本發(fā)明涉及醫(yī)藥及生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)上皮組織分化的膠原肽交聯(lián)膜。

背景技術(shù)：

膠原是由三條左手螺旋的肽鏈組成右手三股螺旋結(jié)構(gòu)的大分子蛋白質(zhì)，因其具備完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，故其保有生物大分子的活性。膠原是動物體含量與分布最多的蛋白，基本上占據(jù)總蛋白質(zhì)的1/3～1/4，是肌腱、軟骨、韌帶和角膜的主要成分。膠原最主要的傳統(tǒng)來源是陸生動物，比如牛皮和豬皮，然而這些來源會引起宗教(比如猶太教和伊斯蘭教禁止消費與豬來源相關(guān)的任何產(chǎn)品，而印度教不會消費與牛來源相關(guān)的任何產(chǎn)品)和安全問題(由牛引起的瘋牛病和豬引起的口蹄疫)，因此開發(fā)能夠替代這些來源的產(chǎn)品，比如魚類加工廢棄物，包括魚皮，魚骨，魚鱗，已受到研究者的廣泛關(guān)注，因其來源廣，膠原含量豐富，故這些來源對于陸生動物膠原來說，都是很好的替代品。

膠原因具有低免疫性、低毒性、促進細胞生長與粘附和能維持體內(nèi)平衡等性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域。作為動物的成纖細胞合成的一種生物高分子，是結(jié)締組織中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣的一種蛋白質(zhì)，且氨基酸含量豐富并且組成合理，營養(yǎng)價值高，起著維持骨結(jié)構(gòu)的完整和生物力學(xué)的作用。水解膠原能夠為人體膠原蛋白的合成提供優(yōu)質(zhì)的氨基酸原料，尤其是脯氨酸和羥脯氨酸，促進膠原的合成，及時補充人體皮膚中流失的膠原，有助于維持皮膚中膠原蛋白的特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而達到改善皮膚水分狀況，延緩皮膚衰老的作用。在生物和醫(yī)學(xué)上，因膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，故膠原膜能為表皮細胞的遷移、增殖鋪墊支架，并提供了良好的營養(yǎng)基礎(chǔ)，有利于上皮細胞的增生修復(fù)、因而能促進創(chuàng)面的愈合。

國內(nèi)外關(guān)于膠原用于細胞培養(yǎng)與傷口愈合有相關(guān)報道，如現(xiàn)有專利技術(shù)(專利號為201310099817.4的中國專利)公開了一種動物細胞培養(yǎng)用膠原蛋白覆層微載體及其制備方法：將魔芋葡甘聚糖基質(zhì)微球中加入活化試劑與催化劑進行活化后，再加入膠原蛋白，進行偶聯(lián)反應(yīng)；再加入交聯(lián)試劑與pbs緩沖液，攪拌使其反應(yīng)，反應(yīng)完畢清洗后即得微載體產(chǎn)品。該專利中加入多種活化劑、催化劑、交聯(lián)劑等化學(xué)試劑，且膠原的來源是以牛，豬等陸生動物，在一定程度上限制微載體的應(yīng)用。

