一種檉柳組織培養(yǎng)快速繁殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及林業(yè)科學(xué)中的林木組織培養(yǎng)育苗技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種木本植物組織培養(yǎng)快 速繁殖方法，具體涉及一種檉柳組織培養(yǎng)快速繁殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 怪柳（71aa?arix cAifleasis Lour.)，又稱中國怪柳，為怪柳科（Tamaricaceae)怪柳屬 (ramrix L.)中典型的多年生泌鹽性木本鹽生植物，喜生于河流沖積平原，海濱、灘頭、潮 濕鹽堿地和沙荒地。其枝、葉、花具有非常高的觀賞價(jià)值，且具有抗旱、抗鹽堿、耐水濕等特 性(張勝利等，2015)，適應(yīng)性強(qiáng)，不僅是優(yōu)良的防風(fēng)固沙植物，同時(shí)還是水土保持樹種、鹽堿 地改良及綠化造林樹種，也是我國造林樹種中大家公認(rèn)的頭號(hào)耐鹽樹種，植株可耐2. 4%的 鹽水澆灌、在土壤含鹽為25g/kg的濱海鹽漬土上能夠正常生長(zhǎng)(張立賓等，2008)，而且還 是良好的薪炭、編制和建筑用材；嫩枝及葉藥用，能解表利尿、祛風(fēng)濕、治療麻疹，其社會(huì)經(jīng) 濟(jì)和生態(tài)效益潛力巨大、開發(fā)應(yīng)用前景十分廣闊。但其當(dāng)前繁殖方式主要以扦插為主，繁殖 規(guī)模較小、繁殖系數(shù)較低，且受季節(jié)性限制，苗木生長(zhǎng)參差不齊；目前雖然有組織培養(yǎng)繁育 的相關(guān)報(bào)道，但多數(shù)僅限于科學(xué)研究而未應(yīng)用于生產(chǎn)，影響了檉柳的推廣應(yīng)用。
[0003]目前有少量論文及專利對(duì)檉柳組織培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究，其公開的檉柳 及近緣種短穗檉柳（7： hxa Willd.)組織培養(yǎng)技術(shù)中，幾乎所有文獻(xiàn)資料(程磊等2001 ; 李利紅等2005 ;韋小敏等2006ab ;王鵬等2007 ;張永才等2007 ;喬夢(mèng)吉等2007 ;孫旭旭等 2009)均將檉柳及近緣種組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)分為無菌苗的獲取、啟動(dòng)培養(yǎng)(有的將與無菌苗 獲取過程結(jié)合稱為初代培養(yǎng))、增殖(繼代）培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及移栽等五個(gè)環(huán)節(jié)。僅個(gè)別文獻(xiàn) 資料(韓琳娜等2010、劉伯燕等2015)在概念上探討了縮短培養(yǎng)周期的一步成苗組織培養(yǎng) 法，但其方法在不違背植物生長(zhǎng)規(guī)律的情況下，無法回避無菌苗獲取(初代培養(yǎng))、增殖(繼 代)、及生根培養(yǎng)等環(huán)節(jié)，其縮短的培養(yǎng)時(shí)間有限、節(jié)約成本有限，如果大量縮短時(shí)間，苗木 生長(zhǎng)量、擴(kuò)繁量必然較小，進(jìn)而導(dǎo)致其繁殖系數(shù)低、苗木生長(zhǎng)受限，協(xié)調(diào)各階段狀態(tài)下的苗 木繁殖效率也無法達(dá)到最佳，綜合效益無法最大化。省略掉增殖(繼代)培養(yǎng)環(huán)節(jié)，會(huì)大幅降 低繁殖系數(shù)。當(dāng)前現(xiàn)有專利(劉伯燕等2015)缺少煉苗移栽環(huán)節(jié)，無法很好地指導(dǎo)生產(chǎn)。 [0004]自2001年至今，所有公開的檉柳組織培養(yǎng)文獻(xiàn)資料中，除個(gè)別研究個(gè)例（孫旭旭 等2009)使用1/2MS外，基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，各培養(yǎng)階段所使用激素限于a-萘乙 酸（NAA)、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA)、激動(dòng)素（Kt)，個(gè)別研究（孫旭旭等2009 )中使用赤霉素 (GA)、吲哚乙酸（IAA)。其中啟動(dòng)培養(yǎng)(初代培養(yǎng)）多使用NAA、6-BA等，增殖(繼代）培養(yǎng)多 使用6-BA、Kt等，生根培養(yǎng)中NAA、6-BA、Kt三種激素均有使用。生長(zhǎng)激素有多種，且功能清 楚，并具有很多的實(shí)踐報(bào)道。