專利名稱：小桐子快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物組培育苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小桐子快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
小桐子(/airoMa curcas L )，又叫麻瘋樹、麻風樹、膏桐、黑皂樹、木花生、油蘆子、亮桐、臭梧桐等，屬大戟科(^Modiaceae)麻瘋樹屬ijatropha L )，落葉灌木或小喬木，是一種多年生木本油料植物。小桐子原產(chǎn)美洲，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區(qū)。小桐子可全株開發(fā)，其果實、枝、葉均能利用。小桐子種子含油率高，經(jīng)過加工可制成生物柴油。小桐子種子、樹皮、葉、根和乳汁中含有多種成分的生物藥源，可提取制作生物醫(yī)藥和生物農(nóng)藥。小桐子種子加工后的油餅蛋白質(zhì)含量較高，脫毒后可制作生物飼料，未脫毒的可制作優(yōu)質(zhì)的有機生物肥。另外，小桐子莖葉有毒，牲畜不吃，病蟲較少，不易燃燒， 可作為田間地邊的生物籬和防風防火屏障。培育小桐子能源林，利用其種子提煉生物柴油是小桐子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。我國現(xiàn)有栽培和半野生的小桐子，其繁殖主要靠種子繁殖和扦插繁殖，繁殖周期長、成本高。又因其為木本植物，采用常規(guī)育種來改變其遺傳性狀相當困難，因此采用現(xiàn)代生物技術(shù)如轉(zhuǎn)基因技術(shù)等成為首選。一些國家和地區(qū)已經(jīng)開始了對小桐子進行了分子水平的育種工作。選育的優(yōu)良品種大量繁殖，通過組培方式快速繁殖小桐子將在小桐子選育種生產(chǎn)上有重要的應用價值。目前，關(guān)于小桐子的組織培養(yǎng)及快速繁殖的報道較多，例如陸偉達、魏琴、唐琳等發(fā)表的《麻瘋樹愈傷組織的誘導及快速繁殖》(《應用與環(huán)境生物學報》，2003，9 (2) 127^130.)以及陳金洪、高敏、黃記生發(fā)表的《麻瘋樹莖段離體培養(yǎng)及快速繁殖研究》(《廣西農(nóng)業(yè)科學》，2006,37 (3):22廣223.)等論文均涉及小桐子的組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)。但是，現(xiàn)有技術(shù)存在以下不足
1、均采用不同的激素濃度組合誘導愈傷組織和芽分化，未經(jīng)過再生芽增殖，其增殖速率低；
2、均采用不同外植體誘導愈傷組織，其不同外植體誘導頻率相差及大。采用上述方法不能達到工廠化生產(chǎn)的需要，另有研究者進行了腋芽快繁研究，例如李化、曾妮、賈勇炯等人發(fā)表的《麻瘋樹的促腋芽分枝快繁及生根誘導》(《四川大學學報自然科學版》，2006，43 (5):1116 1120.)，所用外植體為種子萌發(fā)的胚芽來誘導增殖。 但尚未見公開采用再生芽來誘導增殖的繁殖技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種小桐子快速繁殖方法，以通過組織培養(yǎng)大規(guī)模高效地生產(chǎn)小桐子。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種小桐子快速繁殖方法，包括如下步驟準備再生芽步驟，以小桐子成熟種子為材料，經(jīng)培育獲得無菌再生芽； 增殖誘導步驟，將再生芽切下，接入增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，從而獲得增殖的叢芽； 伸長培養(yǎng)步驟，將增殖后的叢芽切下，接入伸長培養(yǎng)基進而獲得莖葉伸長的均勻的
芽；
壯苗培養(yǎng)步驟，將伸長后的芽接入壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)； 生根移栽步驟，選取壯苗培養(yǎng)后莖葉生長均勻的芽切下，用吲哚丁酸浸泡后再接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，生出符合移栽要求的根后進行煉苗移栽。進一步地，所述誘導增殖步驟中，增殖培養(yǎng)基的成分為MS+0. Γ2 mg/L 6_芐基嘌呤+0. 01 2 mg/L吲哚丁酸+0 5 mg/L的硝酸銀，附加3%蔗糖和0. 7%瓊脂，ρΗ5· 8。