本發(fā)明涉及基于多聚體多表位肽的流感疫苗的藥物組合物及它們的制備方法。特別地，本發(fā)明提供了包含多聚體多表位多肽和含胍基的氨基酸的微粒懸液、它們的制劑及它們用于針對(duì)流感保護(hù)受試者的用途。
發(fā)明背景
流感是由迅速突變的流感病毒引起的感染性很強(qiáng)的疾病。流感很容易傳播，并以季節(jié)性流行病在世界各地?cái)U(kuò)散，每年感染總?cè)丝诘?％-20％。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)，每年在季節(jié)性爆發(fā)期間250,000-500,000人死于流感相關(guān)的原因。僅在美國(USA)，在典型年中，多于200,000人因季節(jié)性流感住院。流感感染可以是輕度的、中度的或嚴(yán)重的，范圍從無癥狀經(jīng)由輕度上呼吸道感染和氣管支氣管炎至嚴(yán)重的、偶爾致死的病毒性肺炎。感染與肺部和心血管并發(fā)癥相關(guān)，所述并發(fā)癥導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率，主要影響處于風(fēng)險(xiǎn)中的人群諸如幼兒、老人及患有慢性醫(yī)學(xué)狀況的個(gè)體。
在三種類型的流感病毒中，甲型流感病毒和乙型流感病毒分別引起人類中的約80％和20％的流感疾病，而丙型流感病毒不感染人類。由于血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)表面蛋白的頻繁的抗原漂移和轉(zhuǎn)變，甲型流感病毒具有許多子毒株和物種特異性的特點(diǎn)并被認(rèn)為是廣泛季節(jié)性流行病和大流行病的主要原因。在抗原變化后，經(jīng)由未被免疫系統(tǒng)識(shí)別的病毒毒株的感染可導(dǎo)致被感染的個(gè)體的降低的免疫應(yīng)答，其中更顯著的變化將產(chǎn)生不太有效的對(duì)身體免疫防御的刺激?？乖苹蜣D(zhuǎn)變可觸發(fā)各自的流感流行病或大流行病，如最近的禽流感和豬流感大流行病毒株經(jīng)歷的。
迄今，商購可得的流感疫苗包含每年根據(jù)是高峰流感季節(jié)期間最普遍的毒株的預(yù)測(cè)選擇的甲型流感抗原和乙型流感抗原。然而，由于包含在疫苗中的毒株和實(shí)際上流通的那些之間的錯(cuò)配，這些毒株特異性疫苗通常具有相對(duì)差的臨床效力。另外，此類免疫接種方法要求在每年的基礎(chǔ)上制備新的疫苗制劑。如此，識(shí)別多種病毒毒株的疫苗將更具成本效益并且將進(jìn)一步增加患者依從性且增強(qiáng)全球的健康前景。
目前在使用中的商業(yè)流感疫苗組合物是通常包含以下的水性溶液：磷酸鹽、鈉離子、鉀離子和/或鈣離子緩沖劑，其中添加Triton、吐溫、α-生育酚琥珀酸氫(α-tocopheryl hydrogen succinate)和/或其他添加劑或賦形劑。FLUMISTTM(MedImmune)，一種用于流感的遞呈季節(jié)性流感的表面抗原的活的減毒疫苗作為包含以下的溶液被提供：約0.05M精氨酸、0.188mg谷氨酸一鈉、2mg水解豬明膠、13.68mg蔗糖、2.26mg磷酸氫二鉀及0.96mg磷酸二氫鉀。
屬于本發(fā)明的一些發(fā)明人的PCT國際公布WO 2009/016639公開了流感多表位多肽及包含多種流感病毒肽表位的疫苗，其中每個(gè)表位在單個(gè)多肽中出現(xiàn)至少兩次。
多聚體-001(M-001)疫苗由九種保守的線性表位組成，該九種保守的線性表位按照每種的三次重復(fù)來排列并作為表達(dá)于大腸桿菌(Escherichia coli)(E.coli)中的單個(gè)重組多肽來制備。這些表位對(duì)于絕大多數(shù)流感病毒毒株是共同的，無論它們的抗原漂移和轉(zhuǎn)變。因此，期望M-001還提供針對(duì)未來病毒毒株的基于免疫的保護(hù)。盡管每種菌株的外蛋白中存在變異，多聚體-001接種導(dǎo)致有效的跨毒株識(shí)別和保護(hù)。
用多種動(dòng)物模型獲得的顯著性結(jié)果以及在重復(fù)的毒理學(xué)研究中觀察到的安全性參數(shù)已為朝向在人中的臨床試驗(yàn)作準(zhǔn)備并提供了基礎(chǔ)。已完成了評(píng)價(jià)M-001在成年和老年志愿者中的安全性和免疫原性的階段I/II和階段II臨床試驗(yàn)(Atsmon等，2014,Vaccine 32,5816–5823)。在PBS中的125-500μg劑量的帶佐劑或無佐劑的疫苗被證明是安全的和良好耐受的。在GLP毒理學(xué)研究中評(píng)價(jià)了潛在的多聚體-001疫苗相關(guān)的毒性。以最大人類劑量反復(fù)IM施用兩種M-001疫苗制劑(帶佐劑的和無佐劑的)被證明是安全的。
屬于本發(fā)明的一些發(fā)明人的WO 2012/114323提供了一種通過在流感疫苗之前或與流感疫苗一起將包含多個(gè)拷貝的多種流感病毒肽表位的多聚體流感多肽施用至受試者來改進(jìn)季節(jié)性或大流行性流感疫苗的保護(hù)效應(yīng)的方法。
當(dāng)異源蛋白被表達(dá)于大腸桿菌中時(shí)包含體(IB)的形成頻繁地發(fā)生，并且活性重組蛋白的復(fù)原通常要求重折疊成其的活性結(jié)構(gòu)。Wingfield,P.T.(Current Protocols in Protein Science.2003,30:6.1.1–6.1.37)綜述了在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組蛋白的純化。
精氨酸被用于重折疊和純化由IB獲得的蛋白，并且表現(xiàn)為對(duì)在化學(xué)和物理性質(zhì)方面不同的多種蛋白有效。精氨酸在蛋白重折疊、增溶和純化中的作用被Tsumoto等綜述(BiotechnolProg.2004Sep-Oct；20(5):1301-8；Schneider等，(J PhysChem B.2011Jun 9；115(22):7447-58))。
先前描述了精氨酸的抗聚集效應(yīng)和穩(wěn)定化效應(yīng)。例如，Lyutova等，(BiotechnolProg.2007Nov-Dec；23(6):1411-6)研究了，當(dāng)?shù)鞍拙奂ㄟ^加熱或通過添加二硫蘇糖醇(DTT)從折疊狀態(tài)轉(zhuǎn)變來誘導(dǎo)時(shí)，低濃度的精氨酸(1-10mM)對(duì)蛋白聚集的效應(yīng)。
已提出了，低分子量添加劑，諸如L-精氨酸通過抑制導(dǎo)致沉淀的分子間疏水作用來增強(qiáng)復(fù)性產(chǎn)量。Ho等，(Protein Sci.2003,12,708-716)證明了，L-精氨酸通過增加蛋白溶解度抑制聚集。
由于以下原因的一個(gè)或更多個(gè)，產(chǎn)生呈藥物懸液形式的蛋白通常是有利的：多肽的溶解度；多肽的穩(wěn)定性；控制或改變多肽的釋放譜。
蛋白微米顆?；蚣{米顆粒的懸液可通過許多方法來產(chǎn)生。此類顆?？勺畛踝鳛檩^大顆粒被產(chǎn)生，隨后是通過物理或化學(xué)方法的尺寸減小程序。一些其他方法包括結(jié)晶、凍干、噴霧干燥及超臨界流體顆粒形成或去溶劑化。
WO 2009/015736公開了一種產(chǎn)生純化的重組GDF-5相關(guān)蛋白的方法，所述方法包括用包含L-精氨酸的變性增溶緩沖液處理包含體。
WO 2012/054679公開了用于從包含重組蛋白和包含體的混合物中純化重組蛋白的方法，所述方法包括：a)用包含乙醇胺、精氨酸、EDTA、尿素和DTE的增溶緩沖液使包含重組蛋白和相關(guān)包含體的混合物溶解。
US 2003/0199441涉及一種產(chǎn)生復(fù)性的前膠原前肽的方法，其中產(chǎn)生于大腸桿菌中的包含體被溶解于0.5M至8M變性緩沖液中，隨后這被逐滴添加進(jìn)有限稀釋緩沖液(是在約中性pH附近的并包含在200nM至1,000nM之間的終濃度的L-精氨酸和二硫鍵還原性偶聯(lián)氧化還原系統(tǒng))，并然后該緩沖液混合物針對(duì)以下來透析：針對(duì)包含在50nM至200nM的終濃度的L-精氨酸和二硫鍵還原性偶聯(lián)氧化還原系統(tǒng)的生理緩沖液，以及稍后針對(duì)包含二硫鍵還原性偶聯(lián)氧化還原系統(tǒng)的生理緩沖液，以及最后針對(duì)生理緩沖液。
US 2004/0137588描述了一種從生物樣品純化多肽的方法，其在精氨酸的存在下使多肽經(jīng)歷重折疊條件。
具有用于在改進(jìn)的多聚體-多表位流感疫苗中使用的具有均勻粒度分布的微粒多肽的穩(wěn)定的懸液將是有利的。還需要此類組合物的有效產(chǎn)生方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了改進(jìn)的流感疫苗懸液，所述改進(jìn)的流感疫苗懸液包含至少一種多聚體流感多肽和含胍基的氨基酸或其衍生物，所述至少一種多聚體流感多肽包含多個(gè)拷貝的多種流感病毒肽表位，本文稱為多聚體-多表位多肽。還提供了產(chǎn)生此類懸液組合物的方法。
本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：在從多聚體-多表位多肽溶液去除離液劑和還原劑期間可控產(chǎn)生蛋白聚集體，連同添加氨基酸精氨酸，導(dǎo)致在期望的蛋白濃度和接近生理pH的pH下的多聚體-多表位多肽的穩(wěn)定且均勻的微粒懸液，克服對(duì)高壓均化以將大的無定型聚集體轉(zhuǎn)化為可注射劑型的需求。
根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了呈水性懸液形式的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種多聚體-多表位多肽、含胍基的氨基酸或其衍生物以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。
根據(jù)一些實(shí)施方案中，藥物組合物呈用于針對(duì)流感免疫接種受試者的疫苗的形式。
根據(jù)一些實(shí)施方案，含胍基的氨基酸為精氨酸(Arg)。
根據(jù)其他實(shí)施方案，含胍基的氨基酸為精氨酸衍生物。
根據(jù)本發(fā)明，可使用L-精氨酸或D-精氨酸或其衍生物的任何鹽或游離的酸、或其混合物。
根據(jù)一些實(shí)施方案，精氨酸為L-精氨酸(L-Arg)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，Arg化合物選自由以下組成的組：Arg-鹽酸鹽、Arg-硫酸鹽、Arg-磷酸鹽、Arg-檸檬酸鹽、Arg-乙酸鹽及Arg游離酸。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些實(shí)施方案，組合物包含L-Arg鹽酸鹽(L-Arg HCl)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，藥物組合物包含在0.1-2.0M的濃度的含胍基的氨基酸或其衍生物。
根據(jù)一些實(shí)施方案，藥物組合物包含在0.15-0.45M的濃度的L-精氨酸。根據(jù)其他實(shí)施方案，在藥物組合物中的精氨酸濃度為0.15-0.30M。
根據(jù)一些實(shí)施方案，藥物組合物包含具有1-50mM的濃度的另外的緩沖劑。
根據(jù)一些實(shí)施方案，緩沖劑選自由以下組成的組：檸檬酸鹽緩沖劑、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖劑、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸鹽)緩沖劑、賴氨酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸鹽)緩沖劑、咪唑緩沖劑及MES(2(N-嗎啉代)乙磺酸鹽)緩沖劑。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)具體的實(shí)施方案，組合物包含選自由以下組成的組的緩沖劑：檸檬酸鹽緩沖劑、賴氨酸緩沖劑及甘氨酸緩沖劑。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)特定的實(shí)施方案，組合物包含檸檬酸鹽緩沖劑。
