本發(fā)明涉及一種華榛誘導(dǎo)叢生芽快繁方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

華榛又名山白果，屬樺木科榛屬落葉喬木，為中國(guó)特有的稀有珍貴樹(shù)種，是榛屬中罕見(jiàn)的大喬木，其材質(zhì)優(yōu)良，種子可食，含油量50％，華榛的種子形似栗子，外殼堅(jiān)硬，果仁肥白而圓，有香氣，含油脂量很大，有“堅(jiān)果之王”的稱(chēng)呼，與扁桃、胡桃、腰果并稱(chēng)為“四大堅(jiān)果”。

本發(fā)明技術(shù)采用華榛一年生實(shí)生苗帶芽莖段和成熟的種胚為材料，兩種途徑進(jìn)行誘導(dǎo)定芽及定芽誘導(dǎo)叢生芽，從而建立華榛快繁再生體系。

目前，有關(guān)樺木科榛屬方面以榛子(平榛與歐榛雜交)植物組培相關(guān)報(bào)道，主要以當(dāng)年生植物莖段為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁研究，無(wú)華榛方面相關(guān)報(bào)道。宗長(zhǎng)玲等在平榛離體培養(yǎng)技術(shù)的研究中、劉家寧等在平歐雜交榛的組織培養(yǎng)中，均以DKW為基本培養(yǎng)基，周亞崎等在平歐雜種榛的繼代培養(yǎng)條件優(yōu)化研究中，以改良NRW為基本培養(yǎng)基，進(jìn)行榛子莖段誘導(dǎo)定芽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種華榛誘導(dǎo)叢生芽快繁方法，包括如下步驟：

莖段快繁體系的建立

外植體選擇：分別采集3月、4月、5月華榛播種出苗后7-10d健壯實(shí)生小苗，去除根部，保留子葉并摘去其上部2片葉，自來(lái)水清洗植株表面灰塵，洗衣粉浸泡8min后自來(lái)水沖洗1h，放置超凈工作臺(tái)，用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞消毒15min，無(wú)菌水清洗5-6遍，切成2cm帶芽莖段，置于無(wú)菌濾紙上吸干表面水分備用；

莖段誘導(dǎo)萌發(fā)：將帶芽莖段接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基中，在溫度26±1℃、濕度80±5％、光照14h/L、光照強(qiáng)度1800-2000lx下培養(yǎng)，一周后定芽開(kāi)始萌動(dòng)，培養(yǎng)三周后節(jié)間抽長(zhǎng)，每株有2-3片新葉展開(kāi)，葉色呈翠綠色；

種胚快繁體系的建立

外植體預(yù)處理：采集9-10月份華榛成熟種子，將進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的華榛成熟種子提前7d處理，鉗子去除外果皮，堅(jiān)硬的內(nèi)果皮，先進(jìn)行80℃水中浸泡24h的熱處理,再進(jìn)行0℃冷藏室5d冷藏的冷處理，然后取出種子，放入GA₃5.0mg·L^-1浸泡1h.

外植體采集：將預(yù)處理后的華榛種子用洗衣粉浸泡6min，自來(lái)水沖洗1h，放置超凈工作臺(tái)上，采用二次消毒法。先用75％酒精浸泡30s，0.1％升汞消毒8min，無(wú)菌水清洗5-6遍，再去除內(nèi)種皮，0.05％升汞消毒3min,無(wú)菌水清洗5-6遍，置于無(wú)菌濾紙上吸干材料表面水分備用；啟動(dòng)培養(yǎng)：

在超凈工作臺(tái)上將消毒好的華榛種子，將胚乳切去1/2(保留含胚芽部分)，接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基上，所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+KT1.0mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+GA31.0mg·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1。在暗培養(yǎng)15d后，再在溫度26±1℃、濕度80±5％、光照14h/L、光照強(qiáng)度1800-2000lx下培養(yǎng)，7d后胚乳膨大、胚根長(zhǎng)出、子葉展開(kāi)，10-20d，形成單芽且有2-3片新葉展開(kāi)，葉色呈翠綠色；

叢生芽誘導(dǎo)：

將莖段和種胚誘導(dǎo)的單芽，切成3cm接至MS+KT1.5mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+GA₃1.0mg·L^-1+胰蛋白胨0.1g·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1上，通過(guò)10d培養(yǎng)，定芽基部產(chǎn)生愈傷組織，連續(xù)培養(yǎng)20d后由胚性愈傷團(tuán)逐步形成叢生芽，快速建立華榛誘導(dǎo)叢生芽快繁體系。

