn)行抗體的施用有利于發(fā)展中國(guó)家中和世界范圍內(nèi)的免疫接種計(jì)劃。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的，并從而包括所述載體的宿主細(xì)胞(原核和真核生物的)。

診斷性和藥物抗HeV和NiV F糖蛋白抗體的制備

本發(fā)明還涉及用于制備包含本發(fā)明的抗體或抗體片段或編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段的多核苷酸序列的診斷性或藥物組合物的方法，所述藥物組合物用于亨德拉病毒性疾病或尼帕病毒性疾病的免疫預(yù)防或免疫治療。所述藥物制劑包括藥學(xué)上可接受的載體。如本文中所用，此類載體是指不干擾活性成分的生物活性的效力的無毒材料。術(shù)語“生理上可接受的”是指與生物系統(tǒng)諸如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或生物體相容的無毒材料。載體的特征將取決于施用途徑。生理上和藥學(xué)上可接受的載體包括本領(lǐng)域中公知的稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和其它材料。

可通過多種方法標(biāo)記本發(fā)明的抗亨德拉和抗尼帕F糖蛋白抗體或抗體片段以用于診斷和/或藥物應(yīng)用。存在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的許多不同的標(biāo)記和標(biāo)記方法。可用于本發(fā)明的標(biāo)記的類型的實(shí)例包括酶、放射性同位素、熒光化合物、膠體金屬、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解用于結(jié)合本發(fā)明的抗體或抗體片段的其它合適的標(biāo)記，或?qū)⒛軌蚴褂贸Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)確定此類標(biāo)記。此外，這些標(biāo)記與本發(fā)明的抗體或抗體片段的結(jié)合可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行。

可產(chǎn)生更大的靈敏度的另一種標(biāo)記技術(shù)由將所述抗體偶聯(lián)于低分子量半抗原組成。隨后可通過第二反應(yīng)特異性改變這些半抗原。例如，通常使用與與抗生物素蛋白反應(yīng)的的半抗原，諸如生物素，或與特定抗半抗原抗體反應(yīng)的二硝基苯酚、吡哆醛或熒光素。

用于本發(fā)明的測(cè)定的材料理想地適用于試劑盒的制備。此類試劑盒可包含被區(qū)劃來以密閉方式接收一個(gè)或多個(gè)容器裝置諸如小瓶、管等的運(yùn)載裝置，每一個(gè)容器裝置包含待用于所述方法的單獨(dú)的元件之一。例如，所述容器裝置之一可包含被或可被可檢測(cè)地標(biāo)記的本發(fā)明的抗體和/或抗體片段。所述試劑盒還可具有含有緩沖液的容器和/或包含結(jié)合于報(bào)告分子諸如酶促或熒光標(biāo)記的報(bào)告裝置諸如生物素-結(jié)合蛋白，諸如抗生物素蛋白或鏈霉親和素的容器。

體內(nèi)檢測(cè)和診斷

本發(fā)明的抗體或抗體片段適合用于體外用途，例如，用于其中可將它們?cè)谝合嘀惺褂没蚪Y(jié)合于固相載體的免疫測(cè)定。另外，這些免疫測(cè)定中的抗體或抗體片段可以以各種方式來檢測(cè)地標(biāo)記?？墒褂帽景l(fā)明的抗體或抗體片段的免疫測(cè)定的類型的實(shí)例是以直接或間接形式進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定。此類免疫測(cè)定的實(shí)例是放射免疫測(cè)定(RIA)和夾心(免疫計(jì)量)測(cè)定。使用本發(fā)明的抗體或抗體片段進(jìn)行的抗原的檢測(cè)可使用以正向、反向或同時(shí)模式運(yùn)行的免疫測(cè)定(包括對(duì)生理學(xué)樣本進(jìn)行的免疫組織化學(xué)測(cè)定)來進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，或可容易地確定其它免疫測(cè)定形式而無需過度實(shí)驗(yàn)。

可將本發(fā)明的抗體或抗體片段結(jié)合于許多不同的載體和用于檢測(cè)亨德拉或尼帕病毒的存在。公知的載體的實(shí)例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。對(duì)于本發(fā)明的目的，載體的性質(zhì)可以是可溶性的或不溶性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解用于結(jié)合抗體的其它合適的載體，或?qū)⒛軌蚴褂贸Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)確定此類載體。

為了本發(fā)明的目的，亨德拉或尼帕病毒，當(dāng)存在于生物體液和組織中時(shí)，可利用本發(fā)明的抗體或抗體片段來檢測(cè)?？墒褂煤锌蓹z測(cè)量的亨德拉或尼帕病毒的任何樣本。樣本可以是液體，諸如尿液、唾液、腦脊髓液、血液、血清等；固體或半固體諸如組織、糞便等；或，備選地，固體組織諸如通常用于組織學(xué)診斷的那些固體組織。