根據(jù)一些實(shí)施方案，藥物組合物的pH在pH 5.0至7.6的范圍內(nèi)。根據(jù)特定的實(shí)施方案，藥物組合物的pH在pH 5.5至7.0的范圍內(nèi)。根據(jù)其他特定的實(shí)施方案，緩沖劑保持pH在5.7-6.5的范圍內(nèi)。
根據(jù)某些具體的實(shí)施方案，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含1-5mg/ml多聚體-多表位流感多肽、0.1-0.5M L-精氨酸及10-50mM檸檬酸鹽緩沖劑，具有在5.0至7.0的范圍內(nèi)的pH。
根據(jù)具體的實(shí)施方案，藥物組合物包含1-4mg/ml多聚體-多表位流感多肽、0.1-0.3M L-精氨酸及10-30mM檸檬酸鹽緩沖劑，具有在5.5至6.5的范圍內(nèi)的pH。
根據(jù)具體的實(shí)施方案，藥物組合物包含約2.5mg/ml多聚體-多表位流感多肽、約0.2M精氨酸、約20mM檸檬酸鹽緩沖劑，且pH為約6。
根據(jù)一些實(shí)施方案，藥物組合物是包含不溶性聚集體的懸液，所述不溶性聚集體具有在0.5-50μm的范圍內(nèi)的粒度分布，其中95％的聚集體尺寸落入一個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，懸液中的95％的聚集體具有選自由以下組成的組的粒度分布：0.5-5μm、1-10μm、3-30μm及5-50μm。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些實(shí)施方案，多聚體-多表位流感多肽經(jīng)重組產(chǎn)生。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，多聚體-多表位流感多肽被稱為具有如在SEQ ID NO:86中列出的氨基酸序列的M-001。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生純化的重組多聚體-多表位多肽懸液的方法，所述方法包括以下步驟：
i.使包含至少一種多聚體-多表位多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含離液劑、緩沖劑及還原劑，具有在7至11的范圍內(nèi)的pH；以及
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)可控聚集，從而形成不溶性聚集體懸液；
iii.添加精氨酸以獲得具有均勻聚集體粒度分布的穩(wěn)定且均勻的懸液，其中95％的聚集體尺寸落入一個(gè)數(shù)量級(jí)的尺寸范圍內(nèi)。
根據(jù)具體的實(shí)施方案，離液劑包含5-8M尿素和1-4M硫脲。
根據(jù)特定的實(shí)施方案，在步驟(ii)中逐漸去除離液劑和還原劑通過超濾進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在步驟(i)中的CHAPS以0.5％-2％的濃度存在。
根據(jù)一些實(shí)施方案，方法包括以下步驟：
i.提供表達(dá)至少一種多聚體-多表位流感多肽的大腸桿菌細(xì)胞；
ii.進(jìn)行裂解和細(xì)菌細(xì)胞破壞，以提供包含多聚體-多表位流感多肽的包含體；
iii.使包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸鹽)、緩沖劑及還原劑，在7至11的范圍內(nèi)的pH；
iv.通過逐步去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)可控聚集，從而形成不溶性聚集體懸液；
v.添加精氨酸以獲得具有均勻聚集體粒度分布的穩(wěn)定且均勻的懸液，其中95％的聚集體落入一個(gè)數(shù)量級(jí)的尺寸范圍內(nèi)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，逐漸去除離液劑和還原劑使用本領(lǐng)域已知的程序通過超濾進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在步驟(iii)和(iv)之間進(jìn)行至少一個(gè)色譜分離步驟。根據(jù)一些實(shí)施方案，該至少一個(gè)色譜分離步驟選自由離子交換色譜和疏水作用色譜組成的組。
根據(jù)一些實(shí)施方案，步驟(v)在步驟(iv)的聚集體形成之前或期間進(jìn)行。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，步驟(v)在步驟(iv)的聚集體形成之后進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，方法包括：
i.提供表達(dá)至少一種多聚體-多表位流感多肽的大腸桿菌細(xì)胞；
ii.進(jìn)行大腸桿菌細(xì)胞的裂解、細(xì)菌細(xì)胞破壞和離心，以提供包含多聚體-多表位流感多肽的包含體；
iii.進(jìn)行包含體的至少一次洗滌；
iv.使包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸鹽)、還原劑以及提供pH在7-10的范圍內(nèi)的緩沖劑；
v.使溶液經(jīng)歷至少一個(gè)色譜步驟；
vi.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)可控聚集，從而形成不溶性聚集體；
vii.添加含胍基的化合物，以及
viii.配制(vii)的組合物，以獲得最終懸液約0.1-0.4M含胍基的氨基酸和10-40mM檸檬酸鹽緩沖劑的，在4至8的范圍內(nèi)的pH的最終懸液。
根據(jù)其他實(shí)施方案，步驟(vii)的含胍基的化合物的添加在誘導(dǎo)可控聚集期間逐漸地進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，裂解在7至9的范圍內(nèi)的pH的緩沖液中進(jìn)行，所述緩沖液包含Tris緩沖劑、EDTA和每1g細(xì)胞糊狀物0.1-0.5mg溶菌酶。
根據(jù)一些實(shí)施方案，步驟(vi)的誘導(dǎo)可控聚集通過超濾進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，超濾包括以下步驟：
i.緩沖液更換I，用10-80mM MES緩沖液，pH 4-6.5；
ii.緩沖液更換II，用20-80mM檸檬酸鹽緩沖液、0.1-1M精氨酸，pH 4-6；
iii.緩沖液更換III，用10-50mM檸檬酸鹽緩沖液、0.1-0.5M精氨酸，pH 4.0至7.5。
根據(jù)其他實(shí)施方案，超濾包括以下步驟：
i.緩沖液更換I，用10-80mM MES緩沖液，pH 4.0至6.5；
ii.緩沖液更換II，用20-80mM檸檬酸鹽緩沖液，pH 4至6；
iii.用包含精氨酸的溶液稀釋至0.1-1M精氨酸濃度。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在最終組合物中的多肽濃度為1-10mg/ml。
根據(jù)一些實(shí)施方案，至少一種多聚體-多表位流感多肽序列在SEQ ID NO.86中列出。
根據(jù)一些實(shí)施方案，至少一種多聚體-多表位流感多肽由在SEQ ID NO.85中列出的多核苷酸序列編碼。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，方法包括以下步驟：
i.使包含重組產(chǎn)生的多聚體-多表位流感多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇、50mM甘氨酸，具有約9.5的pH；
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑(尿素、硫脲和β-巰基乙醇)誘導(dǎo)聚集，從而形成不溶性聚集體的懸液；
iii.通過包括逐漸添加0.5M精氨酸緩沖液的超濾，使懸液經(jīng)歷濃縮和緩沖液更換步驟；以及
iv.使懸液經(jīng)歷緩沖液更換，以獲得最終組合物，所述最終組合物包含約2.5mg/ml多肽、約0.2M精氨酸和約20mM檸檬酸鹽緩沖劑，具有pH約6。
根據(jù)又另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組多聚體-多表位多肽的基本上穩(wěn)定的水性懸液的方法，所述方法包括以下步驟：
i.使包含重組產(chǎn)生的多聚體-多表位流感多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇、5-50mM甘氨酸，具有在7至10的范圍內(nèi)的pH；
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)聚集，從而形成不溶性聚集體的懸液；
iii.通過包括逐漸添加精氨酸緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液的超濾，使懸液經(jīng)歷濃縮和緩沖液更換步驟；以及
iv.使懸液經(jīng)歷緩沖液更換，以獲得最終穩(wěn)定且均勻的懸液，所述最終穩(wěn)定且均勻的懸液包含約1-5mg/ml多肽、約0.1-0.5M精氨酸和約10-50mM檸檬酸鹽緩沖劑，具有在4至7的范圍內(nèi)的pH。
根據(jù)一些實(shí)施方案，方法包括以下步驟：
i.使包含重組產(chǎn)生的多聚體-多表位流感多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇、50mM甘氨酸，具有約9.5的pH；
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)聚集，從而形成不溶性聚集體的懸液；
iii.通過包括逐漸添加0.1-1M精氨酸緩沖液的超濾，使懸液經(jīng)歷濃縮和緩沖液更換步驟；以及
iv.使懸液經(jīng)歷緩沖液更換，以獲得最終懸液，所述最終懸液包含約1-5mg/ml多肽、約0.1-0.5M精氨酸和約10-50mM檸檬酸鹽緩沖劑，并具有在4至7的范圍內(nèi)的pH。
根據(jù)其他實(shí)施方案，在步驟(iv)獲得最終懸液，所述最終懸液包含約2.5mg/ml多肽、約0.2M精氨酸和約20mM檸檬酸鹽緩沖劑，并具有約6的pH。
根據(jù)其他實(shí)施方案，方法包括以下步驟：
i.使包含重組產(chǎn)生的多聚體-多表位流感多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇、50mM HEPES、5mM甘氨酸，并具有約8.0的pH；
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)聚集，從而形成不溶性聚集體的懸液；
iii.通過包括逐漸添加20-80mM檸檬酸鹽緩沖液的超濾，使懸液經(jīng)歷濃縮和緩沖液更換步驟；以及
iv.使懸液經(jīng)歷用包含精氨酸的溶液的稀釋，以獲得最終均勻的微粒懸液，所述最終均勻的微粒懸液包含約1-5mg/ml多肽、約0.1-0.5M精氨酸和約10-50mM檸檬酸鹽緩沖劑，并具有在4至7的范圍內(nèi)的pH。
根據(jù)其他實(shí)施方案，在步驟(iv)中獲得最終穩(wěn)定且均勻的微粒懸液，所述最終穩(wěn)定且均勻的微粒懸液包含約2.5mg/ml多肽、約0.2M精氨酸和約20mM檸檬酸鹽緩沖劑，并具有約6的pH。
根據(jù)一些實(shí)施方案，最終微粒懸液包含在0.5-50μm的范圍內(nèi)的聚集體粒度分布，其中95％的聚集體尺寸落入一個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在最終微粒懸液中的95％的聚集體具有選自由以下組成的組的粒度分布：0.5-5μm、1-10μm、3-30μm及5-50μm。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本文詳述的任一種方法產(chǎn)生的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的多聚體多肽包含多種流感病毒肽表位，每個(gè)表位在單個(gè)多肽中出現(xiàn)至少兩次。在本發(fā)明的上下文中，“多聚體”多肽是包含多肽的氨基酸段的不一定相鄰的多個(gè)重復(fù)(至少兩個(gè)，通常至少三個(gè)或更多個(gè))的多肽。因此，術(shù)語“多聚體多表位”指包含多種表位的多個(gè)重復(fù)的多肽。多聚體多表位多肽可經(jīng)重組產(chǎn)生，作為分離的多肽或作為融合蛋白。多肽聚集體可獨(dú)立使用或與另外的佐劑混合或配制。
