本發(fā)明涉及海南三七，具體涉及一種海南三七根莖芽基部誘導(dǎo)再生植株的方法，屬于植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

姜科(zingiberaceae)植物的繁殖方法可通過種子有性繁殖和切分根莖營養(yǎng)繁殖(高江云等，2006)。然而，有些種類是自交不親和的，有些是多倍體，均不能結(jié)種子，只能通過根莖繁殖(高江云等，2006)。切分根莖分株時(shí)，不要分得太小，一般不要少于3‐4個(gè)，太少會(huì)導(dǎo)致生長緩慢或死亡，同時(shí)需要帶有新生的塊莖，新分開的塊莖去掉所有莖、葉，以減少水分的喪失(高江云等，2006)。有的屬的植物可以通過莖桿扦插來繁殖，如閉鞘姜屬、舞花姜屬、姜花屬、姜屬的部分種類，將成熟的莖桿切成帶3‐4個(gè)節(jié)的莖段，直立插入沙土中2節(jié)，或莖段平放，用沙土稍微覆蓋，保持濕潤和遮蔭，一段時(shí)間后，其節(jié)上的芽就會(huì)萌蘗形成小植株，稍大后分離栽培(高江云等，2006)。

海南三七(kaempferiarotunda)屬于姜科山奈屬(kaempferia)植物，分布于廣東、廣西、云南、臺灣及亞洲南部至東南部(吳德鄰等，1981)。其葉叢生，葉片長橢圓形，葉面淡綠色，具暗綠色斑紋，不耐霜凍，冬季地上部分枯死；花先于葉直接從根莖抽出，頭狀花序具4‐6朵花，花白色，唇瓣較大，紫紅色；花期3‐4月；根莖藥用有消腫止痛的功效；觀葉類，株形好，葉漂亮，花晶瑩美麗，在夏秋季節(jié)可作為觀賞價(jià)值高的室內(nèi)觀葉植物(吳德鄰等，1981；高江云等，2006；路國輝和王英強(qiáng)，2011；吳德鄰等，2016)。由于海南三七不結(jié)果，所以不能進(jìn)行有性繁殖。其也沒有莖桿，因此，只能采用上述的切分根莖營養(yǎng)繁殖。因?yàn)槟副玖坎蛔悖蟹指o分株繁殖速度有限，而且對母株的損傷也很大，短期內(nèi)得不到大量植株。

現(xiàn)有技術(shù)中，采用外植體誘導(dǎo)愈傷組織再分化成苗進(jìn)行繁殖是可行的方法，但出苗率低，而且周期長。劉盼盼(華南師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2013)將海南三七外植體分為假莖段(葉至塊根之間的假莖)、葉片、根狀莖、芽和莖尖(盆栽和組培苗)，結(jié)果盆栽的塊莖、假莖段和葉片通過誘導(dǎo)愈傷組織再分化獲得無菌苗的途徑均失?。唤M培苗的假莖段和葉片誘導(dǎo)愈傷分化來獲得無菌苗，由于愈傷組織增殖及誘導(dǎo)時(shí)間較久，并且愈傷至苗的誘導(dǎo)率不足10％，很難快速達(dá)到所需的無菌苗株數(shù)，故不采用此方法；組培苗的幼芽或莖尖，接種到ms+6‐ba3.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l的培養(yǎng)基中，20d左右有愈傷組織產(chǎn)生，30d左右有絨毛狀根生成，但也發(fā)現(xiàn)，接種到兩種培養(yǎng)基ms+6‐ba2.0/3.0mg/l+naa0.10mg/l上誘導(dǎo)，均只有10％誘導(dǎo)成苗，此種方法愈傷組織分化成苗率低。吳丹(華南師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2014)將海南三七無菌苗的三個(gè)不同部位(葉片、假莖段和假莖段基部)接種在含有不同濃度的6‐ba和2，4‐d組合的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下培養(yǎng)，40d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)只有假莖段基部成功誘導(dǎo)出愈傷組織，最佳生長調(diào)節(jié)劑組合為6‐ba2.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l，再接種到愈傷組織分化第一階段轉(zhuǎn)綠需時(shí)30d，再將轉(zhuǎn)綠的愈傷組織塊轉(zhuǎn)接入芽分化培養(yǎng)基中，40d左右可逐漸有苗長成，分化率大多集中在42％‐67％之間，此種方法愈傷分化出苗率仍然低，而且從外植體誘導(dǎo)愈傷到分化成苗就需時(shí)110d，周期長。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明采用根莖芽基部作為外植體，提供了一種海南三七根莖芽基部誘導(dǎo)再生植物的方法，建立了高效的海南三七植株再生體系，顯著提高海南三七的組培繁殖效率。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種海南三七根莖芽基部誘導(dǎo)再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟：