亨德拉或尼帕病毒的體內(nèi)檢測(cè)

在將本發(fā)明的抗體或抗體片段用于抗原的體內(nèi)檢測(cè)時(shí)，以診斷上有效的劑量提供可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體或抗體片段。術(shù)語“診斷上有效的”意指以使得能夠檢測(cè)具有所述抗體對(duì)于其是特異的亨德拉或尼帕病毒抗原的部位的充足量施用一定量的可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體。

施用的可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體或抗體片段的濃度應(yīng)當(dāng)是足夠的，以使得與亨德拉或尼帕病毒的結(jié)合相較于本底是可檢測(cè)的。另外，期望從循環(huán)系統(tǒng)快速清除所述可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體或抗體片段以提供最好的靶信號(hào)與本底信號(hào)的比率。

通常，用于體內(nèi)診斷的可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體或抗體片段的劑量將取決于此類因素如個(gè)體的年齡、性別和疾病程度而變化?？贵w或抗體片段的劑量可從約0.01mg/kg變化至約50mg/kg，例如從0.1mg/kg變化至約20mg/kg，或從約0.1mg/kg變化至約2mg/kg。此類劑量可以例如取決于是否給予多次注射、所測(cè)定的組織以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素而變化。

對(duì)于體內(nèi)診斷成像，可獲得的檢測(cè)儀器的類型在選擇適當(dāng)?shù)姆派湫酝凰貢r(shí)是主要因素。所選擇的放射性同位素必須具有一種類型的衰變，所述衰變對(duì)于給定的類型的儀器是可檢測(cè)的。選擇用于體內(nèi)診斷的放射性同位素時(shí)的另一個(gè)重要因素是所述放射性同位素的半衰期要足夠長(zhǎng)，以使得其在被靶最大吸收時(shí)仍然是可檢測(cè)的，但要足夠短，以使得針對(duì)宿主的有害輻射是可接受的。理想地，用于體內(nèi)成像的放射性同位素將缺乏粒子發(fā)射，但產(chǎn)生大量的在140-250keV范圍內(nèi)的光子，所述光子可利用常規(guī)γ照相機(jī)來容易地檢測(cè)到。

對(duì)于體內(nèi)診斷，可直接地或通過使用中間官能團(tuán)間接地將放射性同位素結(jié)合于抗體或抗體片段。通常用于結(jié)合作為金屬離子存在的放射性同位素的中間官能團(tuán)是雙功能螯合劑諸如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)及類似分子?？山Y(jié)合于本發(fā)明的抗體的金屬離子的常見實(shí)例為¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr和²⁰¹Tl。

對(duì)于體內(nèi)診斷的目的，本發(fā)明的抗體或抗體片段還可用順磁性同位素進(jìn)行標(biāo)記，如在磁共振成像(MRI)或電子自旋共振(ESR)中。一般地，可使用用于使診斷成像可視化的任何常規(guī)方法。通常地將發(fā)射γ射線和正電子的放射性同位素用于照相機(jī)成像，并且將順磁性同位素用于MRI。在此類技術(shù)中是特別有用的元素包括¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Cr和⁵⁶Fe。

可在體外和體內(nèi)使用本發(fā)明的抗體或抗體片段來監(jiān)測(cè)亨德拉病毒性疾病或尼帕病毒性疾病治療的過程。因此，例如，通過測(cè)量被亨德拉或尼帕病毒感染的細(xì)胞的數(shù)目的增加或減少，或存在于身體中或各種體液中的亨德拉或尼帕病毒的濃度的變化，有可能確定目的在于改善亨德拉病毒性疾病或尼帕病毒性疾病的特定治療方案是否有效。

亨德拉病毒性疾病和尼帕病毒性疾病的預(yù)防和治療

還可將所述抗體或抗體片段用于預(yù)防人和其它動(dòng)物的亨德拉病毒性疾病和尼帕病毒性疾病，以及用作所述疾病的療法。如本文中結(jié)合本發(fā)明的抗體所用的，術(shù)語“預(yù)防”和“療法”表示預(yù)防性以及治療性施用和利用大體上純化的多肽產(chǎn)物進(jìn)行的被動(dòng)免疫和通過轉(zhuǎn)移編碼所述產(chǎn)物或其部分的多核苷酸進(jìn)行的基因療法。因此，可向高危受試者施用所述抗體或抗體片段以降低亨德拉病毒性疾病和尼帕病毒性疾病的可能性和/或嚴(yán)重度，或向已顯示活動(dòng)性亨德拉或尼帕病毒感染的受試者施用所述抗體或抗體片段。在本發(fā)明中，ScFv或Fab片段還結(jié)合或中和亨德拉或尼帕病毒，并從而可用于治療感染。