包含在本發(fā)明的藥物組合物和疫苗組合物中的多聚體多表位多肽包含流感病毒B細(xì)胞表位、T輔助表位和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)表位的組合。表位優(yōu)選地選自血凝素蛋白(HA)肽、基質(zhì)蛋白(M1和/或M2)肽及核蛋白(NP)肽的保守的(非高變)區(qū)域。表位優(yōu)選地具有可證實(shí)的針對(duì)幾種人流感亞型的交叉反應(yīng)活性，并因它們的誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的改進(jìn)的能力被選擇。
根據(jù)其他實(shí)施方案，在被包含在根據(jù)本發(fā)明的組合物中的多聚體多肽內(nèi)的流感肽表位選自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:82組成的組。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，流感肽表位選自表位E1-E9(SEQ ID NO.82、48、25、52、51、59、89、69和70)。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，多聚體多表位多肽包含3-5個(gè)重復(fù)的以嵌段共聚物結(jié)構(gòu)或以交替順序聚合結(jié)構(gòu)排列的4-9種表位。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，被包含在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的多聚體多肽序列選自由以下組成的組：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:88。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)由選自由以下組成的組的途徑施用：肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、皮下、局部、皮內(nèi)以及經(jīng)皮遞送。
根據(jù)特定的實(shí)施方案，藥物組合物經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)肌內(nèi)或經(jīng)皮內(nèi)施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，被包含在藥物組合物中的多聚體多肽不被綴合至載體或融合蛋白并且不含載體或融合蛋白。在其他實(shí)施方案中，被包含在本發(fā)明的藥物組合物中的多肽還可包含載體序列，即肽表位被插入在載體多肽的序列內(nèi)或被偶聯(lián)至載體序列。
根據(jù)一些實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物不包含佐劑。根據(jù)其他實(shí)施方案，疫苗還包含藥學(xué)上可接受的佐劑。
藥學(xué)上可接受的佐劑包括，但不限于，油包水乳液、脂質(zhì)乳液或亞微米水包油乳液及脂質(zhì)體。根據(jù)具體的實(shí)施方案，佐劑選自由以下組成的組：MontanideTM、明礬、胞壁酰二肽、幾丁質(zhì)微粒、殼聚糖、霍亂毒素B亞基、或細(xì)菌脂質(zhì)、脂蛋白和/或膜蛋白。
在一些實(shí)施方案中，疫苗被配制用于肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、腹膜內(nèi)、皮下、局部、皮內(nèi)和經(jīng)皮遞送。在一些實(shí)施方案中，疫苗經(jīng)鼻內(nèi)施用。在其他實(shí)施方案中，疫苗經(jīng)肌內(nèi)施用。在又其他實(shí)施方案中，疫苗經(jīng)皮內(nèi)施用。
根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了一種在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并賦予針對(duì)流感的保護(hù)的方法，所述方法包括將以上描述的呈疫苗形式的藥物組合物施用至受試者。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物用于針對(duì)流感免疫接種的用途也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可被施用，作為單獨(dú)的疫苗，或作為包括與季節(jié)性或大流行流感疫苗一起共施用的疫苗接種方案的一部分。根據(jù)本發(fā)明的共施用涵蓋，多聚體多肽和季節(jié)性或大流行性疫苗兩者被包含在一種組合的組合物中，或它們?cè)趦蓚€(gè)單獨(dú)的疫苗接種中以至少24小時(shí)間隔被施用至患者。
根據(jù)一些實(shí)施方案，包含至少一種多聚體-多表位流感多肽的疫苗組合物與季節(jié)性或大流行性流感疫苗一起共施用。
被包含在本發(fā)明的組合物中的包含多種流感病毒肽表位的多聚體-多表位多肽可作為重組蛋白、融合蛋白及通過化學(xué)合成來產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了包含至少一種多聚體流感多肽和至少一種常規(guī)季節(jié)性或大流行性流感組合物的組合的藥物組合物。常規(guī)季節(jié)性疫苗(TIV)通常包含三種滅活的或活的減毒流感病毒毒株(每年由WHO選擇的)，以提供針對(duì)預(yù)期在即將到來季節(jié)感染的毒株的保護(hù)。大流行性疫苗通常包含一種對(duì)引起大流行病的相關(guān)毒株特異的流感病毒毒株。
本發(fā)明適用性的另外的實(shí)施方案和全部范圍將從下文給出的詳細(xì)描述變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述和具體實(shí)施例，盡管指示本發(fā)明的特定的實(shí)施方案，但僅通過說明性方式給出，因?yàn)樵诒景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改從該詳細(xì)描述對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。
發(fā)明詳述
本文提供了多聚體多表位多肽流感疫苗的改進(jìn)的藥物組合物，以及用于它們產(chǎn)生的方法。這些藥物組合物具有改進(jìn)的穩(wěn)定性特性。盡管先前的包含多聚體多表位流感多肽的組合物是基于磷酸鹽緩沖鹽水，難以生產(chǎn)，且具有再聚集的趨勢(shì)，本發(fā)明提供了包含氨基酸精氨酸或其衍生物和檸檬酸鹽緩沖劑的穩(wěn)定的懸液組合物以及用于它們產(chǎn)生的改進(jìn)的方法。
在先前已知的制備方法中，通過pH從堿性轉(zhuǎn)向至中性pH來誘導(dǎo)多肽聚集，導(dǎo)致創(chuàng)造大的無定型聚集體，這要求高壓均化以將其轉(zhuǎn)化為可注射形式。本發(fā)明克服了這些限制，通過在從多肽溶液去除離液劑和還原劑期間可控產(chǎn)生蛋白聚集體，連同添加氨基酸精氨酸，導(dǎo)致多聚體-多表位流感多肽的穩(wěn)定且均勻的微粒懸液。
多聚體多表位多肽
在根據(jù)本發(fā)明的疫苗和方法中使用的多聚體多肽包含至少兩個(gè)重復(fù)的每個(gè)表位。根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的多聚體多肽包含至少三個(gè)重復(fù)的每個(gè)表位。還提供了包含季節(jié)性或大流行性疫苗和至少一種多聚體多表位多肽的疫苗組合物，所述至少一種多聚體多表位多肽包含多種流感病毒肽表位。
提供了用于包含選自表1的流感表位的多聚體疫苗的多種示例性實(shí)施方案，其中對(duì)于每個(gè)表位的重復(fù)數(shù)目相同或不同，且其中多肽可以交替順序聚合結(jié)構(gòu)或嵌段共聚物結(jié)構(gòu)排列。術(shù)語“交替順序聚合”結(jié)構(gòu)意指，被包含在多肽中的單拷貝的所有表位順序排列，并且該排列被順序重復(fù)等于重復(fù)數(shù)的次數(shù)。例如，如果多聚體多表位多肽包含四個(gè)重復(fù)的呈交替順序結(jié)構(gòu)的三種表位X1、X2和X3，多肽具有以下聚合結(jié)構(gòu)：X1X2X3-X1X2X3-X1X2X3-X1X2X3，還寫成[X1X2X3]4。術(shù)語“嵌段共聚物”結(jié)構(gòu)意指，被包含在多肽中的所有拷貝的單個(gè)表位被相鄰排列。例如，包含四個(gè)重復(fù)的呈嵌段共聚物結(jié)構(gòu)的三種表位X1、X2和X3的類似的多聚體多表位多肽具有以下聚合結(jié)構(gòu)：X1X1X1X1-X2X2X2X2-X3X3X3X3，還寫成[A]4-[B]4-[C]4。
在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中使用的合成的或重組的流感多表位多肽選自由以下組成的組：
i.B(X1ZX2Z…Xm)nB；以及
ii.B(X1)nZ(X2)nZ…(Xm)nB；
其中B指示0-4個(gè)氨基酸殘基的序列；n在每次出現(xiàn)時(shí)，獨(dú)立地為2-50的整數(shù)；m為3-50的整數(shù)；X1、X2…Xm的每個(gè)為由4-24個(gè)氨基酸殘基組成的流感肽表位；Z在每次出現(xiàn)時(shí)為鍵或1-4個(gè)氨基酸殘基的間隔區(qū)；且其中在多肽中的氨基酸殘基的最大數(shù)目為約1000。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些實(shí)施方案，n在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為2-50的整數(shù)；m為3-15的整數(shù)；X1-Xm的每個(gè)是選自由B細(xì)胞型表位、T輔助(Th)型表位和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)型表位組成的組的由4-24個(gè)氨基酸殘基組成的流感肽表位。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，n在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為2-15的整數(shù)，且m為3-12的整數(shù)。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，m為4-9的整數(shù)，且n為3-5的整數(shù)。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，m為9且n為3。
根據(jù)其他實(shí)施方案，被包含在本發(fā)明的藥物組合物中的多聚體多肽的流感肽表位選自由以下組成的組：血凝素(HA)肽、M1肽、M2肽以及核蛋白(NP)肽。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)其他實(shí)施方案，在被包含在根據(jù)本發(fā)明的組合物中的多聚體多肽內(nèi)的流感肽表位選自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:82(在表1中描述的)組成的組。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
表1：
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，流感肽表位選自在表2中詳述的表位E1-E9(SEQ ID NO82、48、25、52、51、59、89、69和70)。
表2：流感肽表位E1至E9