現(xiàn)有專利技術(shù)(專利號us4994388)公開了一種膠原蛋白覆層聚苯乙烯微球，在聚苯乙烯微球表面覆層層粘連蛋白或纖連蛋白，再置于含膠原蛋白的醋酸溶液中升溫蒸發(fā)，制備了一種膠原蛋白包被微載體的制備方法。該專利所使用的層粘連蛋白和纖連蛋白價格貴，且操作條件較為嚴格，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的交聯(lián)膜以羅非魚皮為原料，采用酸法制備膠原膜，酶法制備膠原肽，將交聯(lián)劑、膠原肽、膠原膜混合，室溫反應(yīng)1.5～3h，反應(yīng)完畢后經(jīng)干燥、滅菌即成蛋白肽交聯(lián)膜產(chǎn)品。本發(fā)明所需的原材料來源豐富，成本低廉，比陸生動物來源的膠原產(chǎn)品更具有潛力與優(yōu)勢，且該蛋白肽交聯(lián)膜表面多孔，分布均勻，耐水耐熱，可實現(xiàn)上皮細胞快速粘附和生長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)上皮組織分化的蛋白肽交聯(lián)膜。本發(fā)明的交聯(lián)膜以羅非魚皮為原料，采用酸法制備膠原膜、酶法制備膠原肽，將膠原、膠原肽、交聯(lián)劑混合，室溫反應(yīng)1.5～3h，經(jīng)過干燥、滅菌步驟即成蛋白肽交聯(lián)膜產(chǎn)品。本發(fā)明所需的原材料來源豐富，成本低廉，比陸生動物來源的膠原產(chǎn)品更具有潛力與優(yōu)勢，且該蛋白肽交聯(lián)膜表面多孔，且分布均勻，耐水耐熱，有利于上皮細胞快速粘附和生長。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種誘導(dǎo)上皮組織分化的蛋白肽交聯(lián)膜及其制備方法，其特征在于：所述交聯(lián)膜以羅非魚皮為原料，經(jīng)酸法制備的膠原、經(jīng)酶法制備的膠原肽、再將得到的膠原、膠原肽與交聯(lián)劑交聯(lián)，交聯(lián)后所得物質(zhì)再經(jīng)過干燥、清洗、二次干燥、滅菌步驟后，得到誘導(dǎo)上皮組織分化的蛋白肽交聯(lián)膜,制備步驟包括：

a.酸法制備膠原步驟，以羅非魚皮作為原料，經(jīng)過酸法工藝將羅非魚皮制備成膠原；

b.酶法制備膠原肽步驟，以羅非魚皮為原料，通過在酸法制備得到的羅非魚皮膠原中加入商業(yè)酶水解獲得的膠原酶解液，經(jīng)超濾分離，干燥得到酶法制備的膠原肽；

c.交聯(lián)步驟，將經(jīng)過酸法制備的膠原、酶法制備的膠原肽與交聯(lián)劑混合；

d.交聯(lián)后所得物質(zhì)再經(jīng)過干燥、清洗、二次干燥、滅菌步驟后，得到誘導(dǎo)上皮組織分化的蛋白肽交聯(lián)膜；

所述酶法制備膠原肽步驟中的超濾是將膠原酶解液通過分子膜進行分離獲得1ku～5ku組分；

所述酶法制備膠原肽步驟中的商業(yè)酶為中性蛋白酶、膠原酶和堿性蛋白酶；

所述酶法制備膠原肽步驟中的干燥采用真空冷凍干燥；

所述交聯(lián)步驟中的交聯(lián)劑是指將碳化二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)按質(zhì)量比為0.23:0.056～1.61:0.39混合，得到edc/nhs交聯(lián)劑；

所述交聯(lián)步驟中，膠原、膠原肽與交聯(lián)劑混合的比例為在1體積純水中，酸法制備的膠原、酶法制備的膠原肽、edc/nhs交聯(lián)劑按照質(zhì)量百分比1％：0.1％:0.3％～1％:0.5％:2％混合；