如本文中所用，“預(yù)防上有效的量”的本發(fā)明的抗體或抗體片段是大至足以在施用后，在保護(hù)個(gè)體免受亨德拉或尼帕病毒感染中產(chǎn)生所需作用，持續(xù)適當(dāng)?shù)囊欢螘r(shí)間(諸如1至2個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間)的劑量。然而，預(yù)防上有效的量不是大至引起有害副作用諸如高粘稠度綜合征、肺水腫、充血性心力衰竭等的劑量。通常地，預(yù)防上有效的量可隨受試者的年齡、病況和性別以及受試者的疾病程度而變化，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定。如果發(fā)生任何并發(fā)癥，可由個(gè)體醫(yī)生或獸醫(yī)調(diào)整預(yù)防上有效的量的劑量。預(yù)防上有效的量可在一次或多次施用(初免和加強(qiáng))中從約0.01mg/kg變化至約50mg/kg，例如從約0.1mg/kg變化至約20mg/kg，或從約0.2mg/kg變化至約2mg/kg。

如本文中所用，“治療上有效的量”的本發(fā)明的抗體或抗體片段是大至足以產(chǎn)生所需作用(其中亨德拉病毒性疾病或尼帕病毒性疾病的癥狀得以改善或感染的可能性得以降低)的劑量。然而，治療上有效的量不是大至引起有害副作用諸如高粘稠度綜合征、肺水腫、充血性心力衰竭等的劑量。通常地，治療上有效的量可隨受試者的年齡、病況和性別以及受試者的疾病程度而變化，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。如果發(fā)生任何并發(fā)癥，可由個(gè)體醫(yī)生或獸醫(yī)調(diào)整治療上有效的量的劑量。治療上有效的量可在每日一次或多次劑量施用(持續(xù)一天或數(shù)天)中從約0.01mg/kg變化至約50mg/kg，例如從約0.1mg/kg變化至約20mg/kg，或從約0.2mg/kg變化至約2mg/kg。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行抗體的施用持續(xù)連續(xù)2至5天或更多天，以避免病毒復(fù)制的“回彈”發(fā)生。

可通過注射或通過在一段時(shí)間內(nèi)漸近輸注來施用本發(fā)明的抗體或抗體片段。本發(fā)明的抗體或抗體片段的施用可以例如是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或經(jīng)皮。用于制備含有抗體的注射液或輸液遞送系統(tǒng)的技術(shù)是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。通常，此類系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)利用不會(huì)顯著損害抗體的生物性質(zhì)，諸如互補(bǔ)位結(jié)合能力的組分(參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，1990,Mack Publishing)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定用于產(chǎn)生抗體注射液或輸注液的各種參數(shù)和條件而無需借助于過度的實(shí)驗(yàn)。

用于腸胃外施用的制劑包括無菌水性溶液或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油，以及可注射有機(jī)酯諸如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏油或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)媒介物包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(諸如基于林格氏葡萄糖的那些電解質(zhì)補(bǔ)充劑)等。防腐劑和其它添加劑也可以存在，諸如，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑等。

m5B3 ScFv、h5B3和h5B3.1的生成

對(duì)NiV或HeV F(sF)的幾種可溶性形式進(jìn)行工程化改造并產(chǎn)生重組sF構(gòu)建體。收集表達(dá)NiV和HeV sF的不同形式的穩(wěn)定的293T細(xì)胞的培養(yǎng)上清液并將其澄清，隨后利用S-蛋白瓊脂糖珠粒(Novagen Corp)進(jìn)行親和層析純化。將S瓊脂糖純化的材料施加至HiLoad 16/60Superdex 200制備級(jí)凝膠過濾柱以分離純?nèi)垠w。以30天的間隔用如表1中所示的不同的純化的可溶性病毒抗原接種Balb/cJ小鼠(Jackson實(shí)驗(yàn)室)4次。當(dāng)指定時(shí)，將已酶促S標(biāo)簽裂解的sF用于免疫。將每只小鼠在免疫前采血以獲得血清(采血前)作為陰性對(duì)照。在單次免疫中，每只動(dòng)物被給予12μg的與Sigma佐劑系統(tǒng)TM(Sigma)混合的sF。以0.1ml的劑量通過在2個(gè)部位的每一個(gè)中利用25規(guī)針腹膜內(nèi)和皮下注射0.05ml施用來給予每一次免疫。根據(jù)制造商的說明書制備佐劑和抗原制劑。在第3次免疫后7-10天對(duì)小鼠進(jìn)行采血，并收集血清樣本。在處死小鼠以進(jìn)行最終的采血收集之前4天，在不使用佐劑的情況下進(jìn)行另一次免疫。所有sF糖蛋白構(gòu)建體均引起在免疫小鼠當(dāng)中引發(fā)強(qiáng)的抗體反應(yīng)。每一只小鼠的ELISA終點(diǎn)滴度在所有情況下大于1:320,000，并且能夠沉淀在HeLa細(xì)胞中表達(dá)的天然全長(zhǎng)F。在大多數(shù)情況下，從被免疫小鼠收獲的血清抑制NiV和HeV病毒感染。