應(yīng)該注意，本文列出的肽表位僅作為出于示例性的目的來提供。流感病毒蛋白在分離株之間變化，從而提供對(duì)于每種流感蛋白的多種變體序列。因此，本發(fā)明包括具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失的肽表位。
根據(jù)更具體的實(shí)施方案，包括在被包含在根據(jù)本發(fā)明的疫苗藥物組合物中的多聚體多肽中的流感肽表位由以下組成：HA 354-372(E1,SEQ ID NO:82)、HA 91-108(E2,SEQ ID NO:48)、M1 2-12(E3,SEQ ID NO:25)、HA 150-159(E4,SEQ ID NO:52)、HA 143-149(E5,SEQ ID NO:51)、NP206-229(E6,SEQ ID NO:64)、HA 307-319(E7,SEQ ID NO:59或89)、NP335-350(E8,SEQ ID NO:69)及NP 380-393(E9,SEQ ID NO:70)。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，被包含在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的多聚體多肽序列選自由以下組成的組：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:88。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，被包含在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的多聚體多肽序列被選自由以下組成的組的多核苷酸序列編碼：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:87。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含三至五個(gè)重復(fù)的以嵌段共聚物結(jié)構(gòu)或以交替順序聚合結(jié)構(gòu)排列的五至九種表位。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物組合物包含三個(gè)重復(fù)的以以下嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3-E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9]排列的九種不同的流感病毒肽表位，其中E1為HA 354-372(SEQ ID NO:82)，E2為HA 91-108(SEQ ID NO:48)，E3為M1 2-12(SEQ ID NO:25)，E4為HA 150-159(SEQ ID NO:52)，E5為HA 143-149(SEQ ID NO:51)，E6為NP 206-229(SEQ ID NO:64)，E7為HA 307-319(SEQ ID NO:59或89)，E8為NP 335-350(SEQ ID NO:69)，且E9為NP 380-393(SEQ ID NO:70)。
根據(jù)其他實(shí)施方案，多聚體多肽包含以以下交替順序聚合結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]n排列的九種不同的流感病毒肽表位，其中n為3至5；E1為HA 354-372(SEQ ID NO:82)，E2為HA 91-108(SEQ ID NO:48)，E3為M1 2-12(SEQ ID NO:25)，E4為HA 150-159(SEQ ID NO:52)，E5為HA 143-149(SEQ ID NO:51)，E6為NP 206-229(SEQ ID NO:64)，E7為HA307-319(SEQ ID NO:59或89)，E8為NP 335-350(SEQ ID NO:69)，且E9為NP 380-393(SEQ ID NO:70)。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，多聚體多肽包含六個(gè)重復(fù)的以以下交替順序聚合結(jié)構(gòu)[E1E2E3E4E5]6排列的五種不同的B細(xì)胞型流感病毒肽表位，其中E1為HA 354-372(SEQ ID NO:82)，E2為HA 91-108(SEQ ID NO:48)，E3為M1 2-12(SEQ ID NO:25)，E4為HA 150-159(SEQ ID NO:52)，E5為HA143-149(SEQ ID NO:51)。
根據(jù)其他實(shí)施方案，多聚體多肽包含六個(gè)重復(fù)的以以下交替順序聚合結(jié)構(gòu)[E7E8E9E6]6排列的四種不同的T細(xì)胞型流感病毒肽表位，其中E6為NP 206-229(SEQ ID NO:64)，E7為HA 307-319(SEQ ID NO:59或89)，E8為NP 335-350(SEQ ID NO:69)，且E9為NP 380-393(SEQ ID NO:70)。
根據(jù)另外的實(shí)施方案，多聚體多肽包含六個(gè)重復(fù)的以以下嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E2E2E2E2E2E2-E1E1E1E1E1E1-E3E3E3E3E3E3-E4E4E4E4E4E4-E5E5E5E5E5E5-E6E6EE6E6E6-E7E7E7E7E7E7-E8E8E8E8E8E8-E9E9E9E9E9E9]排列的九種不同的流感病毒肽表位，其中E1為HA 354-372(SEQ ID NO:82)，E2為HA 91-108(SEQ ID NO:48)，E3為M1 2-12(SEQ ID NO:25)，E4為HA 150-159(SEQ ID NO:52)，E5為HA 143-149(SEQ ID NO:51)，E6為NP 206-229(SEQ ID NO:64)，E7為HA 307-319(SEQ ID NO:59或89)，E8為NP 335-350(SEQ ID NO:69)，且E9為NP 380-393(SEQ ID NO:70)。
在多種實(shí)施方案中，多聚體多肽包含至少兩個(gè)重復(fù)的每個(gè)表位，通常至少三個(gè)重復(fù)的每個(gè)表位，可選地至少四個(gè)重復(fù)，可選地至少五個(gè)重復(fù)，可選地至少六個(gè)重復(fù)的每個(gè)表位，最大至少50個(gè)重復(fù)的每個(gè)表位。為了改進(jìn)表位對(duì)免疫系統(tǒng)的暴露，表位可被間隔區(qū)分離，根據(jù)某些實(shí)施方案，間隔區(qū)由單個(gè)氨基酸組成，且根據(jù)其他實(shí)施方案，間隔區(qū)包含2-6個(gè)氨基酸。根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，間隔區(qū)由1-4個(gè)中性氨基酸殘基組成。每種可能性代表了本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在被包含在藥物組合物中的多聚體多肽內(nèi)的肽表位被選自由以下組成的組的間隔區(qū)連接：鍵、氨基酸以及包含2-6個(gè)氨基酸的肽。
根據(jù)一些實(shí)施方案，間隔區(qū)的至少一個(gè)氨基酸在多肽的區(qū)段上誘導(dǎo)特定構(gòu)象(例如脯氨酸殘基)。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，間隔區(qū)包含可切割序列。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可切割間隔區(qū)被胞內(nèi)酶切割。根據(jù)一個(gè)更具體的實(shí)施方案，可切割間隔區(qū)包含蛋白酶特異性可切割序列。
用于產(chǎn)生懸液的方法
‘不溶性’包含體的溶解
可能由于疏水作用，在大腸桿菌的兩種不同的菌株中形成的重組多聚體-多表位多肽的包含體展現(xiàn)出有限的溶解度。補(bǔ)充有50mMβME的8M尿素緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)程序在中性pH下不溶解包含體。非離子或兩性離子去垢劑的添加未改進(jìn)緩沖性能。陰離子去垢劑添加(十二烷基硫酸鈉，SDS)能夠完成包含體溶解，但由于SDS干擾隨后的純化步驟，該方法是不適合的。最初，使用堿性(12)pH，以使包含體溶解于8M尿素緩沖液中。稍后，出人意料地發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常用于膜蛋白溶解的緩沖液可被修改并用于在較低pH(8-9.5)下的包含體溶解。包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸鹽)、50mMβME、50mM甘氨酸且pH為約9.5的溶液被用來實(shí)現(xiàn)完全溶解包含體。
超濾和聚集體形成
根據(jù)本發(fā)明，在多聚體-多表位多肽的產(chǎn)生方法中使用超濾，用于逐漸去除離液劑(例如尿素和硫脲)和還原劑(例如βME)，以及逐漸添加精氨酸，以用于可控創(chuàng)造在緩沖液更換之后適合于在最終組合物中使用的在1-50mg/ml的蛋白濃度的蛋白聚集體。
精氨酸的穩(wěn)定作用
根據(jù)本發(fā)明，倘沒有蛋白微粒的尺寸減小和增加的均勻性，不使用精氨酸以防止如本領(lǐng)域中描述的聚集體形成。經(jīng)由超濾緩沖液更換過程，將高濃度(約0.2-1M)的精氨酸緩沖液逐漸添加至溶解的包含體。通過進(jìn)一步的緩沖液更換實(shí)現(xiàn)0.1-0.5M的最終精氨酸濃度。
懸液組合物
如由Akers等(J.Parenteral Sci.Technol.,41,88–96,1987)公開的，制備藥物懸液的基本原因包括以下：
1.肽或蛋白的溶解度對(duì)溶液配制起阻止作用。
2.肽或蛋白的穩(wěn)定性在懸液制劑中被改進(jìn)。
3.期望控制或延遲肽或蛋白的釋放譜。
存在至少四種用于產(chǎn)生可被考慮用于開發(fā)肽或蛋白懸液制劑的顆粒的方法：
1.懸液僅包括在媒介物中的結(jié)晶材料。
2.懸液僅包括在媒介物中的無定型材料。
3.懸液包含在媒介物中的結(jié)晶和無定型材料的混合物。
4.懸液包含在懸液相和溶液相兩者中的活性成分。
存在至少四種產(chǎn)生無菌粉末的方法：結(jié)晶、凍干、噴霧干燥及超臨界流體顆粒形成?？紤]到肽和蛋白在高應(yīng)力條件下變性的傾向，結(jié)晶和凍干更通常適用于該類化合物。還已證明了這兩種方法保持干燥的材料的無菌性的能力。在液體-空氣界面或由蒸發(fā)溶劑所需的高溫，噴霧干燥過程可能導(dǎo)致變性；然而，該技術(shù)可適合于缺乏更高級(jí)結(jié)構(gòu)的小肽。
從顆粒形成單獨(dú)地制備包含任何必需賦形劑的水性或非水性的媒介物。非水性媒介物的實(shí)例包括任何高度純化的天然或合成的油，諸如芝麻油、花生油或其他植物油。取決于成分的溶解度和媒介物的總粘度，滅菌可以通過過濾或高壓滅菌來實(shí)現(xiàn)。由于顆粒生長獨(dú)立地完成，無菌組合方法提供在選擇媒介物(水性或非水性)中的更多靈活性。在每個(gè)部分的處理完成之后，干燥的顆粒和媒介物被無菌組合。要求一些形式的攪拌，以實(shí)現(xiàn)顆粒的均勻分散。在肽或蛋白的情況下，適當(dāng)?shù)目刂茟?yīng)在適當(dāng)?shù)奈恢茫源_保分散過程不導(dǎo)致變性或其他物理變化。
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生純化的重組多聚體-多表位多肽懸液的方法，所述方法包括以下步驟：
i.使包含至少一種多聚體-多表位多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含離液劑、緩沖劑及還原劑，具有在7-11的范圍內(nèi)的pH；以及
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)可控聚集，從而形成不溶性聚集體懸液；
iii.添加精氨酸以獲得具有均勻聚集體粒度分布的穩(wěn)定且均勻的懸液，其中95％的聚集體尺寸落入一個(gè)數(shù)量級(jí)的尺寸范圍內(nèi)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在步驟(i)中的pH在7-10的范圍內(nèi)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，離液劑是尿素、硫脲或其組合。