(a)外植體前處理：采集海南三七的根莖用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的貯藏根和須根后，消毒后晾干；再放入洗凈消毒的河沙中，恒溫發(fā)芽，洗凈根莖芽，取其芽基部為外植體材料；

(b)叢生芽誘導(dǎo)：將消毒好的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至外植體基部形成叢生芽；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/l、萘乙酸0.01～0.10mg/l、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/l、卡拉膠粉9.5～10.0g/l；

(c)增殖繼代：當(dāng)初代芽基部叢生芽長至4～6cm時(shí)，切下芽，截取芽基部1.0‐1.5cm接種到增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽；所述增殖繼代培養(yǎng)基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤3.0～8.0mg/l、萘乙酸0.05～0.10mg/l、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/l、卡拉膠粉9.5～10.0g/l；

(d)生根培養(yǎng)：當(dāng)繼代苗高4～7cm時(shí)，切下接種到生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基成分為ms、萘乙酸0.10～0.50mg/l、香蕉泥10.0～15.0％、活性炭1.0～1.5g/l、蔗糖20～30g/l、卡拉膠粉9.5～10.0g/l；

(e)煉苗移栽：當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高5～8cm時(shí)，在溫室自然光照下煉苗7～10d，取出瓶苗，洗凈根部培養(yǎng)基，百菌清溶液消毒后，移栽到進(jìn)口泥炭的基質(zhì)中，保持通風(fēng)透氣，濕度在70～85％，溫度在20～32℃，自然光照條件培養(yǎng)后得移栽苗。

為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，步驟(a)所述的根莖芽的芽高為6‐18cm，有1片葉。

優(yōu)選地，步驟(a)所述的消毒后晾干的消毒是將海南三七的根莖放入質(zhì)量濃度0.1‐0.3％的多菌靈粉劑溶液中浸泡消毒30‐40min。

優(yōu)選地，步驟(a)所述的恒溫發(fā)芽是在培養(yǎng)箱中33℃恒溫發(fā)芽下進(jìn)行。

優(yōu)選地，步驟(a)所述的外植體為切掉海南三七根莖芽上的葉片和莖尖后留下的1～2cm的芽基部。

優(yōu)選地，以質(zhì)量百分比濃度計(jì)，步驟b)所述外植體的消毒是先用0.1％‐0.3％高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30～40min，再用0.1％～0.3％的百菌清溶液，浸泡根莖芽30～40min，接著在自來水下反復(fù)沖洗根莖芽30～40min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留2～3cm高的根莖芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1～0.2％升汞溶液消毒15‐18min，滅菌水沖洗4～5次，切掉距離芽基部兩頭各約0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

優(yōu)選地，步驟(e)中如果溫度高于32℃，用風(fēng)機(jī)和水簾降溫。

優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的ph都為5.6～5.8；培養(yǎng)基滅菌條件為125℃，30～40min。

優(yōu)選地，步驟(b)、步驟(c)和步驟(d)所述培養(yǎng)的溫度為25～30℃，光照強(qiáng)度為2000～2300lx，光照時(shí)間控制為14h/d。

優(yōu)選地，步驟(e)所述百菌清溶液消毒是用0.1％～0.3％的百菌清溶液浸泡30～40min。

應(yīng)用本發(fā)明的外植體消毒方法，消毒成活率可達(dá)到85～90％，15～20d能在外植體上觀察到肉眼可見的綠點(diǎn)。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：