通過缺失跨膜(TM)和胞質(zhì)尾區(qū)(CT)結(jié)構(gòu)域和附加三聚體卷曲螺旋(GCNt)結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生sF的一種形式。所述附加有GCNt的構(gòu)建體(sF_GCNt)在小鼠中引發(fā)交叉反應(yīng)性亨尼帕病毒-中和性抗體。另外，可通過蛋白酶裂解，隨后進(jìn)行熱處理來體外觸發(fā)sF_GCNt構(gòu)建體。一系列單克隆抗體(mAb)來源于已用不同的sF例如非附加有GCNt的NiV sF_dFp和NiV sF_GCNt免疫的小鼠。

使用高分子量聚乙二醇(PEG)將來自免疫小鼠的淋巴細(xì)胞與商購可得的Sp2/0細(xì)胞系(鼠骨髓瘤細(xì)胞)融合，并按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐選擇雜交瘤細(xì)胞。通過將培養(yǎng)物在具有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷補(bǔ)充劑(HAT,lnvirtogen)的培養(yǎng)基中傳代來選擇與鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的淋巴細(xì)胞。使用從每一個(gè)小孔收獲的上清液，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)鑒定分泌與病毒抗原具有反應(yīng)性的雜交瘤細(xì)胞系。分離分泌結(jié)合sF的mAb的菌落，并將其經(jīng)歷有限稀釋至少2倍以確?？寺⌒纬赡芰?。從在補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸苷(HT,Invitrogen)以及100U/ml重組小鼠白細(xì)胞介素6(rl L-6,Roche Applied Biosciences)的SFM4MAb培養(yǎng)基(Hyclone)中生長(zhǎng)至高密度的雜交瘤細(xì)胞制備純化的mAb。使用蛋白-G瓊脂糖(GE Healthsciences)珠粒親和層析純化耗盡培養(yǎng)物的上清液中的抗體。使用Bradford測(cè)定法來測(cè)定各制劑的濃度。

基于來自融合板的培養(yǎng)物上清液的ELISA篩選，鑒定了超過60個(gè)分泌與sF反應(yīng)的抗體的雜交瘤克隆。通過有限稀釋選擇24個(gè)克隆以進(jìn)行進(jìn)一步純化，以生成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系來用于mAb分離，并將這些mAb中的19個(gè)用于表征。18個(gè)mAb對(duì)于NiV和HeV F具有交叉反應(yīng)性，并且1種在mAb文庫中是NiV特異性的，13種能夠沉淀全長(zhǎng)F和sF_GCNt(融合前F)，并且剩下的一種只沉淀sF_dFp(融合后F)。在所述13種融合前特異性mAb中，有12種沉淀F₀和F₁，1種mAb僅沉淀F₀。該觀察表明不同構(gòu)象可由裂解的和未裂解的F獲得。在免疫印跡中測(cè)試僅沉淀融合后F的mAb中的6種，并且發(fā)現(xiàn)其識(shí)別線性表位。在NiV和HeV假型化病毒進(jìn)入抑制中測(cè)試10種mAb，所述mAb經(jīng)顯示抑制進(jìn)入，并且另外的額外2種在較高濃度下抑制進(jìn)入。在活的NiV和HeV感染中測(cè)試mAb之一(鼠5B3或m5B3)，并且所述mAb經(jīng)顯示在12.5μg/ml(針對(duì)HeV)和1.5μg/ml(針對(duì)NiV)的濃度下中和。

m5B3是F特異性mAb之一。另外，m5B3經(jīng)測(cè)定識(shí)別構(gòu)象依賴性表位，并且也可分別在1.5和12.5μg/ml的濃度下完全中和感染性200TCID₅₀NiV和HeV。通過使用免疫沉淀，隨后進(jìn)行Western印跡分析，m5B3經(jīng)測(cè)定只結(jié)合NiV和HeV sF_GCNt以及明顯以融合前構(gòu)象狀態(tài)存在的sF和天然F的全長(zhǎng)野生型NiV和HEV F-糖蛋白形式。