根據(jù)具體的實(shí)施方案，離液劑包含5-8M尿素和1-4M硫脲。
根據(jù)特定的實(shí)施方案，在步驟(ii)中逐漸去除離液劑和還原劑通過超濾進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在步驟(i)中的CHAPS以0.5％-2％的濃度存在。
根據(jù)一些實(shí)施方案，方法包括以下步驟：
i.提供表達(dá)至少一種多聚體-多表位流感多肽的大腸桿菌細(xì)胞；
ii.進(jìn)行裂解和細(xì)菌細(xì)胞破壞，以提供包含多聚體-多表位流感多肽的包含體；
iii.使包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸鹽)、緩沖劑及還原劑，在7-11的范圍內(nèi)的pH；
iv.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)可控聚集，從而形成不溶性聚集體懸液；
v.添加精氨酸以獲得具有均勻聚集體粒度分布的穩(wěn)定且均勻的懸液，其中95％的聚集體落入一個(gè)數(shù)量級(jí)的尺寸范圍內(nèi)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，逐漸去除離液劑和還原劑通過使用本領(lǐng)域已知的程序超濾進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，至少一個(gè)色譜分離步驟在步驟(iii)和(iv)之間進(jìn)行。根據(jù)一些實(shí)施方案，至少一個(gè)色譜分離步驟選自由離子交換色譜和疏水作用色譜組成的組。
根據(jù)一些實(shí)施方案，步驟(v)在步驟(iv)的聚集體形成之前進(jìn)行。
根據(jù)其他實(shí)施方案，步驟(v)在步驟(iv)的聚集體形成期間進(jìn)行。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，步驟(v)在步驟(iv)的聚集體形成之后進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，方法包括：
i.提供表達(dá)至少一種多聚體-多表位流感多肽的大腸桿菌細(xì)胞；
ii.進(jìn)行大腸桿菌細(xì)胞的裂解、細(xì)菌細(xì)胞破壞和離心，以提供包含多聚體-多表位流感多肽的包含體；
iii.進(jìn)行包含體的至少一次洗滌；
iv.使包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含5-8M尿素、1-4M硫脲、0.5％-4％CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸鹽)、還原劑以及提供pH在7-10的范圍內(nèi)的緩沖劑；
v.使溶液經(jīng)歷至少一個(gè)色譜步驟；
vi.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)可控聚集，從而形成不溶性聚集體；
vii.添加含胍基的化合物，以及
viii.配制(vii)的組合物，以獲得約0.1-0.4M含胍基的氨基酸和10-40mM檸檬酸鹽緩沖劑的，在4-8的范圍內(nèi)的pH的最終懸液。
根據(jù)其他實(shí)施方案，步驟(vii)的含胍基的化合物的添加在誘導(dǎo)可控聚集期間逐漸地進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，步驟(ii)的細(xì)菌細(xì)胞破壞通過高壓均化進(jìn)行。
根據(jù)其他實(shí)施方案，細(xì)菌細(xì)胞破壞通過超聲處理進(jìn)行。
根據(jù)一些實(shí)施方案，裂解在7-9的范圍內(nèi)的pH的緩沖液中進(jìn)行，所述緩沖液包含在Tris緩沖劑、EDTA和每1g細(xì)胞糊狀物0.1-0.5mg溶菌酶。
根據(jù)一些實(shí)施方案，步驟(iv)的尿素在6-7M的濃度。
根據(jù)一些實(shí)施方案，步驟(iv)的緩沖劑為在20-100mM濃度的HEPES。
根據(jù)其他實(shí)施方案，步驟(iv)的緩沖劑為在5-100mM濃度的甘氨酸。
根據(jù)一些實(shí)施方案，步驟(iv)的還原劑為在20-80mM濃度的β-巰基乙醇。
根據(jù)一些實(shí)施方案，步驟(vi)的誘導(dǎo)可控聚集通過超濾進(jìn)行。
本領(lǐng)域中已知的任何超濾方法是適用于根據(jù)本發(fā)明使用的，包括但不限于，中空纖維、切向流過濾(TFF)盒以及攪拌槽(stirred cell)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，超濾包括以下步驟：
i.緩沖液更換I，用10-80mM MES緩沖液，pH 4-6.5；
ii.緩沖液更換II，用20-80mM檸檬酸鹽緩沖液、0.1-1M精氨酸，pH 4-6；
iii.緩沖液更換III，用10-50mM檸檬酸鹽緩沖液、0.1-0.5M精氨酸，pH 4-7.5。
根據(jù)其他實(shí)施方案，超濾包括以下步驟：
i.緩沖液更換I，用10-80mM MES緩沖液，pH 4-6.5；
ii.緩沖液更換II，用20-80mM檸檬酸鹽緩沖液，pH 4-6；
iii.用包含精氨酸的溶液稀釋至0.1-1M精氨酸濃度。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在最終組合物中的多肽濃度為1-10mg/ml。
根據(jù)又其他實(shí)施方案，在最終組合物中的多肽濃度為1-4mg/ml。
根據(jù)一些實(shí)施方案，至少一種多聚體-多表位流感多肽序列在SEQ ID NO.86中列出。
根據(jù)一些實(shí)施方案，至少一種多聚體-多表位流感多肽由在SEQ ID NO.85中列出的多核苷酸序列編碼。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，方法包括以下步驟：
i.使包含重組產(chǎn)生的多聚體-多表位流感多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇、50mM甘氨酸，具有約9.5的pH；
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑(尿素、硫脲和β-巰基乙醇)誘導(dǎo)聚集，從而形成不溶性聚集體的懸液；
iii.通過包括逐漸添加0.5M精氨酸緩沖液的超濾，使懸液經(jīng)歷濃縮和緩沖液更換步驟；以及
iv.使懸液經(jīng)歷緩沖液更換，以獲得最終組合物，所述最終組合物包含約2.5mg/ml多肽、約0.2M精氨酸和約20mM檸檬酸鹽緩沖劑，具有pH約6。
根據(jù)又另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組多聚體-多表位多肽的基本上穩(wěn)定的水性懸液的方法，所述方法包括以下步驟：
i.使包含重組產(chǎn)生的多聚體-多表位流感多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇、5-50mM甘氨酸，具有在7-10的范圍內(nèi)的pH；
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)聚集，從而形成不溶性聚集體的懸液；
iii.通過包括逐漸添加精氨酸緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液的超濾，使懸液經(jīng)歷濃縮和緩沖液更換步驟；以及
iv.使懸液經(jīng)歷緩沖液更換，以獲得最終穩(wěn)定且均勻的懸液，所述最終穩(wěn)定且均勻的懸液包含約1-5mg/ml多肽、約0.1-0.5M精氨酸和約10-50mM檸檬酸鹽緩沖劑，具有在4-7的范圍內(nèi)的pH。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在步驟(i)中，pH在8-10的范圍內(nèi)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，方法包括以下步驟：
i.使包含重組產(chǎn)生的多聚體-多表位流感多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇、50mM甘氨酸，具有約9.5的pH；
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)聚集，從而形成不溶性聚集體的懸液；
iii.通過包括逐漸添加0.1-1M精氨酸緩沖液的超濾，使懸液經(jīng)歷濃縮和緩沖液更換步驟；以及
iv.使懸液經(jīng)歷緩沖液更換，以獲得最終懸液，所述最終懸液包含約1-5mg/ml多肽、約0.1-0.5M精氨酸和約10-50mM檸檬酸鹽緩沖劑，并具有在4-7的范圍內(nèi)的pH。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，在步驟(iii)中，添加0.5M精氨酸緩沖液。
根據(jù)其他實(shí)施方案，在步驟(iv)中獲得最終懸液，所述最終懸液包含約2.5mg/ml多肽、約0.2M精氨酸和約20mM檸檬酸鹽緩沖劑，并具有約6的pH。
根據(jù)其他實(shí)施方案，方法包括以下步驟：
i.使包含重組產(chǎn)生的多聚體-多表位流感多肽的包含體溶解于這樣的溶液中，所述溶液包含6M尿素、2M硫脲、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇、50mM HEPES、5mM甘氨酸，并具有約8.0的pH；
ii.通過逐漸去除離液劑和還原劑誘導(dǎo)聚集，從而形成不溶性聚集體的懸液；
iii.通過包括逐漸添加20-80mM檸檬酸鹽緩沖液的超濾，使懸液經(jīng)歷濃縮和緩沖液更換步驟；以及
iv.使懸液經(jīng)歷用包含精氨酸的溶液的稀釋，以獲得最終均勻的微粒懸液，所述最終均勻的微粒懸液包含約1-5mg/ml多肽、約0.1-0.5M精氨酸和約10-50mM檸檬酸鹽緩沖劑，并具有在4-7的范圍內(nèi)的pH。
根據(jù)一些具體的實(shí)施方案，在步驟(iii)中，添加50mM檸檬酸鹽緩沖液。
根據(jù)其他實(shí)施方案，在步驟(iv)中獲得最終穩(wěn)定且均勻的微粒懸液，所述最終穩(wěn)定且均勻的微粒懸液包含約2.5mg/ml多肽、約0.2M精氨酸和約20mM檸檬酸鹽緩沖劑，并具有約6的pH。
根據(jù)一些實(shí)施方案，最終微粒懸液包含在0.5-50μm的范圍內(nèi)的聚集體粒度分布，其中95％的聚集體尺寸落入一個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在最終微粒懸液中的95％的聚集體具有0.5-5μm的粒度分布。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在最終微粒懸液中的95％的聚集體具有1-10μm的粒度分布。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在最終微粒懸液中的95％的聚集體具有3-30μm的粒度分布。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在最終微粒懸液中的95％的聚集體具有5-50μm的粒度分布。
定義
為方便起見，本文描述了在說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求書中采用的某些術(shù)語。
根據(jù)本發(fā)明的多聚體-多表位多肽表示包含多個(gè)拷貝的多種流感病毒肽表位的多肽。
術(shù)語“免疫原性”或“免疫原性的”指物質(zhì)刺激或引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。例如，通過確定對(duì)物質(zhì)特異的抗體的存在，測(cè)量免疫原性。抗體的存在通過本領(lǐng)域已知的方法，例如，使用ELISA或HAI測(cè)定來檢測(cè)。