(1)本發(fā)明采用海南三七根莖芽基部為外植體，建立了高效的以芽繁芽途徑的植株再生體系，外植體初代培養(yǎng)60～65d，啟動(dòng)率87.50％～98.50％，出芽指數(shù)2.15～4.60，外植體大部分可以分化出2‐5個(gè)叢生芽，長勢較好；繼代增殖經(jīng)約20～25d培養(yǎng)，單個(gè)叢生芽基部可分化出4～9個(gè)叢生芽，可在100～108d內(nèi)完成從外植體誘導(dǎo)叢生芽、繼代增殖到生根苗形成的一個(gè)周期，單個(gè)叢生芽基部經(jīng)過繼代增殖，每個(gè)繼代增殖周期可增殖4.69～7.56倍個(gè)叢生芽，即單個(gè)外植體在100～108d內(nèi)可出芽10.08～34.77個(gè)?，F(xiàn)有技術(shù)中，從外植體誘導(dǎo)愈傷到分化成苗就需時(shí)110d，而且每塊愈傷分化成苗2.38～3.75個(gè)。對比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明單個(gè)外植體在100～108d內(nèi)可出芽10.08～34.77個(gè)，大大提高了海南三七的繁殖系數(shù)和減短了海南三七的繁殖周期。

(2)本發(fā)明只需簡單的植物組織培養(yǎng)設(shè)備，就可在100～108d內(nèi)完成從外植體誘導(dǎo)叢生芽、繼代增殖到生根苗形成的一個(gè)周期，因此，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的組培苗。本發(fā)明繁殖的海南三七種苗，能保持母株的優(yōu)良特性，移栽成活率可達(dá)90％以上，具有投入低、產(chǎn)出高的優(yōu)勢。

附圖說明

圖1實(shí)施例1洗凈的海南三七根莖圖片。

圖2實(shí)施例1在河沙中萌發(fā)洗凈的根莖芽圖片。

圖3實(shí)施例1海南三七根莖芽基部外植體接種誘導(dǎo)培養(yǎng)基15d出現(xiàn)芽萌動(dòng)圖片。

圖4實(shí)施例1外植體誘導(dǎo)出的叢生芽圖片。

圖5實(shí)施例1繼代增殖的叢生芽圖片。

圖6實(shí)施例1生根培養(yǎng)形成的根系圖片。

圖7實(shí)施例1洗凈根部培養(yǎng)基消毒后的組培苗圖片。

圖8實(shí)施例1移栽成活的組培苗圖片。

具體實(shí)施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但實(shí)施例并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。除非特別說明，本發(fā)明所采用的試劑和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑和設(shè)備。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的ms，為國際通用的培養(yǎng)基，其成分和配制方法如下：

ms大量元素母液100倍：稱100l量溶解在1l蒸餾水中，配1l培養(yǎng)基取母液10ml。母液的具體配法為：分別稱硝酸銨165g，硝酸鉀190g，二水氯化鈣44g，七水硫酸鎂37g，磷酸二氫鉀17g，分別加蒸餾水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms微量元素母液1000倍：稱1000l量溶解在1l蒸餾水中，配1l培養(yǎng)基取母液1ml。母液的具體配法為：分別稱四水硫酸錳22.3g，七水硫酸鋅8.6g，硼酸6.2g，碘化鉀0.83g，二水鉬酸鈉2.5g，五水硫酸銅0.25g，六水氯化鈷0.25g，分別加蒸餾水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms鐵鹽母液100倍：稱100l量溶解在在1l蒸餾水中，配1l培養(yǎng)基取母液10ml。母液的具體配法為：分別稱乙二胺四乙酸二鈉3.73g，七水硫酸亞鐵2.78g，分別加蒸餾水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms有機(jī)母液100倍：稱100l量溶解在在1l蒸餾水中，配1l培養(yǎng)基取母液10ml。母液的具體配法為：分別稱煙酸0.05g，鹽酸吡哆素0.05g，鹽酸硫胺素0.01g，肌醇10g，甘氨酸0.2g，分別加蒸餾水溶解后再混合，最后定容于1l。