合成5B3小鼠雜交瘤克隆的cDNA，并且使用幾組通用引物擴(kuò)增重鏈(V_H)和輕鏈(V_L)序列的可變區(qū)，對(duì)所述可變區(qū)進(jìn)行克隆和測(cè)序(圖1A)。圖1A中的肽和片段序列由SEQ ID NO：1-16顯示，如表A中所列的。隨后用通過(G₄S)₃的連接體肽SEQ ID NO:52連接的V_H(SEQ ID NO:1)和V_L(SEQ ID NO:9)，緊接著S肽和His標(biāo)簽在啟動(dòng)子經(jīng)修飾的商購可得的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA 3.1Hygro(+)(Invirogen Corp)(7)中構(gòu)建鼠m5B3(m5B3)的ScFv(圖1B)。在293FreeStyle^TM懸浮細(xì)胞中表達(dá)m5B3的可溶性ScFv，并使用S瓊脂糖親和柱，隨后尺寸排阻層析進(jìn)行純化。圖2A顯示瞬時(shí)表達(dá)的m5B3ScFv能夠結(jié)合于可溶性(sF)和全長(zhǎng)(FL)F。

基于m5B3的保守FR序列，構(gòu)建人ScFv文庫。基于在大腸桿菌中的高水平表達(dá)從該文庫選擇克隆。將所選定的人ScFv克隆的FR序列與m5B3ScFv的FR序列比對(duì)。鑒定保守的人殘基，并且所述殘基在m5B3FR同源位置中被突變，從而產(chǎn)生如圖3A中所示的人源化5B3(h5B3)。圖3A，上圖，SEQ ID NO：53–h5B3的組合的V_H FR區(qū)；SEQ ID NO：54–m5B3的組合的V_HFR區(qū)；SEQ ID NO：55-66-含組合的V_H FR區(qū)的人ScFv文庫克隆，如圖3A中所示的。圖3A，下圖，SEQ ID NO：67-h5B3的組合的V_L FR區(qū)；SEQ ID NO：68-m5B3的組合的V_L FR區(qū)；SEQ ID NO：69-80-含組合的V_L FR區(qū)的人ScFv文庫克隆，如圖3A中所示的。

以與5B3ScFv相同的方式合成、克隆、表達(dá)以及純化h5B3ScFv。h5B3的肽和片段的序列由SEQ ID NO：17-32顯示，如表A中所列的。所述h5B3ScFv具有SEQ ID NO:50的肽序列，其中h5B3的V_H(SEQ ID NO:17)和V_L(SEQ ID NO:25)通過連接體肽(SEQ ID NO：52)連接。隨后，生成h5B3的另一種形式，其被命名為h5B3.1，其中基于來自如上提及的人ScFv文庫的序列，將互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)CDR1和2的每一個(gè)上的一個(gè)殘基以及CDR3上的兩個(gè)殘基突變成保守的人殘基(圖3B)。隨后將h5B3.1表達(dá)和純化為h5B3ScFv。h5B3.1的肽和片段的序列由SEQ ID NO:33-48顯示，如表A中所列的。h5B3.1ScFv具有SEQ ID NO：51的肽序列，其中h5B3.1的V_H(SEQ ID NO:33)和V_L(SEQ ID NO:41)通過連接體肽(SEQ ID NO：52)連接。

如圖2A中所示，h5B3和h5B3.1能夠結(jié)合FL F。

h5B3和h5B3.1IgG1的生成

將h5B3和h5B3.1的V_H和V_L克隆入載體pDR12以生成完全I(xiàn)gG1。隨后顯示h5B3-IgG1和h5B3.1-IgG1均結(jié)合于FL F(圖2B)。將h5B3.1IgG1的重鏈和輕鏈的開放閱讀框架(ORF)克隆進(jìn)如圖4A中顯示的啟動(dòng)子增強(qiáng)的表達(dá)載體，并將所述構(gòu)建體用于開發(fā)穩(wěn)定的293FreeStyle^TM懸浮細(xì)胞系，所述細(xì)胞系在搖瓶中于不含血清的培養(yǎng)基中產(chǎn)生高產(chǎn)率(約8mg/搖瓶)的h5B3.1IgG1(圖4B)。

將含有編碼h5B3.1抗體的質(zhì)粒的Freestyle^TM細(xì)胞系293細(xì)胞以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏號(hào)PTA-120575保藏。