取決于流感表位引發(fā)免疫應(yīng)答的類型，流感表位可被分類為B細(xì)胞型、T細(xì)胞型或B細(xì)胞型和T細(xì)胞型兩者。B細(xì)胞或T細(xì)胞肽表位的定義是不明確的；例如，肽表位可誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，但同時(shí)表位可具有能夠結(jié)合人HLA分子的序列，使得它可接近CTL或Th細(xì)胞，因此，雙B細(xì)胞和T細(xì)胞分類用于該特定表位?！癈TL”、“殺傷T細(xì)胞”或“細(xì)胞毒性T細(xì)胞”是識(shí)別并裂解攜帶特定外來抗原的靶細(xì)胞的、起防御病毒感染和癌細(xì)胞作用的一組分化型T細(xì)胞?！癟輔助細(xì)胞”或“Th”是當(dāng)被特異性抗原刺激時(shí)，釋放促進(jìn)B細(xì)胞和殺傷T細(xì)胞的活化和功能的細(xì)胞因子的任何T細(xì)胞。
如本文使用的，“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白序列及其片段，以及天然存在的或合成的分子。
在說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“間隔區(qū)”指示可存在于多肽序列中、在一個(gè)末端處或在兩個(gè)表位之間的任何化學(xué)化合物。根據(jù)一些實(shí)施方案，間隔區(qū)由1-4個(gè)氨基酸殘基組成。間隔區(qū)可包含可被酶促方式切割的或可自發(fā)地分解的序列。間隔區(qū)可對(duì)多肽強(qiáng)制或誘導(dǎo)有益的構(gòu)象。間隔區(qū)可任選地包含蛋白酶特異性可切割序列。
術(shù)語“不溶性”在本文被定義為當(dāng)在水性懸液中時(shí)對(duì)肉眼可視化的特性?！安蝗苄浴鳖w?？稍陔x心水性懸液之后被沉淀或回收。
術(shù)語“懸液”在本文被定義為包含如以上定義的“不溶性”顆粒組分的水性介質(zhì)。
術(shù)語“微?！痹诒疚谋欢x為0.1-100μm尺寸的“不溶性”蛋白聚集體。根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的微粒在0.5-50μm的尺寸范圍內(nèi)。
術(shù)語“溶液”在本文被定義為實(shí)質(zhì)上不含作為以上定義的術(shù)語的“不溶性”顆粒的水性介質(zhì)。
“均勻性”在本文被定義為如通過例如由LUMiSizer懸液分析儀(LUM GmbH)測(cè)試的參數(shù)測(cè)量的聚集體的粒度分布。均勻懸液在本文被定義為具有其中95％的聚集體尺寸落入一個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)的聚集體粒度分布。
均勻微粒懸液是包含“不溶性”蛋白聚集體(以上定義為微粒)、具有均勻聚集體粒度分布的水性介質(zhì)，其中95％的聚集體尺寸落入一個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)(例如，0.1-1μm、1-10μm、3-30μm、9-90μm等等)。
被包含在根據(jù)本發(fā)明的均勻微粒懸液中的顆粒的粒度分布是窄的。如本文使用的術(shù)語“窄的粒度分布”指其中多于90％的顆粒具有在平均值(或平均數(shù))粒度0.2-2倍的范圍內(nèi)的粒度的分布。優(yōu)選地，多于95％的顆粒具有在該范圍內(nèi)的粒度。甚至更優(yōu)選地，多于99％的顆粒具有在該范圍內(nèi)的粒度。如此，對(duì)于5μm的粒度，窄的粒度分布指其中多于90％、95％或99％的顆粒具有在1-10μm范圍內(nèi)的粒度的分布。
微粒在形狀上是基本上球形或球狀，但包括不規(guī)則形狀的非球形顆粒也是可能的。對(duì)于球形顆粒，尺寸代表直徑，而對(duì)于非球形顆粒，尺寸代表平均顆粒的最長維度。
根據(jù)本發(fā)明的原理，如本文使用的平均粒度指可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)確定的平均顆粒直徑，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)包括，但不限于沉降流分級(jí)(sedimentation flow fractionation)、光子關(guān)聯(lián)光譜學(xué)、光散射、電子散射、磁盤離心(disk centrifugation)等。根據(jù)一些實(shí)施方案，聚集體粒度分布使用LUMiSizer懸液分析儀(LUM GmbH)或任何相應(yīng)設(shè)備來確定。
“穩(wěn)定性”在本文被定義為聚集體尺寸在其中保持均勻分布的條件。
離液劑為變性劑，即，可破壞水分子之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)并通過削弱疏水效應(yīng)降低大分子(在本發(fā)明中例如蛋白)的天然狀態(tài)的穩(wěn)定性的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的含胍基的氨基酸包括但不限于精氨酸(Arg)氨基酸或其衍生物。根據(jù)本發(fā)明，可使用L-Arg、D-Arg或其混合物。
根據(jù)本發(fā)明，可使用L-Arg或D-Arg或其衍生物的任何鹽或游離的酸、或其混合物。這包括但不限于選自由以下組成的組的化合物：Arg-鹽酸鹽、Arg-硫酸鹽、Arg-磷酸鹽、Arg-檸檬酸鹽、Arg-乙酸鹽及Arg游離酸。
根據(jù)本發(fā)明的Arg衍生物，包括但不限于，甲基化的精氨酸、取代的L-精氨酸、硝基-精氨酸、N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、N-氨基-L-精氨酸、N-甲基-L-精氨酸、單甲基-L-精氨酸(L-NMA)、硝基-L-精氨酸(L-NNA)、氨基胍、7-硝基吲唑、S-乙基異硫脲、S-甲基異硫脲、S-甲硫基瓜氨酸、S-乙硫基瓜氨酸、N-乙基亞氨基-L-鳥氨酸、鳥氨酸及鳥氨酸衍生物；L-刀豆氨酸；瓜氨酸；L-2-氨基-3-胍基丙酸、4-胍基丁酸；α-N-取代的L-精氨酸；2-L-精氨酰-1,3-苯并噻唑-6-羧酸；Nω-(ADP-D-核糖基)-L-精氨酸；Nω-磷酸-L-精氨酸；N2-(2-羧基乙基)-L-精氨酸；N2-琥珀酰-L-精氨酸；D-胭脂氨酸；D-章魚堿；L-精氨酸酰胺；L-精氨酸異羥肟酸；arg嘧啶(argpyrimidine)；羥基-L-精氨酸；甲基-L-精氨酸；N-酰基-L-精氨酸；N-苯甲?；?D-精氨酸；Nγ-硝基-L-精氨酸；肽基-L-精氨酸。
根據(jù)一些實(shí)施方案，低成本的精氨酸或精氨酸衍生物被用于本發(fā)明的組合物，以獲得相對(duì)便宜的最終產(chǎn)品。
針對(duì)流感的任何疫苗可連同根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物中的多聚體多肽一起使用。術(shù)語“針對(duì)流感的疫苗”包括，但不限于，部分或高純化的或重組的流感蛋白、滅活的病毒或“裂解產(chǎn)物”滅活的流感疫苗產(chǎn)品、活的減毒病毒、或者展現(xiàn)流感表位的顆粒或載體，包括但不限于病毒樣顆粒(VLP)和脂質(zhì)體。將連同多聚體多肽一起使用的流感疫苗可以是季節(jié)性、大流行性或通用疫苗。
常規(guī)季節(jié)性疫苗通常包含三種滅活的或活的減毒流感病毒毒株，并因此還被稱為TIV(三價(jià)流感疫苗)。三種毒株每年被WHO選擇，以提供針對(duì)預(yù)期在即將到來季節(jié)感染的毒株的保護(hù)。
可根據(jù)本發(fā)明使用的特定季節(jié)性疫苗的非限制性列表包括：VAXIGRIPTM、AGGRIPALTM、FLUVIRINTM、FLUADTM、MUTAGRIPTM、FLUZONETM、FLUZONE HDTM、INFLUVACTM、FLUARIXTM、FLULAVALTM、FLUMISTTM、AFLURIATM、AGRIFLUTM。
大流行性疫苗通常包含一種對(duì)引起大流行病的相關(guān)毒株特異的流感病毒毒株。例如，用于在2009/2010季節(jié)期間的豬流感大流行的A/H1N1毒株然后被包含在以后的季節(jié)性TIV制劑中，諸如2010/2011季節(jié)。
根據(jù)其他實(shí)施方案，大流行性疫苗是針對(duì)人、豬或禽流感毒株?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的特定大流行性疫苗的非限制性列表包括：PANENZATM、PANDEMRIXTM、HUMENZATM、FOCETRIATM、CELVAPAN、CELTURATM及FLUMISTTM。
重組多肽
本發(fā)明的多聚體-多表位多肽可通過在表達(dá)載體中自身或作為嵌合蛋白表達(dá)來制備。產(chǎn)生包含一種或更多種流感肽表位的重組蛋白或嵌合蛋白(或在本文可互換使用的多肽)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并詳細(xì)描述于，例如WO 2009/016639中。編碼一種或更多種流感肽表位的核酸序列可被插入進(jìn)表達(dá)載體中用于制備多核苷酸構(gòu)建體，以用于在宿主細(xì)胞中繁殖和表達(dá)。編碼包含幾種表位的多個(gè)重復(fù)的多肽，諸如多聚體多表位多肽的核酸構(gòu)建體可通過在其3'末端和5'末端處攜帶適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)的較小多核苷酸構(gòu)建體的連接來制備。
多聚體多肽的產(chǎn)生
在被宿主細(xì)胞表達(dá)之后，多聚體多肽可通過許多蛋白純化方法與不需要的組分分離。一種此類方法是通過產(chǎn)生包含體，包含體是當(dāng)重組多肽被表達(dá)于原核生物中時(shí)可形成的蛋白的無活性聚集體。盡管cDNA可適當(dāng)?shù)鼐幋a可翻譯的mRNA，所得的蛋白可能不正確折疊，或添加的肽表位的疏水性可導(dǎo)致重組多肽變成不溶性的。通過本領(lǐng)域熟知的方法容易地純化包含體。用于包含體的純化的多種程序是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，包含體通過離心從細(xì)菌裂解物回收并用去垢劑和螯合劑洗滌，以從聚集的重組蛋白去除盡可能多的細(xì)菌蛋白。為獲得可溶性蛋白，通常將洗滌過的包含體溶解于變性劑中，并且然后釋放的蛋白由通過稀釋或透析逐漸去除變性試劑來重折疊(例如，Molecular cloning:a laboratory manual，第3版，Sambrook,J.和Russell,D.W.,2001；CSHL Press)。
另一種任選的方法使用在重組蛋白上的聚組氨酸標(biāo)簽。聚組氨酸標(biāo)簽由添加至重組蛋白的通常N-末端或C-末端處的至少六個(gè)組氨酸(His)殘基組成。聚組氨酸標(biāo)簽通常用于親和純化加聚組氨酸標(biāo)簽的被表達(dá)于在大腸桿菌或其他原核表達(dá)系統(tǒng)中的重組蛋白。細(xì)菌細(xì)胞通過離心收獲，并且所得的細(xì)胞沉淀可通過物理方法或用去垢劑或酶諸如溶菌酶裂解。在該階段，原始裂解物包含在來源于細(xì)菌的幾種其他蛋白中的重組蛋白，并且與親和介質(zhì)諸如NTA-瓊脂糖、HisPur樹脂或Talon樹脂一起孵育。這些親和介質(zhì)包含以微摩爾親和力結(jié)合聚組氨酸標(biāo)簽的結(jié)合的金屬離子鎳或鈷。然后，樹脂用磷酸鹽緩沖液洗滌以去除與鈷或鎳離子不特異性地相互作用的蛋白。洗滌效率可通過添加20mM咪唑來改進(jìn)，且然后，蛋白通常用150-300mM咪唑洗脫。聚組氨酸標(biāo)簽可隨后使用限制性內(nèi)切酶、內(nèi)切蛋白酶或外切蛋白酶去除。用于純化加組氨酸標(biāo)簽的蛋白的試劑盒可例如從Qiagen購買。
疫苗配制及施用
本發(fā)明的疫苗包含多表位多肽，和任選地佐劑。疫苗可被配制，用于以許多不同模式中的一種來施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗被配制用于腸胃外施用。在一些實(shí)施方案中，疫苗被配制用于大規(guī)模接種，例如用于用噴射注射器或單次使用盒。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，疫苗施用為肌肉內(nèi)施用。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，施用為皮內(nèi)施用。專門設(shè)計(jì)成存儲(chǔ)疫苗的、經(jīng)皮注射的針是本領(lǐng)域已知的，如例如在6,843,781和7,250,036以及其他中公開的。根據(jù)其他實(shí)施方案，施用用無針注射器進(jìn)行。