所述的交聯(lián)步驟中的混合是指將膠原、膠原肽與交聯(lián)劑在混合過程中于300rpm/min勻速攪拌1.5～3h，得到混合溶液；

所述的干燥步驟，是指將交聯(lián)步驟得到的混合溶液進行凍干或自然晾干，得到交聯(lián)膜；

所述清洗步驟，是指經(jīng)干燥得到的交聯(lián)膜用純水連續(xù)沖洗三次；

所述的二次干燥步驟，是指將清洗后的交聯(lián)膜于40℃熱風(fēng)干燥；

所述的滅菌步驟，是指干燥后的交聯(lián)膜正反兩面用紫外光照滅菌30～45min,于無菌條件下保存。

進一步的：所述酸法制備膠原步驟中，膠原由以下步驟制備而成：

a.魚皮預(yù)處理步驟，將魚皮去鱗、清洗后，將魚皮切成0.5～1.5mm²得到剪切后的魚皮；

b.脫色步驟，是指將剪切后魚皮浸泡在0.4％～0.8％naoh溶液中，攪拌4h～24h，得到脫色后的魚皮；

c.脫脂步驟，將脫色后的魚皮浸泡在質(zhì)量百分比為20％的乙醇中攪拌4h～24h，得到脫色脫脂后的魚皮；

d.浸酸步驟，將脫色脫脂后的魚皮浸泡于質(zhì)量百分比為1.2％～3％乙酸中攪拌4～24h，得到浸酸后的粗膠原溶液；

e.鹽析步驟，將浸酸后的粗膠原溶液中加入nacl粉末，直至蛋白質(zhì)沉淀，得到鹽析后的粗膠原蛋白；

f.脫鹽步驟，將鹽析后的粗膠原蛋白以質(zhì)量百分比為0.6％～1.2％的乙酸溶液溶解，經(jīng)8ku～12ku濾膜過濾得到脫鹽后的膠原溶液；

g.干燥步驟，將脫鹽后的膠原溶液進行真空冷凍干燥。

進一步的：所述酶法制備膠原肽步驟中，商業(yè)酶為中性蛋白酶、堿性蛋白酶、膠原酶，其酶解溫度55～65℃，中性蛋白酶的酶解ph為7.0～7.5；堿性蛋白酶的酶解ph為6～8.5；膠原酶的酶解ph為8.5～9.0，酶解時間150～240min。

進一步的：所述的超濾壓力為0.1～0.2mpa。

本發(fā)明的有益效果是：

1.發(fā)明所需的原材料來源豐富，成本低廉，比陸生動物膠原在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域更具有優(yōu)勢。

2.本發(fā)明制備得到的蛋白肽交聯(lián)膜，將膠原肽與膠原交聯(lián)，穩(wěn)定了膠原肽對上皮細胞黏中附因子表達的促進作用。膠原膜表面多孔，且分布均勻，耐水耐熱，有利于上皮細胞快速粘附和生長。

附圖說明

圖1是蛋白肽交聯(lián)膜對小鼠皮膚創(chuàng)口愈合作用圖，圖中的皮膚創(chuàng)口直徑20mm，分為a、b兩個對照組；a組為蛋白肽交聯(lián)膜覆蓋皮膚創(chuàng)口0-6天的效果；b組為使用某品牌創(chuàng)口貼覆蓋皮膚創(chuàng)口0-6天的效果；

圖2是蛋白肽交聯(lián)膜的微觀結(jié)構(gòu)圖，分為2個對照組；a為蛋白肽交聯(lián)膜的微觀結(jié)構(gòu)；b為實驗室用鼠尾膠原膜微觀結(jié)構(gòu)；

圖3是蛋白肽交聯(lián)膜對上皮細胞hacat的細胞增殖作用圖，4個柱狀數(shù)值從左到右依次為上皮細胞hacat在酸法制備膠原、酶法制備膠原肽、蛋白肽交聯(lián)膜和實驗室用鼠尾膠原材質(zhì)上培養(yǎng)24小時后的細胞增殖率；

圖4是蛋白肽交聯(lián)膜培養(yǎng)上皮細胞hacat的蛋白因子表達圖，白色為黏著斑蛋白vinculin；分為2個對照組，a為蛋白肽交聯(lián)膜培養(yǎng)的vinculin蛋白表達；b為實驗室用鼠尾膠原培養(yǎng)的vinculin蛋白表達。

具體實施方式

為了更好的理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實施例如下。所舉實施例的目的僅僅是為了理解本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

一種誘導(dǎo)上皮組織分化的蛋白肽交聯(lián)膜，以生產(chǎn)可用于皮膚創(chuàng)口的誘導(dǎo)上皮組織分化的蛋白肽交聯(lián)膜為例。依次進行如下步驟：

