本發(fā)明涉及萬(wàn)寧柯無(wú)性繁殖技術(shù)，尤其是一種萬(wàn)寧柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。

背景技術(shù)：

萬(wàn)寧柯（Lithocarpus elmerrillii），系殼斗科（Fagaceae）柯屬（Lithocarpus）喬木，高達(dá)25米，當(dāng)年枝有縱溝棱，無(wú)毛，干后暗褐色，2或3年生枝散生灰白色皮孔，芽鱗半圓形或闊三角形，干后油潤(rùn)有光澤。葉薄革質(zhì)，長(zhǎng)橢圓形或少有倒卵狀橢圓形，長(zhǎng)10-17厘米，寬3-6厘米，頂部漸尖，基部漸狹長(zhǎng)尖，沿葉柄下延將至基部，全緣，側(cè)脈每邊9-12條，在近葉緣處急彎向上而隱沒(méi)，支脈纖細(xì)，葉背有緊實(shí)的蠟鱗層，干后帶灰白色；葉柄長(zhǎng)2-2.5厘米。雌花單朵散生于花序軸上；果序軸粗6-7毫米，殼斗聚生于果序軸的上部，淺碗狀，高6-10毫米，寬17-25毫米，頂部邊緣甚薄，漸向下部明顯增厚，木質(zhì)，基部狹窄，呈甚短的柄狀，包著堅(jiān)果基部，小苞片三角形，緊貼殼壁，上部的覆瓦狀排列，甚小，下部的通常連生成環(huán)狀；堅(jiān)果近圓球形而頂端尖，或?yàn)楸鈭A形，高20-25毫米，高25-30毫米，無(wú)毛，栗褐色，透熟時(shí)有縱裂紋，果臍位于底部，深約2毫米，徑14-16毫米，果壁上部厚達(dá)2.5毫米。果期9-10月。產(chǎn)海南中南部（吊羅山）。生于海拔500-750米常綠闊葉林中。

目前，萬(wàn)寧柯資源仍處于野生分布狀態(tài)，但隨著保護(hù)植物多樣性的需求，規(guī)模化人工栽培萬(wàn)寧柯資源勢(shì)在必行。組織培養(yǎng)技術(shù)是一種快速無(wú)性繁殖技術(shù)，選擇萬(wàn)寧柯優(yōu)良家系或者無(wú)性系為材料，通過(guò)組織培養(yǎng)方法繁殖苗木，既可以滿足生產(chǎn)上的數(shù)量要求，又可保持母本性狀。組織培養(yǎng)過(guò)程中，初代培養(yǎng)是制約組織培養(yǎng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵步驟，其中涉及了外植體的獲取、外植體的消毒、培養(yǎng)基選擇以及培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)體褐變、苗木玻璃化等重要問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能克服芽誘導(dǎo)過(guò)程中外植體褐變以及玻璃化等問(wèn)題，提高芽誘導(dǎo)率，出芽指數(shù)以及萌芽生長(zhǎng)狀況，獲取數(shù)量多、質(zhì)量好的萌芽，從而滿足增殖培養(yǎng)的需要，促進(jìn)萬(wàn)寧柯組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立的萬(wàn)寧柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種萬(wàn)寧柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法，采用萬(wàn)寧柯基部萌條為外植體，通過(guò)外植體無(wú)菌處理后，將外植體接種于優(yōu)質(zhì)初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于適宜的溫度、濕度和光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)；其操作步驟為，

（1）外植體選擇：選擇萬(wàn)寧柯基部萌發(fā)的半木質(zhì)化的萌條為外植體；

（2）外植體消毒及接種：將萬(wàn)寧柯萌條經(jīng)過(guò)洗潔精清洗，流水沖洗和化學(xué)試劑處理消毒后，剪切成莖段接入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；

（3）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將接種后的外植體置于適宜室內(nèi)條件下培養(yǎng)。

以上所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 1.0～2.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。

以上所述的改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇85 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

以上所述的萌條是長(zhǎng)為6~9cm、直徑0.2～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條。

以上步驟（2）所述的消毒及接種方法是將萬(wàn)寧柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1~5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10~15 min后置于流水下沖洗1~2 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5~4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

以上步驟（3）所述的適宜室內(nèi)條件為：暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500～1000 lx，光照8～12h/d；培養(yǎng)溫度20±1℃，濕度為50~55 %。

本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果如下：

1、本發(fā)明采用1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，同時(shí)重點(diǎn)調(diào)整了與萬(wàn)寧柯出芽相關(guān)的微量元素和有機(jī)成分，使得培養(yǎng)基更科學(xué)，更有針對(duì)性，有效的克服了萬(wàn)寧柯組織培養(yǎng)芽誘導(dǎo)過(guò)程中易出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象，更易促使萬(wàn)寧柯芽誘導(dǎo)的發(fā)生，促進(jìn)了萌芽的生長(zhǎng)速度和健壯度。

2、本發(fā)明以基部長(zhǎng)6~9 cm長(zhǎng)的半木質(zhì)化粗壯萌條作為外植體，保證了外植體較強(qiáng)的分生能力，促進(jìn)芽的誘導(dǎo)；本發(fā)明在外植體采集后進(jìn)行洗凈、消毒，有效降低外植體的污染率，提高了出芽率。

3、本發(fā)明將接種后的外植體置于溫度為度20±1℃，濕度為50~55%，光照由暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到強(qiáng)度為500～1000 lx的室內(nèi)條件下培養(yǎng)，溫度和濕度偏低，光照強(qiáng)度也不高的室內(nèi)條件，有利于減少芽誘導(dǎo)過(guò)程中玻璃化的發(fā)生。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：

選擇萬(wàn)寧柯基部萌發(fā)、長(zhǎng)為6~7cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將萬(wàn)寧柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗2 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 1.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500 lx，光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。

實(shí)施例2：

選擇萬(wàn)寧柯基部萌發(fā)、長(zhǎng)為7~8cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將萬(wàn)寧柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為2%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗1.5 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 1.5mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500lx，光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。

實(shí)施例3：

選擇萬(wàn)寧柯基部萌發(fā)、長(zhǎng)為7~8cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將萬(wàn)寧柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為4%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 1.5mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx，光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。

實(shí)施例4：

選擇萬(wàn)寧柯基部萌發(fā)、長(zhǎng)為8~9cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將萬(wàn)寧柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 2.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx，光照8h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。