華榛快繁發(fā)明技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

實(shí)生苗帶芽莖段誘導(dǎo)單芽及單芽誘導(dǎo)叢生芽較多年生植株材料脫分化、再分化能力更強(qiáng)。

將植物種胚先進(jìn)行7d的預(yù)處理，再胚乳切割1/2(保留含胚芽部分)處理后，能夠快速打破種子休眠，有利于胚的萌發(fā)和胚性愈傷的產(chǎn)生。

兩種材料誘導(dǎo)定芽較多年生植株好消毒，誘導(dǎo)快，萌芽率高，利于胚性愈傷團(tuán)的形成，加快分裂能力，形成不定芽。

附圖說(shuō)明

圖1種胚快繁體系中華榛種子胚乳膨大。

圖2種胚快繁體系中胚乳膨大、胚根長(zhǎng)出、子葉展開(kāi)。

圖3種胚快繁體系中形成完整植株。

圖4啟動(dòng)培養(yǎng)階段莖段定芽誘導(dǎo)長(zhǎng)勢(shì)。

圖5胚性愈傷團(tuán)形成芽叢。

圖6叢生芽誘導(dǎo)。

具體實(shí)施方式

莖段快繁體系的建立

外植體來(lái)源

采集種質(zhì)資源圃一年生生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害華榛7-10d實(shí)生苗。

外植體消毒

分別采集3月、4月、5月華榛播種出苗后7-10d健壯實(shí)生小苗，去除根部，保留子葉并摘去其上部2片葉，用自來(lái)水清洗植株表面灰塵，用洗衣粉浸泡8min，自來(lái)水沖洗1h，放置超凈工作臺(tái)，用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞消毒15min，無(wú)菌水清洗5-6遍，切成2cm帶芽莖段，置于無(wú)菌濾紙上吸干表面水分備用。

啟動(dòng)培養(yǎng)基

將處理好的材料接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基：MS+KT1.0mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+GA₃1.0mg·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1上，培養(yǎng)條件為：溫度26±1℃、濕度80±5％、光照14h/L、光照強(qiáng)度1800-2000lx。一周后定芽開(kāi)始萌動(dòng)，培養(yǎng)三周后節(jié)間抽長(zhǎng)，每株有2-3片新葉展開(kāi)，葉色呈翠綠色，定芽誘導(dǎo)率達(dá)到96.4％以上。

種胚快繁體系的建立

外植體

采集三峽種質(zhì)資源圃華榛成熟飽滿(mǎn)的種子。

外植體預(yù)處理

采集9-10月份華榛成熟種子，將進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的華榛成熟種子提前7d處理，鉗子去除外果皮，堅(jiān)硬的內(nèi)果皮，先進(jìn)行80℃水中浸泡24h的熱處理,再進(jìn)行0℃冷藏室5d冷藏的冷處理，然后取出種子，放入GA₃5.0mg·L^-1浸泡1h。

外植體消毒

將預(yù)處理后的華榛種子先洗衣粉浸泡6min，自來(lái)水沖洗1h，放置超凈工作臺(tái)上，采用二次消毒法。用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞消毒8min，無(wú)菌水清洗5-6遍，再去除內(nèi)種皮，0.05％升汞消毒3min，無(wú)菌水清洗5-6遍，置于無(wú)菌濾紙上吸干材料表面水分備用；

啟動(dòng)培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上將消毒好華榛種子，將胚乳切去1/2(保留含胚芽部分)，接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基：MS+GA₃3.0mg·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1上。先暗培養(yǎng)15d后，再進(jìn)行培養(yǎng)室正常培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度26±1℃、濕度80±5％、光照14h/L、光照強(qiáng)度1800-2000lx，7d后胚乳膨大、胚根長(zhǎng)出、子葉展開(kāi)。3周后統(tǒng)計(jì)萌芽率為92％。

叢生芽誘導(dǎo)

將莖段和種胚誘導(dǎo)的單芽，切成3cm接至MS+KT1.5mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+GA₃1.0mg·L^-1+胰蛋白胨0.1g·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1上。通過(guò)10d培養(yǎng)，定芽基部產(chǎn)生胚性愈傷組織，連續(xù)培養(yǎng)20d后由胚性愈傷團(tuán)逐步形成叢生芽。