隨后如表1中所示測(cè)定m5B3、h5B3-IgG1和h5B3.1-IgG1的親和力，所述親和力顯示了m5B3、h5B3和h5B3.1針對(duì)sF的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。

表1：m5B3、h5B3和h5B3.1針對(duì)可溶性F的結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析

表1顯示m5B3、h5B3和h5B3.1針對(duì)可溶性F的結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析。使用Biacore 3000，通過A&G Precision Antibody^TM(Columbia,MD)進(jìn)行Biacore分析。用捕獲抗體(針對(duì)小鼠mAb的山羊抗小鼠IgG Fc以及針對(duì)人源化mAb的山羊抗人IgG Fc)涂覆證書級(jí)(Certificate grade)CM5芯片。隨后將測(cè)試mAb捕獲在芯片上，并在5個(gè)不同的sF濃度(從0至飽和)下測(cè)量結(jié)合動(dòng)力學(xué)。測(cè)量每一個(gè)sF濃度下的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)行χ2分析以評(píng)估數(shù)據(jù)的精確度。

另外，經(jīng)顯示h5B3-IgG1和h5B3.1-IgG1相較于m5B3均以相似的滴度抑制活的NiV和HeV(表2)。

表2：通過m5B3、h5B3和h5B3.1進(jìn)行的病毒中和

表2顯示通過m5B3、h5B3和h5B3.1進(jìn)行的病毒中和。通過始于100μg/ml的二倍稀釋以一式二份對(duì)純化的mAb進(jìn)行系列稀釋，并將其分別與NiV或HeV一起在37℃孵育30min。隨后將病毒-mAb混合物用于感染2x10⁴個(gè)Vero細(xì)胞/96孔的組織培養(yǎng)板的孔。在感染后3天觀察病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)。將滴度測(cè)定為其中病毒cpe在兩個(gè)孔中仍然被完全抑制(不存在)的最高稀釋度。單獨(dú)地進(jìn)行測(cè)定以比較m5B3與h5B3；以及m5B3與h5B3.1。

5B3結(jié)合的表征以及5B3表位的定位

為了確定5B3的重(H)和(L)輕鏈?zhǔn)欠窬鶇⑴c結(jié)合F，如圖1B中所示，構(gòu)建h5B3的V_H和V_L與來自人ScFv文庫的克隆之一(圖3A)的嵌合體。如圖5中所示，沒有一個(gè)嵌合體能夠結(jié)合FL F，這表明5B3的H和L均參與對(duì)F的結(jié)合。

隨后，為了確定5B3表位在F上的位置，生成其中5B3不與其反應(yīng)的Cedar病毒(CedPV)(一種新發(fā)現(xiàn)的亨尼帕病毒(Marsh,G.A.等2012,PLoS Pathog,8:e1002836))的NiV F與F蛋白的嵌合體。只有具有NiV F的球狀頭部結(jié)構(gòu)域和HRB螺旋狀莖(CedPV F的TM和CT)的構(gòu)建體才能夠結(jié)合5B3(圖6)，這表明所述表位位于所述球狀頭部結(jié)構(gòu)域中。還顯示了所述頭部與HRB的嵌合體在細(xì)胞-細(xì)胞融合測(cè)定中是有功能的。

已顯示NiV F突變體L53D在與5B3的結(jié)合中是有缺陷的?；趕F的解析的晶體結(jié)構(gòu)，將圍繞L53的殘基突變成丙氨酸(對(duì)于來自具有C末端S肽標(biāo)簽的WT F構(gòu)建體的親水性和/或疏水性殘基)和/或絲氨酸(對(duì)于來自所述WT F構(gòu)建體的疏水性殘基)(表3)。

表3：與5B3和12B2具有反應(yīng)性的F突變體的概述。

表3提供了F突變體與5B3和12B2(另一種構(gòu)象依賴性中和mAb)的反應(yīng)性的概述。將如圖7C中所示的圍繞L53的殘基突變成丙氨酸(對(duì)于親水性殘基)和/或絲氨酸(對(duì)于疏水性殘基)。隨后通過利用蛋白G Sepharose和S蛋白瓊脂糖，分別用5B3和12B2沉淀表達(dá)F的細(xì)胞裂解物來測(cè)試單和雙F突變體的與5B3的結(jié)合。在SDS-PAGE上分析所沉淀的產(chǎn)物，隨后進(jìn)行免疫印跡。使用偶聯(lián)HRP的抗S肽抗體檢測(cè)F條帶。++：強(qiáng)結(jié)合；+：較少結(jié)合；+/-：弱結(jié)合；--：無結(jié)合。