(1)酸法制備膠原：32kg羅非魚皮經(jīng)過剪切機切成1mm²的魚皮塊；將魚皮瀝干水分，浸泡于含有900l0.4％的naoh溶液中，室溫攪拌48h，撈出魚皮、用冰蒸餾水沖洗至ph7，即為脫色后的魚皮；再將脫色后的魚皮放入900l20％(質(zhì)量百分比)的乙醇溶液室溫攪拌24h，撈出魚皮，用蒸餾水沖洗5遍，得到脫色脫脂后的魚皮；將脫灰脫脂后的魚皮浸泡于900l3％(質(zhì)量百分比)的乙酸溶液中，室溫攪拌，粗棉布過濾后，經(jīng)10000r/min離心30min，取上清液，4℃保存，所獲沉淀按上述條件重新提取一次，將二次獲得的離心上清液混合后，得到浸酸后的粗膠原溶液；將浸酸后的粗膠原溶液移入離心罐，分批加入21kgnacl粉末離心上清液中，5000r/min離心10min收集沉淀，得到鹽析后的粗膠原蛋白；以0.6％乙酸溶液(質(zhì)量百分比)為透析液溶解鹽析后的促膠原蛋白，經(jīng)12ku濾膜過濾，收集濾膜濾出的溶液，得到脫鹽后的膠原溶液；將脫鹽后的膠原溶液真空冷凍干燥，得到4.5kg膠原粉末，密封儲存,。

(2)酶法制備膠原肽：取3.5kg由酸法制備得到的膠原粉末，加入35l磷酸緩沖溶液中，加入70g堿性蛋白酶,調(diào)溶液ph9.0，酶解溫度55℃，酶解時間150min。酶解終止后，將酶解液加熱至85℃保持10min，滅酶活。將滅酶后的酶解液經(jīng)4000r/min離心10min，收集上清液，于1ku～5ku超濾膜分離，分離壓力0.4mpa，得到膠原肽溶液。經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥得到280g膠原肽粉。

(3)蛋白肽交聯(lián)膜的制備：將1kg酸法制備的膠原溶解于100kg的1.2％(質(zhì)量百分比)乙酸溶液中，加入edc/nhs300g、膠原肽208g。其中edc和nhs的質(zhì)量比例為1.15:0.28?；旌先芤河谑覝叵逻M行300rpm/min勻速攪拌30min后，將溶液平鋪于5塊長寬為1m×0.6m的長方形托盤中，放入真空冷凍機進行干燥。將凍干之后的膜用純水清洗三次，于40℃熱風(fēng)干燥箱中風(fēng)干。干燥后的膜兩面經(jīng)紫外照射60min后，切成0.5m×0.3m的長方形膜，于真空密封袋中無菌保存，即為膠原肽交聯(lián)膜。

實施例2

一種誘導(dǎo)上皮組織分化的蛋白肽交聯(lián)膜，以生產(chǎn)可用于科研細胞培養(yǎng)用的促進上皮細胞增殖的蛋白肽交聯(lián)膜為例。

(1)膠原的制備步驟與實施例1中膠原的制備步驟相同。

(2)膠原肽的制備步驟與實施例1中膠原肽的制備步驟相同。

(3)蛋白肽交聯(lián)膜的制備：其中膠原、膠原肽、交聯(lián)劑混合溶液的制備與實施例1中的步驟相同。得到的混合溶液于室溫下進行300rpm/min勻速攪拌2h后，將混合溶液以50ml/cm²的密度平鋪于細胞培養(yǎng)用6孔板的每孔加入混合溶液1.6ml、12孔板的每孔加入溶液800μl、96孔板的每孔加入溶液100μl。將加入混合溶液的細胞培養(yǎng)板放入真空冷凍機進行干燥。將凍干之后的膜用純水清洗三次，于40℃熱風(fēng)干燥箱中風(fēng)干。干燥后的膜經(jīng)紫外正反面照射60min后，于真空密封袋中無菌保存。即為促進上皮細胞增殖的蛋白肽交聯(lián)膜。