但在檉柳組織培養(yǎng)技術(shù)研究的十多年中，僅僅局限在少量的激 素范圍內(nèi)，未見有其他激素的使用，形成了固定模式下的重復(fù)性研究，沒有大的創(chuàng)新，進(jìn)而 可能是導(dǎo)致無法突破檉柳組織培養(yǎng)快繁瓶頸、無法應(yīng)用于生產(chǎn)的主要原因。其他常用激素， 如吲哚丁酸（IBA)可促進(jìn)細(xì)胞分化和分裂，有利于新根生成和維管束系統(tǒng)的分化，促進(jìn)不定 根的形成；玉米素（ZT)不僅能促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)、刺激細(xì)胞分化，促進(jìn)愈傷組織發(fā)芽，還能抑制 過度根部形成，高濃度的玉米素還能產(chǎn)生不定芽分化。
[0005] 所報(bào)道文獻(xiàn)資料中，多使用升汞消毒，不僅易引起無菌苗褐化，而且易給工作人員 造成健康危害、給環(huán)境造成污染。因此，十分必要研發(fā)一種使用清潔型消毒劑避免引起檉柳 褐化現(xiàn)象、創(chuàng)新型組織培養(yǎng)配方的檉柳組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，促進(jìn)檉柳工廠化生產(chǎn)、規(guī)模 化推廣引用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中檉柳組織培養(yǎng)快繁瓶頸、無法應(yīng)用于生產(chǎn)的問題，本發(fā)明提 供了一種檉柳組織培養(yǎng)快速繁殖的方法。
[0007] 本發(fā)明是通過以下步驟得到的： 一種檉柳組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，包括以下步驟： (1) 無菌苗獲得(初代培養(yǎng)） 鮮嫩芽經(jīng)過處理和殺菌，接于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基中加入6-BA1.0 ~2.0mg/L、IBA0? 05 ~0? 15 mg/L、GA0? 05 ~0? 15 mg/L、蔗糖 20 ~30g/L、瓊脂7g/ L，pH值調(diào)5. 8~6. 0,培養(yǎng)條件為：在25±2°C，光照12~16h，光強(qiáng)2000~30001x條件下 培養(yǎng)15~20d，獲得無菌苗； (2) 繼代培養(yǎng) 在無菌條件下將獲得的無菌苗接種于繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng) 基中加入 ZT0? 3~0? 8mg/L、IBA0? 05~0? 15mg/L、蔗糖20~30g/L、瓊脂7g/L，pH值調(diào) 5. 8~6. 0,在25±2°C，光照12~16h，光強(qiáng)30001x條件下培養(yǎng)20d，獲得叢生芽； (3) 生根培養(yǎng) 在無菌條件下將叢生芽接種于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為1\2MS中加入IBA 0. 2~ 0? 5mg/L、NAA 0? 05 ~0? lmg/L、GA 0? 05 ~0? lmg/L、蔗糖 15 ~20g/L、瓊脂 7g/L，pH 值調(diào) 5. 8~6. 0,在25±2°C，光照12~16h，光強(qiáng)30001x條件下培養(yǎng)30~50d，得到生根組培 苗； (4) 煉苗移栽 將瓶生根完好的檉柳移栽到拱棚中，用遮陽網(wǎng)遮陽，2d后松動(dòng)瓶蓋但不打開瓶蓋保持 2d，不出現(xiàn)萎蔫就將瓶蓋打開五分之一的縫，之后觀察葉片生長(zhǎng)情況；待瓶蓋完全打開且葉 片生長(zhǎng)旺盛時(shí)，將檉柳從瓶?jī)?nèi)移出，洗去根部培養(yǎng)基，放在多菌靈50%可濕性粉劑5g/L溶液 中浸泡45s左右，移栽到裝好基質(zhì)的穴盤中每天澆水使?jié)穸冗_(dá)到90%，緩沖7d，適應(yīng)自然溫 度和濕度，15d，待新根長(zhǎng)出后移栽到大田。
[0008] 所述的方法，優(yōu)選步驟（1)中培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基中加入6-BA1.Omg/L、IBA 0? 1mg/L、GA0? 1mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂7g/L，培養(yǎng)條件為：在25±2°C，光照14h，光強(qiáng) 30001x條件下培養(yǎng)18d。