進一步地，所述誘導增殖步驟中，培養(yǎng)條件是溫度控制在M 26°C，光照時間為 12 h/d培養(yǎng)20 50天，光照強度為1600^2000 Ix0進一步地，所述伸長培養(yǎng)步驟中，伸長培養(yǎng)基成分為MS +0. Γ2 mg/L 6_芐基嘌呤和(Tl mg/L的赤霉素，附加3%蔗糖和0. 7%瓊脂，ρΗ5· 8。進一步地，所述伸長培養(yǎng)步驟中，培養(yǎng)條件是溫度控制在24l6°C，光照時間為 12 h/d培養(yǎng)10 30天，光照強度為1600^2000 Ix0進一步地，所述壯苗培養(yǎng)步驟中，壯苗培養(yǎng)基中含有MS+0. Γ2 mg/L 6_芐基嘌呤 +0.0廣2 mg/L吲哚丁酸+0 5 mg/L的硝酸銀+(TlO %椰汁。進一步地，所述壯苗培養(yǎng)步驟中，培養(yǎng)條件為溫度控制在M 26°C，光照時間為 12 h/d培養(yǎng)10 30天，光照強度為1600^2000 Ix0進一步地，所述生根移栽步驟中，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0. Γ2 mg/L的吲哚丁酸， 需附加廣2 %的蔗糖、0. 3 0. 7 %的瓊脂，調(diào)pH值至5. 8。進一步地，所述生根移栽步驟中，壯苗培養(yǎng)后莖葉生長均勻的芽的切法為選取生長均勻的芽在結(jié)下廣4 mm處平切。進一步地，所述生根移栽步驟中，切下的芽在接入生根培養(yǎng)基之前先在0. Γ2 mg/ L的吲哚丁酸中浸泡5 120 min。通過采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有如下有益效果本發(fā)明中采用再生芽來誘導增殖，可用于小桐子遺傳轉(zhuǎn)化后優(yōu)良品系增殖，為小桐子的人工繁殖、脫毒苗生產(chǎn)、繁殖優(yōu)良品種開辟高效途徑。本發(fā)明所用的增殖培養(yǎng)基添加有細胞分裂素6-芐基嘌呤和生長素吲哚丁酸，增殖倍數(shù)多，平均可達3飛倍，因此，僅需少量的芽就可在短時間內(nèi)得到大量的材料，為小桐子組培中選育的優(yōu)良品種的大批量繁殖奠定了基礎。本發(fā)明的方法中在得到增殖的芽后進行了莖葉伸長培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)，保證了增殖芽都能順利發(fā)育為完整植株。本發(fā)明的方法是在無菌操作中完成，不受時間和地域的限制，可隨時完成。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種小桐子快速繁殖方法，包括以下步驟
準備再生芽步驟，以小桐子成熟種子為材料，經(jīng)培育獲得無菌再生芽； 增殖誘導步驟，將再生芽切下，接入增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，從而獲得增殖的叢芽；伸長培養(yǎng)步驟，將增殖后的叢芽切下，接入伸長培養(yǎng)基進而獲得莖葉伸長的均勻的
芽；
壯苗培養(yǎng)步驟，將伸長后的芽接入壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)； 生根移栽步驟，選取壯苗培養(yǎng)后莖葉生長均勻的芽切下接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，待培養(yǎng)出符合移栽要求的根后進行煉苗移栽。其中，準備再生芽步驟Sl主要是為獲得無菌再生芽以供后續(xù)增殖誘導步驟使用， 采用現(xiàn)有的各種利用種子培育發(fā)芽技術(shù)均可實現(xiàn)本步驟的目的。增殖誘導步驟S2進一步包括以下工藝
52.1將分化出的再生芽切下；
S2.2將切下的再生芽接入增殖培養(yǎng)基，該增殖培養(yǎng)基是指MS+0. Γ2 mg/L 6-芐基嘌呤+0.01 2 mg/L吲哚丁酸+0 5 mg/L的硝酸銀，需附加3 %蔗糖、0.7 %瓊脂，pH5.8。S2. 3培養(yǎng)條件為溫度24l6°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)20 50天，光照強度為 1600 2000 lx。伸長培養(yǎng)步驟S3進一步包括以下工藝
53.1將增殖后的叢芽切下接入伸長培養(yǎng)基，該伸長培養(yǎng)基為MS +0. Γ2 mg/L 6-芐基嘌呤和(Tl mg/L的赤霉素，需附加3 %蔗糖、0. 7 %瓊脂，pH5. 8。S3. 2培養(yǎng)條件為溫度24l6°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)20 50天，光照強度為 1600 2000 lx。壯苗培養(yǎng)步驟S4進一步包括以下工藝