根據(jù)又另一個(gè)實(shí)施方案，疫苗被配制用于粘膜遞送，特別地經(jīng)鼻遞送(Arnon等，Biologicals.2001；29(3-4):237-42；Ben-Yedidia等，IntImmunol.1999；11(7):1043-51)。疫苗制劑可以以任何方便的方式被應(yīng)用至鼻的淋巴組織。然而，將它作為液體流或液滴應(yīng)用至鼻腔通道的壁是優(yōu)選的。鼻內(nèi)組合物可例如以液體形式來配制，作為滴鼻劑、噴霧劑及氣霧劑，或者適合于吸入，作為粉末，作為乳膏或作為乳液，且任選地在適合于分配多肽的容器來提供。組合物可包含多種添加劑，諸如佐劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑或防腐劑。
本發(fā)明的制劑可任選地包含增強(qiáng)粘膜遞送的試劑，諸如，例如，如在US 2004/0077540中描述的通過調(diào)制上皮交界結(jié)構(gòu)和/或生理學(xué)可逆地增強(qiáng)粘膜上皮細(xì)胞旁路運(yùn)輸?shù)耐富摹?/p>
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，施用是口服，且疫苗可以，例如，片劑的形式呈現(xiàn)或者被包封在明膠膠囊或微膠囊中。這些形式的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識(shí)。
脂質(zhì)體提供了用于抗原遞送和抗原遞呈的另一遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體是包含通常圍繞水性中心的磷脂和其他甾醇類的雙層囊泡，抗原或其他產(chǎn)物可被包封于其中。脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)是高度通用的，具有范圍在從約25nm至約500μm的納米至微米尺寸的許多類型。已發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體在遞送治療劑至皮膚和粘膜表面方面是有效的。完整脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的平均存活時(shí)間或半衰期可通過包含允許延長體內(nèi)釋放的某些聚合物，例如聚乙二醇來被延長。脂質(zhì)體可以是單層或多層。
聚合物微粒和納米顆粒采用充當(dāng)用于疫苗遞送的儲(chǔ)庫的小的生物可降解的球體。聚合物微球具有相比于其他實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)庫的佐劑的主要優(yōu)勢(shì)是，它們是非常安全的，并已被批準(zhǔn)用作生物可降解的藥物遞送系統(tǒng)。共聚物水解的速率被非常良好表征，其又允許制造具有經(jīng)延長的時(shí)間段持續(xù)抗原釋放的微粒(O’Hagen，等，Vaccine.1993,11,965)。特別是如果微粒摻入延長的釋放特性，它們的腸胃外施用引起持久免疫。釋放速率可通過將經(jīng)不同時(shí)間段水解的聚合物的混合物和它們的相對(duì)分子量進(jìn)行調(diào)節(jié)。不希望受限于理論，由于大顆粒在可用于巨噬細(xì)胞攝取之前必須分解成較小顆粒，不同大小的顆粒(1μm至200μm)的制劑還可有助于持久的免疫應(yīng)答。以這種方式，單注射疫苗可通過整合多種粒度來開發(fā)，從而延長抗原遞呈且大大有益于家畜生產(chǎn)者。在一些應(yīng)用中，佐劑或賦形劑可被包括在疫苗制劑中。佐劑的選擇部分地由該疫苗的施用方式來決定。例如，非注射的疫苗接種將導(dǎo)致更好的總體依從性并降低總體成本。施用途徑的一個(gè)模式為肌內(nèi)施用。鼻內(nèi)佐劑的非限制性實(shí)例包括殼聚糖粉末、PLA和PLG微球、QS-21、磷酸鈣納米顆粒(CAP)和mCTA/LTB(具有熱不穩(wěn)定腸毒素的五聚體B亞基的突變的霍亂毒素E112K)。
理論上，使用的佐劑還可以是已知用于基于肽或蛋白的疫苗的任何佐劑。例如：呈凝膠形式的無機(jī)佐劑(氫氧化鋁/磷酸鋁、磷酸鈣)，細(xì)菌佐劑諸如單磷酰脂質(zhì)A和胞壁酰肽，顆粒佐劑諸如所謂的ISCOMS(“免疫刺激復(fù)合物”)，脂質(zhì)體和生物可降解的微球，基于油乳液和乳化劑的佐劑諸如IFA(“不完全弗氏佐劑”)，SAF，皂角苷(諸如QS-21)，角鯊烯/角鯊?fù)?，合成的佐劑諸如非離子型嵌段共聚物，胞壁酰肽類似物，合成的脂質(zhì)A，合成的多核苷酸和聚陽離子佐劑。
用于與本發(fā)明的免疫原一起使用的另一種佐劑是乳液。預(yù)期的乳液可以是水包油乳液或油包水乳液。除了免疫原性多肽以外，此類乳液包含如熟知的角鯊烯、角鯊?fù)?、花生油等的油相以及分散劑。非離子分散劑是優(yōu)選的，且此類材料包括，例如，脫水山梨糖醇和二縮甘露醇的單-和二-C12-C24-脂肪酸酯諸如脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯和二縮甘露醇單油酸酯。
此類乳液是例如油包水乳液，所述油包水乳液包含角鯊烯、甘油和表面活性劑諸如二縮甘露醇單油酸酯(ArlacelTM A)，任選地具有用在水相的嵌合體蛋白顆粒乳化的角鯊?fù)?。可選的油相組分包括α-生育酚、混合鏈二-和三-酸甘油酯及脫水山梨糖醇酯。此類乳液的熟知實(shí)例包括MontanideTMISA-720和MontanideTM ISA 703(Seppic,Castres,France)。水包油乳液佐劑包括，例如，在WO 95/17210和EP 0 399 843中公開的那些。
小分子佐劑的使用也被本文預(yù)期。在本文有用的一種類型的小分子佐劑是如在以下中描述的7-取代-8氧代-或8-磺基-鳥苷衍生物：美國專利號(hào)4,539,205、美國專利號(hào)4,643,992、美國專利號(hào)5,011,828以及美國專利號(hào)5,093,318。7-烯丙基-8-氧代鳥苷(洛索立賓(loxoribine))已被證明在誘導(dǎo)抗原-(免疫原-)特異性應(yīng)答中是特別有效的。
有用的佐劑包括由Corixa Corp制造的單磷酰脂質(zhì)3-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)該佐劑包含從細(xì)菌提取的三種組分：在2％角鯊烯/TweenTM 80乳液中的單磷酰脂質(zhì)(MPL)A、海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedimycolate)(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)。該佐劑可通過GB 2122204B中教導(dǎo)的方法來制備。
其他化合物與稱為氨基烷基葡萄糖酰胺磷酸鹽(AGP)的佐劑結(jié)構(gòu)上相關(guān)，諸如以名稱RC-529TM佐劑{2-[(R)-3-四-癸?；趸墓秕；被鵠-乙基-2-脫氧-4-O-膦-?；?3-O-[(R)-3-四癸?；趸?癸?；鵠-2-[(R)-3-四-癸?；趸?癸酰基-氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙基銨鹽}從Corixa Corp可得的那些。RC-529佐劑以從Corixa Corp作為RC-529SE出售的角鯊烯乳液和作為RC-529AF可得的水性制劑可得(例如在美國專利號(hào)6,355,257；美國專利號(hào)6,303,347；以及美國專利號(hào)6,113,918中公開的)。
胞壁酰二肽佐劑也被預(yù)期并且包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺[CGP 11637，也稱為去甲-MDP]和N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-s-n-甘油基-3-羥基磷?；趸?乙胺[(CGP)1983A，也稱為MTP-PE]。所謂的胞壁酰二肽類似物被描述于美國專利號(hào)4,767,842中。
包含toll樣受體-4(TLR-4)的一種或更多種激動(dòng)劑的佐劑，諸如佐劑或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物諸如佐劑或脂質(zhì)A模擬物單獨(dú)的或連同TLR-9的激動(dòng)劑諸如含非甲基化的寡脫氧核苷酸的CpG基序一起的使用也是任選的。
另外預(yù)期的佐劑包括合成的含CpG核苷酸基序一次或更多次(加上側(cè)翼序列)的寡核苷酸佐劑，從Coley Pharmaceutical Group可得。從Aquila Biopharmaceuticals,Inc.可得的命名為QS21的佐劑是具有來源于南美洲樹南美皂皮樹(Quillaja Saponaria Molina)的樹皮的佐劑活性的免疫活性的皂苷級(jí)分(例如Quil TM A)，并且其的產(chǎn)生方法被描述于美國專利號(hào)5,057,540中。還公開了QuilTM A的衍生物，例如QS21(Quil TM A的HPLC純化的級(jí)分衍生物，也稱為QA21)，以及其他級(jí)分諸如QA17。南美皂皮樹皂苷的半合成和合成的衍生物也是有用的，諸如描述于美國專利號(hào)5,977,081以及美國專利號(hào)6,080,725中的那些。從Chiron Corp.可得的命名為MF59的佐劑被描述于美國專利號(hào)5,709,879以及美國專利號(hào)6,086,901中。
另一種類型的佐劑混合物包括諸如描述于美國專利號(hào)6,113,918中的另外包含氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯的穩(wěn)定的油包水乳液。另一種油包水乳液被描述于WO 99/56776中。
佐劑以佐劑量使用，佐劑量可隨著佐劑、宿主動(dòng)物和免疫原而變化。典型的量可從每免疫接種約1微克至約1mg變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，適當(dāng)?shù)臐舛然蛄靠扇菀椎卮_定。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，佐劑作為包含能夠使疫苗等滲或低滲的一種或更多種水溶性或水可乳化物質(zhì)的溶液或乳液而存在。水溶性或水可乳化物質(zhì)可，例如，選自由以下組成的組：麥芽糖；果糖；半乳糖；蔗糖；糖醇；脂質(zhì)；以及其組合。
肽表位及類似物
本發(fā)明的多聚體多肽可使用本領(lǐng)域已知用于合成肽、肽多聚體和多肽的方法化學(xué)合成。這些方法通常依賴于肽合成的已知原理；最方便地，程序可根據(jù)固相肽合成的已知原理來進(jìn)行。
本文所用的“肽”指示被肽鍵連接的一系列氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，肽表位包含4個(gè)至24個(gè)氨基酸殘基的序列。多聚體多肽包含至少兩個(gè)重復(fù)和最大50個(gè)重復(fù)的肽表位。
當(dāng)采用化學(xué)合成時(shí)，肽類似物和肽模擬物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的肽類似物可任選地包含至少一個(gè)非天然的氨基酸和/或在C末端或N末端處的至少一個(gè)阻斷基團(tuán)。