實(shí)施例1

一種海南三七根莖芽基部誘導(dǎo)再生植株的方法，包括如下步驟：

(a)外植體前處理：采集海南三七的根莖用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的貯藏根和須根后，放入質(zhì)量濃度0.3％的多菌靈粉劑溶液中浸泡消毒30min，然后取出晾干表面水分，如圖1所示。再放入洗凈消毒的河沙中，培養(yǎng)箱中33℃恒溫發(fā)芽，洗凈芽，如圖2所示，芽高6～18cm。消毒后，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留取芽基部為外植體材料。

(b)叢生芽誘導(dǎo)：將消毒好的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；如圖3所示，外植體為根莖芽基部，高約1～2cm，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)15d就可觀察到肉眼可見的綠點(diǎn)。外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至外植體基部形成叢生芽；如圖4所示，外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)60d就可形成3～5個(gè)叢生芽，外植體的啟動(dòng)率為98.50％，出芽指數(shù)為4.60[注：啟動(dòng)率＝(啟動(dòng)的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100％；出芽指數(shù)：外植體上的出芽數(shù)的平均數(shù)]。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤3.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁15.0％、蔗糖30g/l、卡拉膠粉10.0g/l。

步驟(b)所述外植體的消毒是先用0.3％高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30min，再用0.3％的百菌清溶液浸泡根莖芽30min，接著在自來水下反復(fù)沖洗根莖芽40min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留2～3cm高的根莖芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒18min，滅菌水沖洗4次，切掉距離芽基部兩頭各約0.3～0.5cm的部分，留約1～2cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

(c)增殖繼代：當(dāng)初代芽基部叢生芽長至4～6cm左右時(shí)，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接種到增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽；如圖5所示，為在繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d就可形成6‐9個(gè)叢生芽，增殖系數(shù)為7.56(增殖系數(shù)＝統(tǒng)計(jì)時(shí)的總芽數(shù)/接種時(shí)總芽數(shù))。所述增殖繼代培養(yǎng)基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤8.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁15.0％、蔗糖30g/l、卡拉膠粉10.0g/l。

(d)生根培養(yǎng)：當(dāng)繼代苗高4～7cm時(shí)，切下接種到生根培養(yǎng)基中；如圖6所示，為在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d就可形成白色的根。所述生根培養(yǎng)基成分為ms、萘乙酸0.10mg/l、香蕉泥15.0％、蔗糖30g/l、活性炭1.0g/l、卡拉膠粉10.0g/l。

(e)煉苗移栽：當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高5～8cm時(shí)，在溫室自然光照下煉苗10d，取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，用0.3％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分，如圖7所示，組培苗粗壯。移栽到進(jìn)口泥炭的基質(zhì)中，保持通風(fēng)透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，自然光照條件培養(yǎng)后得到移栽苗；如圖8所示，為在進(jìn)口泥炭中種植25d后得到長勢良好的移栽苗。

上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的ph都為5.8；培養(yǎng)基滅菌條件為125℃，40min。

步驟(b)、步驟(c)和步驟(d)所述培養(yǎng)溫度為25～30℃，光照強(qiáng)度為2300lx，光照時(shí)間控制為14h/d。

步驟(e)中如果溫度高于32℃，用風(fēng)機(jī)和水簾降溫。

實(shí)施例1從外植體誘導(dǎo)、繼代增殖到生根苗約需時(shí)100d的時(shí)間。

實(shí)施例2

一種海南三七根莖芽基部誘導(dǎo)再生植株的方法，包括以下步驟：

(a)外植體前處理：采集海南三七的根莖用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的貯藏根和須根后，放入質(zhì)量濃度0.1％的多菌靈粉劑溶液中浸泡消毒40min，然后取出晾干表面水分。再放入洗凈消毒的河沙中，培養(yǎng)箱中33℃恒溫發(fā)芽，洗凈根莖芽。消毒后，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留取芽基部為外植體材料。

(b)叢生芽誘導(dǎo)：將消毒好的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至外植體基部形成叢生芽，需時(shí)約65d就可長出2～3個(gè)叢生芽，外植體的啟動(dòng)率為83.60％，出芽指數(shù)為2.15；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤1.0mg/l、萘乙酸0.01mg/l、椰汁10.0％、蔗糖20g/l、卡拉膠粉9.5g/l；