[0009] 所述的方法，優(yōu)選步驟（2)中培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基中加入ZT0. 5mg/L、IBA0. 1 mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂7g/L，在25±2°C，光照14h，光強(qiáng)30001x條件下培養(yǎng)20d。
[0010] 所述的方法，優(yōu)選步驟（3)中培養(yǎng)基配方為1\2MS中加入IBA 0. 5mg/L、NAA 0? lmg/L、GA 0? lmg/L、蔗糖 15g/L、瓊脂 7g/L，在 25±2°C，光照 14h，光強(qiáng) 30001x 條件下培 養(yǎng) 45d〇
[0011] 所述的方法，優(yōu)選步驟（1)中鮮嫩芽經(jīng)過處理和殺菌的步驟如下： 將鮮嫩芽放在蒸餾水里面浸泡30min，浸泡時(shí)加少量洗衣粉和兩滴吐溫，30min后用 自來水沖洗1~2h，把外植體放到接種臺(tái)上接種，接種前用75%酒精擦拭接種臺(tái)，開紫外 30min，在接種臺(tái)內(nèi)將檉柳外植體用無菌水沖洗3~5次，之后用75%酒精浸泡30S，然后用 無菌水沖洗3次，再用2%次氯酸鈉殺菌3~9min，用無菌濾紙吸干外植體表面水分。
[0012] 所述的方法，優(yōu)選步驟（4)中基質(zhì)為草炭：蛭石體積比3 :1。
[0013] 本發(fā)明的有益效果： 1) 利用環(huán)境有好的次氯酸鈉消毒，克服外植體消毒褐化問題； 2) 并研制出創(chuàng)新型快速繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)培養(yǎng)基配方，制定了簡(jiǎn)單易行的煉苗移栽 方案，省略了常規(guī)方法中的壯苗培養(yǎng)步驟，提高了繁殖效率，使檉柳組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù) 從實(shí)驗(yàn)室走向生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了檉柳組織培養(yǎng)苗木規(guī)?；a(chǎn)，為檉柳的快繁推廣提供了技術(shù) 支持。
[0014] 3)此繁殖方法，繁殖系數(shù)高，繁殖周期較短，獲得的苗木壯、根系較多，移栽成活率 達(dá)96%以上。
【附圖說明】
[0015] 圖1為芽分化， 圖2為芽增殖， 圖3-1為側(cè)面觀生根情況，圖3-2為瓶底觀生根情況， 圖4為閉瓶煉苗， 圖5-1為移栽，圖5-2為移栽成活， 圖6為規(guī)?；旆薄?br>【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明： 實(shí)施例1初代培養(yǎng)基的選擇 【1】取材：檉柳外植體取材于大田中剛生長(zhǎng)出來的鮮嫩枝芽，取材回來后，選擇鮮嫩芽 作為試驗(yàn)材料， 【2】試驗(yàn)材料前處理：放在蒸餾水里面浸泡0. 5h，浸泡時(shí)加少量洗衣粉和兩滴吐溫，隨 后用自來水沖洗2h，沖洗后把外植體放到接種臺(tái)上接種， 【3】接種前準(zhǔn)備：接種前，用75%酒精擦拭接種臺(tái)，開紫外0. 5h。將檉柳外植體用無菌 水沖洗3次，之后用75%酒精浸泡30S，然后用無菌水沖洗3次， 【4】次氯酸鈉殺菌：用2%次氯酸鈉殺菌處理3min、5min、7min、9min，隨后接于以MS培 養(yǎng)基為基礎(chǔ)的各種培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)，上述各種培養(yǎng)基中，殺菌9min情況下，檉柳外植體稍微 變色，其余均正常，將外植體放入組培室培育，每天觀察長(zhǎng)勢(shì)以及長(zhǎng)菌情況，7min以上抑菌 效果均較好，以7min處理為最好， 【5】培養(yǎng)基篩選：以次氯酸鈉殺菌7min，隨后將處理好的外植體接于以MS培養(yǎng)基為基 礎(chǔ)的10種培養(yǎng)基（A-J)上(見表1)，各培養(yǎng)基pH5. 8。將外植體放入組培室培育，每天觀 察長(zhǎng)勢(shì)。具體如下表1。檉柳外植體在大部分培養(yǎng)基中均啟動(dòng)，但是其啟動(dòng)時(shí)間、腋芽生長(zhǎng) 速度、生長(zhǎng)勢(shì)存在差異，部門腋芽出現(xiàn)一定的變異。以（D)MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1 mg/ L)+GA(0. 1 mg/L) +蔗糖（30g/L) +瓊脂（7g/L)培養(yǎng)基中檉柳外植體長(zhǎng)勢(shì)最好。
[0017] 表1檉柳外植體在初代培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)
結(jié)論：初代培育中，培養(yǎng)基為 MS+6-BA (L Omg