本發(fā)明將市面上某品牌創(chuàng)口貼與本發(fā)明制成的可用于皮膚創(chuàng)口的誘導(dǎo)上皮組織分化的蛋白肽交聯(lián)膜進行了皮膚創(chuàng)口愈合效果評價。本發(fā)明采用小鼠創(chuàng)口模型檢測蛋白肽交聯(lián)膜對皮膚創(chuàng)口的愈合作用，并以某品牌創(chuàng)口貼作對比。結(jié)果如圖1所示。本發(fā)明制備的蛋白肽交聯(lián)膜對直徑為20mm的皮膚創(chuàng)口覆蓋第4天，傷口愈合率為72％；覆蓋第6天，傷口愈合率達94.5％，幾乎完全愈合。而某品牌創(chuàng)口貼對皮膚創(chuàng)口蓋第4天，傷口愈合率為51.2％；覆蓋第6天，傷口愈合率只有81.3％。本發(fā)明制備的蛋白交聯(lián)膜對皮膚創(chuàng)口的愈合效果要優(yōu)于某品牌創(chuàng)口貼。

此外，本發(fā)明還做了實驗室常用的鼠尾膠原與本發(fā)明制成的可用于科研細胞培養(yǎng)用的促進上皮細胞增殖的蛋白肽交聯(lián)膜進行了結(jié)構(gòu)分析、對上皮細胞增殖功效分析。結(jié)果如下：

(1)蛋白肽交聯(lián)膜的微觀結(jié)構(gòu)

采用掃描電鏡對蛋白肽交聯(lián)膜的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，并以實驗室常用于上皮細胞培養(yǎng)的鼠尾膠原的微觀結(jié)構(gòu)進行對比。結(jié)果如圖2所示。本發(fā)明制備的蛋白肽交聯(lián)膜表面平整、膜形成的孔洞大小均一、分布有規(guī)律，為上皮組織的黏附提供了物理基礎(chǔ)。而實驗室常用的鼠尾膠原膜表面粗糙、膜形成的孔洞大小不一、分布不均勻。

(3)蛋白肽交聯(lián)膜對上皮細胞增殖率的促進作用：

采用mtt比色法對上皮細胞hacat的增殖率檢測，結(jié)果如圖3所示。與實驗室常用鼠尾膠原相比，本發(fā)明制備得到的膠原、膠原肽、蛋白肽交聯(lián)膜對上皮細胞hacat的增殖均有促進作用。其中，蛋白肽交聯(lián)膜的促進作用最為顯著。說明本發(fā)明制備的蛋白肽交聯(lián)膜適合于上皮細胞實驗室培養(yǎng)。

(4)上皮細胞在蛋白肽交聯(lián)膜上的細胞因子表達：

采用熒光探針標記、熒光顯微鏡觀察上皮細胞hacat在蛋白肽交聯(lián)膜上的細胞因子vinculin的表達，與實驗室常用鼠尾膠原相對比，結(jié)果如圖4所示。vinculin在細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞黏附，細胞固定等過程中起至關(guān)重要的作用，調(diào)節(jié)和參與細胞的增殖與分化，更重要的是，vinculin在創(chuàng)傷愈合中的作用舉足輕重。vinculin的高表達能很充分的說明膜材料對細胞生長能起到促進作用。本發(fā)明制備的蛋白肽交聯(lián)膜上，hacat細胞中vinculin表達的數(shù)量與分布密度遠遠高于細胞在鼠尾膠原的表達。此外，hacat細胞的生長方向、分布沿著膜材料的方向與分布生長，細胞整體的生長趨勢呈現(xiàn)出三維的立體結(jié)構(gòu)。而細胞在鼠尾膠原材料上的生長為單純的平面結(jié)構(gòu)，并且細胞的分布較疏松，同時vinculin分子的表達量也很少。說明本發(fā)明制備的蛋白肽交聯(lián)膜適合于上皮細胞實驗室培養(yǎng)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。