步驟(b)所述外植體的消毒是以質(zhì)量百分比濃度計(jì)，先用0.1％高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽40min，再用0.1％的百菌清溶液浸泡根莖芽40min，接著在自來水下反復(fù)沖洗根莖芽30min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留2～3cm高的根莖芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.2％升汞溶液消毒15min，滅菌水沖洗5次，切掉距離芽基部兩頭各約0.3～0.5cm的部分，留約1～2cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

(c)增殖繼代：當(dāng)初代芽基部叢生芽長至4～6cm左右時(shí)，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)25d就可形成4～6個(gè)叢生芽，增殖系數(shù)為4.69；所述增殖繼代培養(yǎng)基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤3.0mg/l、萘乙酸0.05mg/l、椰汁10.0％、蔗糖20g/l、卡拉膠粉9.5g/l；

(d)生根培養(yǎng)：當(dāng)繼代苗高4～7cm時(shí)，切下接種到生根培養(yǎng)基中，需時(shí)約18d；所述生根培養(yǎng)基成分為ms、萘乙酸0.30mg/l、香蕉泥10.0％、活性炭1.5g/l、蔗糖20g/l、卡拉膠粉9.5g/l；

(e)煉苗移栽：當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高5～8cm時(shí)，在溫室自然光照下煉苗7d，取出試管苗，洗凈根部培養(yǎng)基，用0.1％的百菌清溶液浸泡30min，移栽到進(jìn)口泥炭的基質(zhì)中，保持通風(fēng)透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，自然光照條件培養(yǎng)后得到移栽苗。

上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的ph都為5.6；培養(yǎng)基滅菌條件為125℃，30min。

步驟(b)、步驟(c)和步驟(d)所述培養(yǎng)溫度為25～30℃，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間控制為14h/d。

步驟(e)中如果溫度高于32℃，用風(fēng)機(jī)和水簾降溫。

實(shí)施例2從外植體誘導(dǎo)、繼代增殖到生根苗約需時(shí)108d的時(shí)間。

實(shí)施例3

一種海南三七根莖芽基部誘導(dǎo)再生植株的方法，包括如下步驟：

(a)外植體前處理：采集海南三七的根莖用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的貯藏根和須根后，放入質(zhì)量濃度0.2％的多菌靈粉劑溶液中浸泡消毒35min，然后取出晾干表面水分。再放入洗凈消毒的河沙中，培養(yǎng)箱中33℃恒溫發(fā)芽，洗凈芽。消毒后，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留取芽基部為外植體材料。

(b)叢生芽誘導(dǎo)：將消毒好的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至外植體基部形成叢生芽，需時(shí)約63d，可形成3～4個(gè)叢生芽，外植體的啟動(dòng)率為95.70％，出芽指數(shù)為3.50；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤2.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁10.0％、蔗糖30g/l、卡拉膠粉10.0g/l；

步驟(b)所述外植體的消毒是先用0.2％高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30min，再用0.2％的百菌清溶液浸泡根莖芽30min，接著在自來水下反復(fù)沖洗根莖芽40min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留2～3cm高的根莖芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒18min，滅菌水沖洗4次，切掉距離芽基部兩頭各約0.3～0.5cm的部分，留約1～2cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

(c)增殖繼代：當(dāng)初代芽基部叢生芽長至4～6cm左右時(shí)，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)22d就能誘導(dǎo)5～7個(gè)叢生芽，增殖系數(shù)為5.87；所述增殖繼代培養(yǎng)基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤5.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁10.0％、蔗糖30g/l、卡拉膠粉10.0g/l；

(d)生根培養(yǎng)：當(dāng)繼代苗高4～7cm時(shí)，切下接種到生根培養(yǎng)基中，需時(shí)約17d，所述生根培養(yǎng)基成分為ms、萘乙酸0.50mg/l、香蕉泥10.0％、蔗糖30g/l、活性炭1.0g/l、卡拉膠粉10.0g/l；