54.1伸長后的芽切下接入壯苗培養(yǎng)基，該壯苗培養(yǎng)基成分包括MS+0.廣2 mg/L 6-芐基嘌呤+0.0廣2 mg/L吲哚丁酸+0 5 mg/L的硝酸銀+(TlO %椰汁;
S4.2培養(yǎng)溫度控制在24l6°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)10 30天，光照強度為 1600 2000 lx。生根移栽步驟S5中進一步包括以下工藝
55.1選取莖葉生長均勻的芽切下，切法為苗在結(jié)下廣4 mm處平切； S5. 2并在0. Γ2 mg/L的吲哚丁酸中浸泡5 120 min，接入生根培養(yǎng)基；
S5.3待培養(yǎng)出符合移栽要求的根后進行煉苗移栽，通常地，當培養(yǎng)出3條以上的根， 且每條根長度為3cm長時即可進行煉苗移栽。下面結(jié)合幾個具體的實施例詳述本發(fā)明的實施方案。需要說明的是，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實例來限定本發(fā)明的保護范圍。此外，如前所述，采用現(xiàn)有的各種利用種子培育發(fā)芽技術(shù)均可實現(xiàn)準備再生芽步驟Si的目的，該準備再生芽步驟Sl并非本發(fā)明創(chuàng)新的核心所在，因此，在以下各實施例中，將不再特別描述準備再生芽步驟Si，而直接從增殖誘導步驟S2開始闡述。實施例1
本實例以云南元謀野生小桐子種子為材料，樣品的總數(shù)量及經(jīng)各處理步驟后的存活數(shù)量請參考表1。各主要工藝步驟具體如下
增殖誘導步驟S2:將分化出的再生芽切下，接入增殖培養(yǎng)基MP8，即MS+1.0 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 01mg/L吲哚丁酸+0. 025 mg/L的硝酸銀，并附加3%蔗糖和0. 7%瓊脂，pH5. 8，溫度控制在對！，光照時間為12 h/d培養(yǎng)30天，光照強度為1800 Ix0
伸長培養(yǎng)步驟S3 將增殖后的叢芽切下，接種到伸長培養(yǎng)基SEB3，即MS+0. 3 mg/L 6-芐基嘌呤和0. 25 mg/L的赤霉素，并附加3 %蔗糖和0. 7%瓊脂，ρΗ5· 8，誘導莖葉伸長， 培養(yǎng)溫度控制在對 261，光照時間為12 h/d培養(yǎng)30天，光照強度為160(T2000 Ix0壯苗培養(yǎng)步驟S4 伸長后的芽切下接入壯苗培養(yǎng)基MCl，即MS+1. 0 mg/L 6_芐基嘌呤+0.01 mg/L吲哚丁酸+0 mg/L的硝酸銀+5 %椰汁，進行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在 ^°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)18天，光照強度2000 Ix0生根移栽步驟S5 取滅菌的盤，墊上無菌濾紙，加入少量無菌水；挑取長勢均勻 (對于長勢不均勻的芽要再經(jīng)過壯苗培養(yǎng)后才能進行生根培養(yǎng))的芽切下，切法為在芽的結(jié)下2 mm處平切，并在0.3 mg/L的吲哚丁酸中浸泡5 min，浸泡過程中盡量只讓芽的切口處接觸到液體；然后取出芽接種到生根培養(yǎng)基R2中誘導生根，該生根培養(yǎng)基R2成分為 1/2MS+0. 3 mg/L的吲哚丁酸，并附加1%的蔗糖和0. 35%的瓊脂，并調(diào)pH值至5. 8。培養(yǎng)條件是溫度控制在M 26°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)14天，光照強度為1600 Ix0選取已生根至少3條的生根苗，在自然光條件下過度廣3星期，逐漸開蓋煉苗并移栽至溫室。實施例2
本實例以云南元謀野生小桐子種子為材料，樣品的總數(shù)量及經(jīng)各處理步驟后的存活數(shù)量請參考表1。各主要工藝步驟具體如下