隨后通過利用5B3和另一種構(gòu)象依賴性中和mAb，12B2測(cè)試F突變體的與5B3的結(jié)合，以確定F突變體是否是構(gòu)象完整的。利用S蛋白瓊脂糖沉淀等量的表達(dá)F的細(xì)胞裂解物以監(jiān)測(cè)總的表達(dá)。結(jié)果的概述示于表3中，并且所選定的突變體的免疫印跡示于圖7A中。所述實(shí)驗(yàn)鑒定了幾個(gè)單F突變體(L53D/S、K55A/E、T250A)和兩個(gè)雙突變體(YA248-249AD和E1251-284AS)，所述突變體在對(duì)5B3的結(jié)合方面具有缺陷但對(duì)12B2結(jié)合沒有影響，這表明5B3表位的位置在球狀頭部的側(cè)面(圖7)。雖然單獨(dú)的突變體Y248A對(duì)5B3結(jié)合沒有影響，但當(dāng)與幾乎是有缺陷的(當(dāng)被5B3沉淀時(shí)只有微弱的條帶)的突變體A249D組合時(shí)，雙突變體在5B3結(jié)合中是有完全缺陷的，這表明兩個(gè)殘基在結(jié)合位點(diǎn)中是重要的。類似地，只有當(dāng)組合時(shí)，突變體E251A和I284S才是有缺陷的。突變體F282A顯示5B3結(jié)合的略有下降(盡管當(dāng)與P283A組合時(shí)是有完全缺陷的)，該雙突變體在12B2結(jié)合中也是有缺陷的。幾種其它5B3缺陷突變體(D56A，L246D，和LG246-247DA)在12B2結(jié)合中也是有缺陷的(圖7A，表3)。因此，在融合測(cè)定中將這些突變體與只有5B3缺陷的那些突變體一起測(cè)試，以測(cè)試它們?cè)诖龠M(jìn)細(xì)胞融合方面的能力。如上所述，突變體L53D在促進(jìn)融合方面不太高效，組合突變體L246D與G247A也顯示相較于野生型(WT)少于50％的融合活性，這表明功能的削弱。只有突變體FP282-283AA在融合中才是完全有缺陷的，這表明該雙突變體不是構(gòu)象和功能完整的。突變體D56A和L246D可能對(duì)12B2結(jié)合具有間接影響，所述12B2結(jié)合對(duì)F在促進(jìn)融合方面的功能沒有影響。相較于WT，除E1251-284AS具有少于40％的活性(盡管維持其與12B2的結(jié)合)外，所有其它測(cè)試的突變體保留超過80％的融合活性(圖7B)。殘基E251和I284可能參與F蛋白在促進(jìn)融合中的功能并且這些殘基上的突變可能在功能上而非構(gòu)象上影響所述蛋白，如通過突變體L53D看到的。

總之，5B3表位的位置是在包括殘基L53、K55、Y248、A249、T250、E251、1284、F282和可能地殘基D56和L246的區(qū)域中的球狀頭部的側(cè)面(圖7C和D)。

5B3抑制的機(jī)制

還對(duì)F融合中的5B3抑制機(jī)理進(jìn)行了研究。先前已開發(fā)了體外sF觸發(fā)測(cè)定(Chan,Y.P.等2012,J Virol.86:11457-71)，其中可通過胰蛋白酶消化將sF觸發(fā)至其成熟F₁+F₂形式，隨后進(jìn)行熱處理，這將觸發(fā)sF重折疊成其融合后構(gòu)象?？蓪⒕哂蠪的HRB序列的生物素化的肽添加至胰蛋白酶消化的F₁+F₂中，所述F₁+F₂將在熱處理過程中結(jié)合觸發(fā)F的中間體形式，隨后可通過抗生物素蛋白瓊脂糖沉淀所述中間體形式。當(dāng)將5B3與FC2肽一起添加時(shí)，所述mAb可以以劑量依賴性方式與FC2競(jìng)爭(zhēng)與觸發(fā)sF的結(jié)合(圖8A)。隨后用蛋白G沉淀來自該測(cè)定的未結(jié)合的材料，并且圖8B顯示m5B3和h5B3.1均仍然結(jié)合于sF。由于5B3只結(jié)合于融合前F，因此這表明當(dāng)5B3在觸發(fā)過程中存在時(shí)，所述mAb以其融合前形式穩(wěn)定和保持sF。為了進(jìn)一步研究該情況，隨后利用不斷變化的遞升溫度進(jìn)行所述觸發(fā)，以提供更多能量來在5B3存在的情況下迫使觸發(fā)發(fā)生。如在圖8C中所示，遞升溫度能夠恢復(fù)中間體形式的FC2沉淀，這表明5B3的結(jié)合通過產(chǎn)生較高的用于觸發(fā)發(fā)生的能壘來穩(wěn)定F。