(e)煉苗移栽：當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高5～8cm時(shí)，在溫室自然光照下煉苗10d，取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，用0.2％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分，移栽到進(jìn)口泥炭的基質(zhì)中，保持通風(fēng)透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，自然光照條件培養(yǎng)后得到移栽苗。

上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的ph都為5.8；培養(yǎng)基滅菌條件為125℃，40min。

步驟(b)、步驟(c)和步驟(d)所述培養(yǎng)溫度為25～30℃，光照強(qiáng)度為2300lx，光照時(shí)間控制為14h/d。

步驟(e)中如果溫度高于32℃，用風(fēng)機(jī)和水簾降溫。

實(shí)施例3從外植體誘導(dǎo)、繼代增殖到生根苗約需時(shí)102d的時(shí)間。

本發(fā)明采用海南三七的根莖芽基部為外植體，建立了高效的以芽繁芽途徑的植株再生體系，外植體初代培養(yǎng)60～65d，啟動(dòng)率87.50％～98.50％，出芽指數(shù)2.15～4.60，外植體大部分可以分化出2‐5個(gè)叢生芽，長勢較好；繼代增殖經(jīng)約20～25d培養(yǎng)，單個(gè)叢生芽基部可分化出4～9個(gè)叢生芽，可在100～108d內(nèi)完成從外植體誘導(dǎo)叢生芽、繼代增殖到生根苗形成的一個(gè)周期，單個(gè)叢生芽基部經(jīng)過繼代增殖，每個(gè)繼代增殖周期可增殖4.69～7.56倍個(gè)叢生芽，即單個(gè)外植體在100～108d內(nèi)可出芽10.08～34.77個(gè)。

現(xiàn)有技術(shù)中，劉盼盼(華南師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2013)將海南三七外植體分為假莖段(葉至塊根之間的假莖)、葉片、根狀莖、芽和莖尖(盆栽和組培苗)，結(jié)果盆栽的塊莖、假莖段和葉片通過誘導(dǎo)愈傷組織再分化獲得無菌苗的途徑均失??；組培苗的假莖段和葉片誘導(dǎo)愈傷分化來獲得無菌苗，由于愈傷組織增殖及誘導(dǎo)時(shí)間較久，并且愈傷至苗的誘導(dǎo)率不足10％，很難快速達(dá)到所需的無菌苗株數(shù)；組培苗的幼芽或莖尖，接種到ms+6‐ba3.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l的培養(yǎng)基中，20d左右有愈傷組織產(chǎn)生，30d左右有絨毛狀根生成，但也發(fā)現(xiàn)，接種到兩種培養(yǎng)基ms+6‐ba2.0/3.0mg/l+naa0.10mg/l上誘導(dǎo)，均只有10％誘導(dǎo)成苗，此種方法愈傷組織分化成苗率低。

吳丹(華南師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2014)將海南三七無菌苗的假莖段基部接種在ms+6‐ba2.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l培養(yǎng)基上，置于黑暗下培養(yǎng)，40d后誘導(dǎo)出愈傷組織，再接種到愈傷組織分化第一階段轉(zhuǎn)綠需時(shí)30d，此時(shí)每塊愈傷平均可得到5.69個(gè)芽點(diǎn)，再將轉(zhuǎn)綠的愈傷組織塊轉(zhuǎn)接入芽分化培養(yǎng)基中，40d左右可逐漸有苗長成，分化率在42％～67％，即僅僅從外植體誘導(dǎo)愈傷到分化成苗就需時(shí)110d，每塊愈傷分化成苗2.38～3.75個(gè)。

現(xiàn)有技術(shù)從外植體誘導(dǎo)愈傷到分化成苗就需時(shí)110d，而且每塊愈傷分化成苗2.38～3.75個(gè)；本發(fā)明單個(gè)外植體在100～108d內(nèi)可出芽10.08～34.77個(gè)，大大提高了海南三七的繁殖系數(shù)和減短了海南三七的繁殖周期，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的組培苗。本發(fā)明繁殖的海南三七種苗，能保持母株的優(yōu)良特性，移栽成活率可達(dá)90％以上，具有投入低、產(chǎn)出高的優(yōu)勢。