增殖誘導步驟將分化出的再生芽切下，接入增殖培養(yǎng)基MP16，即MS+2.0 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 1 mg/L吲哚丁酸+1 mg/L的硝酸銀，并附加3%蔗糖和0. 7%瓊脂，pH5. 8，培養(yǎng)溫度控制在沈！，光照時間為12 h/d培養(yǎng)35天，光照強度為2000 Ix0伸長培養(yǎng)步驟將增殖后的叢芽切下，接種到伸長培養(yǎng)基SEBlO JPMS +2 mg/L 6-芐基嘌呤和1 mg/L的赤霉素，并附加3 %蔗糖和0.7 %瓊脂，pH5. 8，誘導莖葉伸長，培養(yǎng)溫度控制在^°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)20天，光照強度為1800 Ix0壯苗培養(yǎng)步驟伸長后的芽切下接入壯苗培養(yǎng)基MC2，即改良MS+2. 0 mg/L 6_芐基嘌呤+0.1 mg/L吲哚丁酸+1 mg/L的硝酸銀+10 %椰汁，進行壯苗培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度控制在 ^°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)14天，光照強度2000 Ix0生根移栽步驟取滅菌的盤，墊上無菌濾紙，加入少量無菌水；挑取長勢均勻的芽切下，切法為在芽的結(jié)下1 mm處平切，并在1 mg/L的吲哚丁酸中浸泡120 min，浸泡過程中盡量只讓芽的切口處接觸到液體；然后取出芽接種到生根培養(yǎng)基R2，即1/2MS+1 mg/L的吲哚丁酸，并附加2、的蔗糖和0. 7%的瓊脂，并調(diào)pH值至5. 8，誘導生根。培養(yǎng)條件是溫度控制在對 261，光照時間為12 h/d培養(yǎng)20天，光照強度為1600 Ix0選取已生根至少 3條的生根苗，在自然光條件下過度廣3星期，逐漸開蓋煉苗并移栽至溫室。實施例3
本實例以云南元謀野生小桐子種子為材料，樣品的總數(shù)量及經(jīng)各處理步驟后的存活數(shù)量請參考表1。各主要工藝步驟具體如下
增殖誘導步驟將分化出的再生芽切下，接入增殖培養(yǎng)基ΜΡ0，即MS+0. 1 mg/L 6-芐基嘌呤+0. 01 mg/L吲哚丁酸+5 mg/L的硝酸銀，并附加3%蔗糖和0. 7%瓊脂，ρΗ5· 8，培養(yǎng)溫度控制在沈！，光照時間為12 h/d培養(yǎng)40天，光照強度為2000 Ix0伸長培養(yǎng)步驟將增殖后的叢芽切下，接種到伸長培養(yǎng)基SEBl JPMS +0.1 mg/L 6-芐基嘌呤和0. 5 mg/L的赤霉素，并附加3 %蔗糖和0. 7%瓊脂，pH5. 8，誘導莖葉伸長，培養(yǎng)溫度控制在M 26°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)30天，光照強度為2000 Ix0壯苗培養(yǎng)步驟伸長后的芽切下接入壯苗培養(yǎng)基MC1，即MS+0. 3 mg/L 6_芐基嘌呤+0.1 mg/L吲哚丁酸+0.5 mg/L的硝酸銀+0 %椰汁，進行壯苗培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度控制在 ^°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)20天，光照強度2000 Ix0生根移栽步驟取滅菌的盤，墊上無菌濾紙，加入少量無菌水；挑取長勢均勻的芽切下，切法為在芽的結(jié)下4 mm處平切，并在2 mg/L的吲哚丁酸中浸泡60min，浸泡過程中盡量只讓芽的切口處接觸到液體；然后取出芽接種到生根培養(yǎng)基R2，即1/2 MS+2 mg/L的吲哚丁酸，并附加1. 5%的蔗糖和7%的瓊脂，并調(diào)pH值至5. 8，誘導生根。其培養(yǎng)的條件是 溫度控制在M 26°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)18天，光照強度為1600 Ix0選取已生根至少3條的生根苗，在自然光條件下過度廣3星期，逐漸開蓋煉苗并移栽至溫室。表1本發(fā)明各實施例中的再生率及增值率
權(quán)利要求
1.一種小桐子快速繁殖方法，其特征在于，包括如下步驟準備再生芽步驟，以小桐子成熟種子為材料，經(jīng)培育獲得無菌再生芽；增殖誘導步驟，將再生芽切下，接入增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，從而獲得增殖的叢芽；伸長培養(yǎng)步驟，將增殖后的叢芽切下，接入伸長培養(yǎng)基進而獲得莖葉伸長的均勻的芽；壯苗培養(yǎng)步驟，將伸長后的芽接入壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)；生根移栽步驟，選取壯苗培養(yǎng)后莖葉生長均勻的芽切下，用吲哚丁酸浸泡后再接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，生出符合移栽要求的根后經(jīng)煉苗后，進行移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述增殖誘導步驟中， 增殖培養(yǎng)基的成分為:MS+0. Γ2 mg/L 6-芐基嘌呤+0.0廣2 mg/L吲哚丁酸+0 5 mg/L的硝酸銀，附加3%蔗糖和0. 