一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物生物技術(shù)方法，特別是一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]山豆根，也稱廣豆根、南豆根，為豆科植物越南槐(Sophora tonkinensisGapnep.)的干燥根及根莖，分布于我國(guó)南部，以廣西產(chǎn)量最大。具有清火解毒、消腫止痛等功效，可以治療喉癰、喉風(fēng)、喉痹、牙齦腫痛、喘滿熱咳、肝炎、便秘、黃疸、下痢、痔疾、禿瘡、疥癬及蚊、蟲、犬咬傷等。醫(yī)藥工業(yè)用山豆根作為原料，大量研制開發(fā)治療肝炎的針劑、咽喉腫痛的片劑以及抗腫瘤的中成藥，同時(shí)工業(yè)上也用于提取苦參堿、氧化苦參堿等成分，廣泛應(yīng)用于制藥和植物源農(nóng)藥的生產(chǎn)。
[0003]山豆根生長(zhǎng)緩慢，分布零星。由于用藥量的增加以及使用途徑的拓展，山豆根的市場(chǎng)需求量不斷增大，藥材的價(jià)格也不斷上漲，從而導(dǎo)致山豆根資源的無(wú)節(jié)制采挖，野生資源瀕臨枯竭。毛狀根因具有生長(zhǎng)速度快、遺傳穩(wěn)定性好、合成能力強(qiáng)且穩(wěn)定、向培養(yǎng)基中釋放部分代謝產(chǎn)物等特點(diǎn)，是生產(chǎn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的立項(xiàng)載體。為了緩解野生資源的壓力，減少野生資源的使用，許多企業(yè)開始利用毛狀根發(fā)酵的途徑來(lái)生產(chǎn)工業(yè)用次生代謝產(chǎn)物的替代資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法，它能夠快速的繁殖山豆根毛狀根，以供后續(xù)大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)工業(yè)用山豆根的替代資源。
[0005]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的:一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0006](I)無(wú)菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.1￥八％升汞消毒lOmin，再用無(wú)菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)，獲得山豆根無(wú)菌苗子葉，其中MS培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8;
[0007](2)R1601發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)山豆根無(wú)菌子葉發(fā)根:將山豆根的無(wú)菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無(wú)菌水為對(duì)照，然后用無(wú)菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個(gè)無(wú)菌子葉。當(dāng)誘導(dǎo)出的根長(zhǎng)至約2cm時(shí)，在無(wú)菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接I次，直至無(wú)菌，獲得無(wú)菌毛狀根。
[0008](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行快速繁殖，培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的，其中1/2MS繁殖培養(yǎng)液中含0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.1-1.0mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0009]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于:
[0010](I)采用本方法進(jìn)行山豆根毛狀根繁殖，具有生長(zhǎng)速度快、遺傳穩(wěn)定性好、合成能力強(qiáng)且穩(wěn)定、向培養(yǎng)基中釋放部分代謝產(chǎn)物等特點(diǎn)，繁殖倍數(shù)達(dá)到39-55倍，是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物理想的載體。
[0011](2)本方法獲得的毛狀根易于進(jìn)行大量繁殖培養(yǎng)，能夠進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)以作為工業(yè)用山豆根的替代資源來(lái)提取苦參堿、氧化苦參堿等次生代謝產(chǎn)物，滿足工業(yè)需要，具有重大應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明。
[0013]實(shí)施例1
[0014]本發(fā)明所述山豆根毛狀根的快速繁殖方法的一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟:
[0015](I)無(wú)菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.1?八％升汞消毒lOmin，再用無(wú)菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)，獲得山豆根無(wú)菌苗，其中MS培養(yǎng)基中添加30g//L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8;
[0016](2)R1601發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)山豆根無(wú)菌子葉發(fā)根:將山豆根的無(wú)菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無(wú)菌水為對(duì)照，然后用無(wú)菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個(gè)無(wú)菌子葉。當(dāng)誘導(dǎo)出的根長(zhǎng)至約2cm時(shí)，在無(wú)菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接I次，直至無(wú)菌，獲得無(wú)菌毛狀根。
[0017](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行快速繁殖，培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的，其中1/2MS繁殖培養(yǎng)液中含0.lmg/L的吲哚乙酸IAA、0.lmg/L的萘乙酸NAA、0.lmg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為5.8，毛狀根的繁殖倍數(shù)為39倍。
[0018]實(shí)施例2
[0019]本發(fā)明所述山豆根毛狀根的快速繁殖方法的另一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟:
[0020](I)無(wú)菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用無(wú)菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)，獲得山豆根無(wú)菌苗子葉，其中MS培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8;
[0021](2)R1601發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)山豆根無(wú)菌子葉發(fā)根:將山豆根的無(wú)菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無(wú)菌水為對(duì)照，然后用無(wú)菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個(gè)無(wú)菌子葉。當(dāng)誘導(dǎo)出的根長(zhǎng)至約2cm時(shí)，在無(wú)菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接I次，直至無(wú)菌，獲得無(wú)菌毛狀根；
