本發(fā)明涉及栓皮櫟無(wú)性繁殖技術(shù)，尤其是一種栓皮櫟初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
栓皮櫟（Quercus variabilis Bl）又名軟木櫟、粗皮青岡、白麻櫟，系殼斗科（Fagaceae）櫟屬喬木，樹(shù)冠廣卵形，樹(shù)干多，灰褐色，深縱裂，木栓層特厚。小枝淡褐色，雄花序生于當(dāng)年生枝下部，雌花單生或雙生與當(dāng)年生枝葉腋?；ㄆ?月；果翌年9-10月成熟。是中國(guó)重要的用材樹(shù)種。栓皮櫟喜光，常生于山地陽(yáng)坡，但幼樹(shù)以有側(cè)方庇蔭為好。對(duì)氣候，土壤的適應(yīng)性強(qiáng)。能耐-20℃的低溫，在pH4-8的酸性，中性及石灰性土壤中均有生長(zhǎng)，亦耐干旱、瘠薄、而以深厚、肥沃、適當(dāng)濕潤(rùn)而排水良好的壤土和沙質(zhì)壤土最適宜，不耐積水。產(chǎn)遼寧、河北、山西、陜西、甘肅、山東、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等省區(qū)。華北地區(qū)通常生于海拔800米以下的陽(yáng)坡，西南地區(qū)可達(dá)海拔2000-3000米。
目前，栓皮櫟常見(jiàn)的栽培方式為播種造林。組織培養(yǎng)技術(shù)是一種快速無(wú)性繁殖技術(shù)，選擇栓皮櫟優(yōu)良家系或者無(wú)性系為材料，通過(guò)組織培養(yǎng)方法繁殖苗木，既可以滿(mǎn)足生產(chǎn)上的數(shù)量要求，又可保持母本性狀。組織培養(yǎng)過(guò)程中，初代培養(yǎng)是制約組織培養(yǎng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵步驟，其中涉及了外植體的獲取、外植體的消毒、培養(yǎng)基選擇以及培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)體褐變、苗木玻璃化等重要問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種能克服芽誘導(dǎo)過(guò)程中外植體褐變以及玻璃化等問(wèn)題，提高芽誘導(dǎo)率，出芽指數(shù)以及萌芽生長(zhǎng)狀況，獲取數(shù)量多、質(zhì)量好的萌芽，從而滿(mǎn)足增殖培養(yǎng)的需要，促進(jìn)栓皮櫟組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立的栓皮櫟初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種栓皮櫟初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法，采用栓皮櫟基部萌條為外植體，通過(guò)外植體無(wú)菌處理后，將外植體接種于優(yōu)質(zhì)初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于適宜的溫度、濕度和光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)；其操作步驟為，
（1）外植體選擇：選擇栓皮櫟基部萌發(fā)的半木質(zhì)化的萌條為外植體；
（2）外植體消毒及接種：將栓皮櫟萌條經(jīng)過(guò)洗潔精清洗，流水沖洗和化學(xué)試劑處理消毒后，剪切成莖段接入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；
（3）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將接種后的外植體置于適宜室內(nèi)條件下培養(yǎng)。
以上所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.0～2.0mg/L+維生素C10mg/L+葡萄糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。
以上所述的改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3 850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 320 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇85 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
以上所述的萌條是長(zhǎng)為6~9cm、直徑0.2～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條。
以上步驟（2）所述的消毒及接種方法是將栓皮櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1~5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10~15 min后置于流水下沖洗1~2 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5~4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
以上步驟（3）所述的適宜室內(nèi)條件為：暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500～1000 lx，光照8～12h/d；培養(yǎng)溫度20±1℃，濕度為50~55 %。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果如下：
1、本發(fā)明采用1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，同時(shí)重點(diǎn)調(diào)整了與栓皮櫟出芽相關(guān)的微量元素和有機(jī)成分，使得培養(yǎng)基更科學(xué)，更有針對(duì)性，有效的克服了栓皮櫟組織培養(yǎng)芽誘導(dǎo)過(guò)程中易出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象，更易促使栓皮櫟芽誘導(dǎo)的發(fā)生，促進(jìn)了萌芽的生長(zhǎng)速度和健壯度。
2、本發(fā)明以基部長(zhǎng)6~9 cm長(zhǎng)的半木質(zhì)化粗壯萌條作為外植體，保證了外植體較強(qiáng)的分生能力，促進(jìn)芽的誘導(dǎo)；本發(fā)明在外植體采集后進(jìn)行洗凈、消毒，有效降低外植體的污染率，提高了出芽率。
3、本發(fā)明將接種后的外植體置于溫度為度20±1℃，濕度為50~55%，光照由暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到強(qiáng)度為500～1000 lx的室內(nèi)條件下培養(yǎng)，溫度和濕度偏低，光照強(qiáng)度也不高的室內(nèi)條件，有利于減少芽誘導(dǎo)過(guò)程中玻璃化的發(fā)生。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1：
選擇栓皮櫟基部萌發(fā)、長(zhǎng)為6~7cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將栓皮櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗2 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.0mg/L+維生素C10mg/L+葡萄糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 320 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500 lx，光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例2：
選擇栓皮櫟基部萌發(fā)、長(zhǎng)為7~8cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將栓皮櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為2%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗1.5 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+維生素C10mg/L+葡萄糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 320 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500lx，光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例3：
選擇栓皮櫟基部萌發(fā)、長(zhǎng)為7~8cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將栓皮櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為4%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+維生素C10mg/L+葡萄糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 320 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx，光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例4：
選擇栓皮櫟基部萌發(fā)、長(zhǎng)為8~9cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將栓皮櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.0mg/L+維生素C10mg/L+葡萄糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3850 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 320 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx，光照8h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。