術(shù)語“氨基酸”指具有氨基基團(tuán)和羧酸基團(tuán)，優(yōu)選地以碳主鏈上的1,2-、1,3-或1,4-取代模式的化合物。α-氨基酸是最優(yōu)選的，并且包括在蛋白中發(fā)現(xiàn)的20種天然氨基酸(除了甘氨酸以外，其是L-氨基酸)。當(dāng)合成是通過化學(xué)方法時(shí)，術(shù)語氨基酸還包括20種天然氨基酸的對(duì)應(yīng)的D-氨基酸、對(duì)應(yīng)的N-甲基氨基酸、側(cè)鏈修飾的氨基酸、在蛋白中未發(fā)現(xiàn)的生物合成可得的氨基酸(例如，4-羥基-脯氨酸、5-羥基-賴氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸(djenkolic acid)、β-氰丙氨酸(cyanolanine))以及合成來源的α-氨基酸，諸如氨基-異丁酸、正亮氨酸、正纈氨酸、高半胱氨酸和高絲氨酸。β-丙氨酸和γγ氨基丁酸分別是1,3和1,4氨基酸的實(shí)例，并且許多其他的是本領(lǐng)域熟知的。抑胃酶氨酸-樣等排體(包含兩個(gè)氨基酸的二肽，其中CONH鍵被CHOH代替)、羥基乙烯等排體(包含兩個(gè)氨基酸的二肽，其中CONH鍵被CHOHCH2代替)、還原酰胺等排體(包含兩個(gè)氨基酸的二肽，其中CONH鍵被CH2NH鍵代替)和硫酰胺等排體(包含兩個(gè)氨基酸的二肽，其中CONH鍵被CSNH鍵代替)也是對(duì)本發(fā)明有用的殘基。
對(duì)于化學(xué)合成，在本發(fā)明中使用的氨基酸為商購可得或通過常規(guī)合成方法可得的那些。某些殘基可要求特定方法用于摻入進(jìn)肽，且對(duì)肽序列的順序、發(fā)散或收斂的合成方法在本發(fā)明中是有用的。天然編碼的氨基酸及其衍生物根據(jù)IUPAC命名法由三字母代碼表示。當(dāng)沒有指明時(shí)，使用L異構(gòu)體。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氨基酸的保守性取代在本發(fā)明的肽表位的范圍內(nèi)。保守性氨基酸取代包括用另一個(gè)具有相同類型的官能團(tuán)或側(cè)鏈的氨基酸，例如脂肪族、芳香族、帶正電荷、帶負(fù)電荷的氨基酸代替一個(gè)氨基酸。這些取代可增強(qiáng)口服生物可利用度、向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的滲入、靶向特異性細(xì)胞群等等。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，改變、添加或缺失編碼的序列中的單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸的對(duì)肽、多肽或蛋白序列的單獨(dú)的取代、缺失或添加是“保守性修飾的變體”，其中該改變導(dǎo)致氨基酸取代為化學(xué)上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性取代表格是本領(lǐng)域熟知的。
以下六組各包括對(duì)彼此是保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
以下實(shí)施例是為了更充分地說明本發(fā)明的一些實(shí)施方案而呈現(xiàn)。然而，其不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的寬范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計(jì)本文公開的原理的許多變化和修改而不背離本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
材料和方法
多聚體多表位多肽：
產(chǎn)生并測(cè)試包含在表2中列出的流感病毒肽表位E1至E9的多聚體多表位多肽。除了肽表位，多肽包括氨基酸和短肽作為間隔區(qū)。多肽被以交替順序聚合結(jié)構(gòu)或嵌段共聚物結(jié)構(gòu)排列。多肽通過在來自包含用于進(jìn)一步操作多肽的多種限制性酶切位點(diǎn)的多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)載體中表達(dá)來制備。多核苷酸構(gòu)建體由商業(yè)來源提供。
由多聚體-多表位多肽制備的疫苗被用于多種小鼠模型的免疫接種研究及在人受試者的臨床試驗(yàn)中。
具有三個(gè)重復(fù)的以嵌段共聚物結(jié)構(gòu)[E1]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3-[E6]3-[E7]3-[E8]3-[E9]3排列的九種不同表位的每個(gè)的多聚體多肽被產(chǎn)生并稱為M-001。估計(jì)的M-001分子量為48kD。M-001多聚體多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:86中列出。
用來制備M-001多聚體肽的多核苷酸構(gòu)建體的DNA序列在SEQ ID NO:85中列出。
另外的多聚體-多表位多肽序列選自由分別被包含選自由以下組成的組的序列的多核苷酸序列編碼的SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:88組成的組：SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:87。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可被施用，而無需佐劑?？蛇x地，組合物可包含佐劑。在此類情況下，在臨床試驗(yàn)中使用的任選地佐劑在動(dòng)物研究中為IFA且在人試驗(yàn)中為MontanideTM ISA 51VG(Seppic,France)。MontanideTM為已在測(cè)試疫苗效力的許多臨床試驗(yàn)中采用的通常使用的免疫調(diào)節(jié)劑，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答兩者(Peek等，Adv Drug Deliv Rev.2008；60,915-928)。
實(shí)施例1：M-001的產(chǎn)生過程-選項(xiàng)A
發(fā)酵方法：發(fā)酵過程使用重組表達(dá)M-001多肽的熱休克誘導(dǎo)的大腸桿菌來進(jìn)行。將過夜接種物添加至10L細(xì)菌生長培養(yǎng)基。補(bǔ)料分批過程在36℃下進(jìn)行。誘導(dǎo)通過將溫度提高至42℃引發(fā)。在誘導(dǎo)兩小時(shí)之后，批次在15L的終體積終止。然后將細(xì)胞離心，并將回收的細(xì)胞沉淀存儲(chǔ)于-70℃。
細(xì)胞裂解、包含體回收和洗滌：將冷凍的細(xì)胞沉淀解凍并分散于裂解緩沖液(50mM Tris、10mM EDTA、溶菌酶)中。在混合并Ultra Turrax處理之后，將細(xì)胞通過Gaulin勻漿儀(700-800柵門x3個(gè)循環(huán))。裂解物用50mM Tris、0.1M NaCl、2％Triton X-100稀釋，并然后用0.5M Tris、1M NaCl稀釋。最后，粗制包含體(IB)通過離心回收，并然后儲(chǔ)存在-70℃。
然后，將IB沉淀在1％Triton；50mM HEPES、1M NaCl，pH 8；5M尿素，5mM甘氨酸，1％吐溫80，pH 8中連續(xù)洗滌，最后用50mM HEPES,pH 8洗滌，并然后儲(chǔ)存在-70℃。
包含體溶解：將洗滌過的包含體在包含6M尿素、2M硫脲、50mM甘氨酸、1％CHAPS、50mMβ-巰基乙醇，pH 9.5的緩沖液中溶解。
蛋白純化：使用AKTApilot色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)進(jìn)行純化。將溶解的蛋白通過膜過濾澄清，并且首先負(fù)載于陽離子交換SP Sepharose FF柱(GE Healthcare)上。柱用洗滌緩沖液I(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇，pH 8)，然后用洗滌緩沖液II(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇，200mM NaCl，pH 8)連續(xù)洗滌，并且然后用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇、250mM NaCl，pH 8洗脫。收集在280nm吸收時(shí)檢測(cè)到的洗脫峰。
然后，將洗脫物(elute)用1M硫酸銨稀釋至0.5M硫酸銨，然后負(fù)載到第二色譜柱，疏水作用苯基Sepharose FF(HS)樹脂(GE Healthcare)上。柱用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇、0.5M硫酸銨，pH 8洗滌，然后用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇，pH 8洗脫。然后，將洗脫物穿過Sartobind STIC(Sartorius)過濾器，用于減少DNA和內(nèi)毒素。以吐溫80：重組蛋白的1:5(w/w)的比率添加吐溫80。將蛋白溶液無菌過濾(0.2μm)。所有的隨后步驟無菌地操作。
超濾和配制：洗脫物使用具有10kDa臨界值(cut off)的中空纖維組件(GE Healthcare)進(jìn)行濃縮。為了形成具有可控粒度分布的蛋白微粒，緩沖液連續(xù)更換為50mM MES緩沖液，pH 5.5，然后為50mM檸檬酸鹽緩沖液、0.5M精氨酸，pH 5.5，并且最后為20mM檸檬酸鹽緩沖液、0.2M精氨酸，pH 6，這代表原料藥(Drug Substance)。藥物組合物-藥物產(chǎn)品通過在20mM檸檬酸鹽緩沖液、0.2M精氨酸，pH 6中將原料藥稀釋至2.5mg/mL的蛋白濃度來獲得。填充的小瓶儲(chǔ)存在+4℃。
實(shí)施例2：M-001的產(chǎn)生過程-選項(xiàng)B
發(fā)酵方法：與在實(shí)施例1中的相同。
細(xì)胞裂解、包含體回收和洗滌：與在實(shí)施例1中的相同。
包含體溶解：將洗滌過的包含體在包含6M尿素、2M硫脲、5mM甘氨酸、1％CHAPS、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇，pH 8.0的緩沖液中溶解。
蛋白純化：使用AKTApilot色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)進(jìn)行純化。將溶解的蛋白通過膜過濾澄清，并且負(fù)載于陽離子交換SP Sepharose FF柱(GE Healthcare)上。柱用洗滌緩沖液I(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇，pH 8)，然后用洗滌緩沖液II(8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇，200mM NaCl，pH 8)連續(xù)洗滌，并且然后用8M尿素、5mM甘氨酸、50mM HEPES、50mMβ-巰基乙醇、250mM NaCl，pH 8洗脫。收集在280nm吸收時(shí)檢測(cè)到的洗脫峰。
以吐溫80：重組蛋白的1:5(w/w)的比率添加吐溫80。將蛋白溶液無菌過濾(0.2μm)。所有的隨后步驟無菌地操作。
超濾和配制：洗脫物使用具有10kDa臨界值的中空纖維組件(GE Healthcare)進(jìn)行濃縮。為了形成可控微粒(即，可控蛋白聚集體)，緩沖液連續(xù)更換為50mM MES緩沖液，pH 5.5，然后為50mM檸檬酸鹽緩沖液，pH 5.5，這代表原料藥。將精氨酸溶液添加至0.5M的最終精氨酸濃度。藥物組合物-藥物產(chǎn)品通過在50mM檸檬酸鹽緩沖液、0.5M精氨酸，pH 5.5中將原料藥稀釋至2.5mg/mL的蛋白濃度來獲得。填充的小瓶儲(chǔ)存在+4℃。
實(shí)施例3：測(cè)試PBS作為原料藥緩沖液的M-001的產(chǎn)生過程
發(fā)酵方法：與在實(shí)施例1中的相同。
細(xì)胞裂解、包含體回收和洗滌：與在實(shí)施例1中的相同。
包含體溶解：與在實(shí)施例2中的相同。
蛋白純化：與在實(shí)施例2中的相同。
超濾和配制：將洗脫物用50mM MES緩沖液，pH 5.5，1:40稀釋。所得的溶液使用具有10kDa臨界值的中空纖維組件(GE Healthcare)進(jìn)行濃縮。為了創(chuàng)造蛋白微粒，緩沖液被更換為PBS緩沖液，pH 7.0。與在實(shí)施例1&2中獲得的懸液相比，該蛋白懸液的外觀是劣質(zhì)的，如由增加凝絮和沉淀視覺上評(píng)價(jià)的。將精氨酸鹽酸鹽添加至0.1-1.5M的最終精氨酸濃度。精氨酸添加導(dǎo)致以劑量依賴性方式的直接顆粒解凝絮，較高的精氨酸濃度創(chuàng)造較顯著的效果。