[0022](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行快速繁殖，培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的，其中1/2MS繁殖培養(yǎng)液中含0.8mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為5.8，毛狀根的繁殖倍數(shù)為55倍。
[0023]實(shí)施例3
[0024]本發(fā)明所述山豆根毛狀根的快速繁殖方法的一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟:
[0025](I)無(wú)菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用無(wú)菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)，獲得山豆根無(wú)菌苗子葉，其中MS培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8;
[0026](2)R1601發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)山豆根無(wú)菌子葉發(fā)根:將山豆根的無(wú)菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無(wú)菌水為對(duì)照，然后用無(wú)菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個(gè)無(wú)菌子葉。當(dāng)誘導(dǎo)出的根長(zhǎng)至約2cm時(shí)，在無(wú)菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接I次，直至無(wú)菌，獲得無(wú)菌毛狀根；
[0027](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行快速繁殖，培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的，其中1/2MS繁殖培養(yǎng)液中含0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為5.8，毛狀根的繁殖倍數(shù)為45倍。
[0028]實(shí)施例4
[0029]本發(fā)明所述山豆根毛狀根的快速繁殖方法的一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟:
[0030](I)無(wú)菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.“八％升汞消毒lOmin，再用無(wú)菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)，獲得山豆根無(wú)菌苗子葉，其中MS培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖和3.4g//L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8;
[0031](2)R1601發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)山豆根無(wú)菌子葉發(fā)根:將山豆根的無(wú)菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無(wú)菌水為對(duì)照，然后用無(wú)菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)移至含有乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個(gè)無(wú)菌子葉。當(dāng)誘導(dǎo)出的根長(zhǎng)至約2cm時(shí)，在無(wú)菌條件下將其剪下，于含有頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接I次，直至無(wú)菌，獲得無(wú)菌毛狀根；
[0032](3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS培養(yǎng)液中進(jìn)行快速繁殖，培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的，其中1/2MS繁殖培養(yǎng)液中含1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、1.0mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為5.8，毛狀根的繁殖倍數(shù)為46倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)無(wú)菌苗的獲得:取山豆根種子置于0.1￥八％升汞消毒lOmin，再用無(wú)菌水沖洗3次，并用消毒濾紙除去表面水分后接種到不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)，獲得山豆根無(wú)菌苗子葉，其中MS培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8; (2)R1601發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)山豆根無(wú)菌子葉發(fā)根:將山豆根的無(wú)菌苗子葉放入R1601菌液中浸泡16min取出，以無(wú)菌水為對(duì)照，然后用無(wú)菌濾紙吸取外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)移至添加乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d獲得毛狀根，處理30瓶，每瓶I個(gè)無(wú)菌子葉，當(dāng)誘導(dǎo)出的根長(zhǎng)至約2cm時(shí)，在無(wú)菌條件下將其剪下，于添加頭孢噻肟鈉300m/L的1/2MS固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接I次，直至無(wú)菌，獲得無(wú)菌毛狀根； (3)山豆根毛狀根繁殖:將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于1/2MS繁殖培養(yǎng)液中進(jìn)行快速繁殖，培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的，其中1/2MS繁殖培養(yǎng)液中添加0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸ΙΑΑ、0.1-1.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1-1.0mg/L的芐基腺嘌呤6-BA和30g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
【專利摘要】一種山豆根毛狀根的快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)取山豆根種子進(jìn)行消毒后接種到1/2MS培養(yǎng)基中萌發(fā)，獲得山豆根無(wú)菌苗；(2)用R1601發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)山豆根無(wú)菌子葉發(fā)根；(3)將步驟(2)所得到的毛狀根分株置于培養(yǎng)液中進(jìn)行快速繁殖培養(yǎng)，繁殖倍數(shù)達(dá)到39-55倍，通過(guò)本發(fā)明所獲得的山豆根毛狀根具有生長(zhǎng)速度快、遺傳穩(wěn)定性好、合成能力強(qiáng)且穩(wěn)定、向培養(yǎng)基中釋放部分代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)，能夠用于大規(guī)模生產(chǎn)生產(chǎn)工業(yè)用山豆根的替代資源。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105494090
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510862709
【發(fā)明人】李林軒, 韋坤華, 韋范, 繆劍華, 李翠, 韋瑩, 王一諾, 肖東
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)藥用植物園
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日