此處的結(jié)果表明，5B3結(jié)合F的球狀頭部的側(cè)面，從而顯示可以是對(duì)于穩(wěn)定F來說是重要的區(qū)域的新型表位。此處顯示的對(duì)于5B3結(jié)合是重要的殘基之一L53也顯示是對(duì)于F的六聚化三聚體在病毒表面上的形成是重要的殘基，所述F的六聚化三聚體的形成是高效融合所需的，其中單個(gè)三聚體F的觸發(fā)可對(duì)六聚體產(chǎn)生鏈?zhǔn)叫?yīng)。5B3對(duì)F的結(jié)合也可干擾該鏈?zhǔn)接|發(fā)效果，從而使得病毒融合效率低下。

針對(duì)F糖蛋白的抗體及抗體片段的潛在用途

所述5B3的直接應(yīng)用是作為用于亨尼帕病毒研究的工具。例如，目前沒有mAb可用于檢測(cè)和區(qū)分融合前和融合后F。5B3識(shí)別構(gòu)象依賴性表位，并且可用于區(qū)分融合前和融合后F。這些測(cè)定用于研究操作后糖蛋白的功能和結(jié)構(gòu)特征，諸如在G受體結(jié)合后在F中發(fā)生的構(gòu)象變化。對(duì)用于亨尼帕病毒的另外診斷和檢測(cè)材料的需要已在距原發(fā)疾病中心更遠(yuǎn)的距離上發(fā)生的常規(guī)疾病流行產(chǎn)生。鑒于亨尼帕病毒表現(xiàn)出這些病毒的廣泛物種向性以及通常牽涉家養(yǎng)動(dòng)物的病毒在向人傳播中的人畜共患病的起源，診斷和檢測(cè)技術(shù)應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)健性的并且適合用于與來自許多物種的樣本一起使用。亨尼帕病毒的早期檢測(cè)可提供足夠的關(guān)注來制定能夠減少發(fā)病率和死亡率的控制措施。從亨尼帕病毒感染發(fā)出的疾病的初步診斷依賴于臨床疾病和流行病學(xué)特征。診斷稍后通過在基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室中鑒定病毒來確認(rèn)。5B3可用于開發(fā)廉價(jià)且快速的診斷/檢測(cè)工具，所述工具可具有足夠的特異性和靈敏度來提供亨尼帕病毒存在的預(yù)警。

h5B3和h5B3.1的最有前途的用途之一在于開發(fā)用于治療亨尼帕病毒感染的另外的治療劑。可大規(guī)模表達(dá)、純化這些人源化mAb，并將其用作抗病毒劑而在受者中沒有來自獨(dú)特型響應(yīng)的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。來自活病毒SNT的數(shù)據(jù)表明，5B3是NiV和HeV F介導(dǎo)的融合的高效效抑制劑。將作為治療劑與抗G人m102.4mAb組合的h5B3和/或h5B3.1開發(fā)為混合療法，可通過同時(shí)靶向兩種糖蛋白的單獨(dú)的表位來幫助使病毒對(duì)所述療法的抗性的產(chǎn)生降至最低。

亨尼帕病毒是一些已被公認(rèn)的最致病性和高致命性的新出現(xiàn)的病毒性疾病。已在這些病毒的研究和控制中取得了顯著進(jìn)步，但繼續(xù)進(jìn)行額外的研究。人源化抗病毒mAb已被開發(fā)來靶向亨尼帕病毒F糖蛋白，所述亨尼帕病毒F糖蛋白在研究以及臨床應(yīng)用中具有廣泛的適用性。正如所看到的，5B3靶向構(gòu)象依賴性融合前特異性表位。該5B3結(jié)合區(qū)的定位揭示對(duì)于穩(wěn)定F是重要的新型表位。人源化h5B3.1相較于m5B3維持所有與F的結(jié)合活性以及病毒中和滴度。此處開發(fā)的h5B3.1IgG1的優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)提供了人源化mAb的容易、快速且高產(chǎn)率的產(chǎn)生。h5B3.1的進(jìn)一步開發(fā)是所需的并且在繼續(xù)進(jìn)行，例如對(duì)CDR區(qū)進(jìn)行誘變以提高其與F的結(jié)合親和力，以及在動(dòng)物模型中測(cè)試其在保護(hù)免受疾病侵害方面的效力，但潛在的益處和商業(yè)用途是顯而易見的。