7%瓊脂，pH5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述增殖誘導步驟中，培養(yǎng)條件是溫度控制在M 26°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)2(Γ50天，光照強度為 1600 2000 lx。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述伸長培養(yǎng)步驟中， 伸長培養(yǎng)基成分為MS +0. Γ2 mg/L 6-芐基嘌呤和(Tl mg/L的赤霉素，附加3%蔗糖和 0. 7% 瓊脂，ρΗ5· 8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述伸長培養(yǎng)步驟中，培養(yǎng)條件是溫度控制在M 26°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)1(Γ30天，光照強度為 1600 2000 lx。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述壯苗培養(yǎng)步驟中， 壯苗培養(yǎng)基中含有:MS+0. Γ2 mg/L 6-芐基嘌呤+0.0廣2 mg/L吲哚丁酸+0 5 mg/L的硝酸銀+(TlO %椰汁。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述壯苗培養(yǎng)步驟中，培養(yǎng)條件為溫度控制在M 26°C，光照時間為12 h/d培養(yǎng)1(Γ30天，光照強度為 1600 2000 lx。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述生根移栽步驟中， 生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0. Γ2 mg/L的吲哚丁酸，并附加廣2 %的蔗糖和0. 3 0. 7 %的瓊脂， 調(diào)PH值至5.8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述生根移栽步驟中， 壯苗培養(yǎng)后莖葉生長均勻的芽的切法為選取生長均勻的芽在結(jié)下廣4 mm處平切。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或8或9所述的小桐子快速繁殖方法，其特征在于所述生根移栽步驟中，切下的芽在接入生根培養(yǎng)基之前先在0. Γ2 mg/L的吲哚丁酸中浸泡5 120 min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小桐子快速繁殖方法，包括如下步驟準備再生芽步驟，以小桐子成熟種子為材料，經(jīng)培育獲得無菌再生芽；增殖誘導步驟，將再生芽切下，接入增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，從而獲得增殖的叢芽；伸長培養(yǎng)步驟，將增殖后的叢芽切下，接入伸長培養(yǎng)基進而獲得莖葉伸長的均勻的芽；壯苗培養(yǎng)步驟，將伸長后的芽接入壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)；生根移栽步驟，選取壯苗培養(yǎng)后莖葉生長均勻的芽切下接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，生出符合移栽要求的根后進行煉苗移栽。本發(fā)明采用再生芽來誘導增殖，增殖倍數(shù)高，可用于小桐子遺傳轉(zhuǎn)化后優(yōu)良品系增殖，為小桐子的人工繁殖、脫毒苗生產(chǎn)、大批量繁殖優(yōu)良品種開辟高效途徑。
文檔編號A01H4/00GK102405832SQ20111023766
公開日2012年4月11日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者孔曉香, 孫懷娟, 李耿光, 李艷梅, 陳小蓮 申請人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司