專利名稱：淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基及發(fā)酵普魯蘭多糖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，具體涉及一種以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來發(fā)酵普魯蘭多糖的方法。
背景技術：
普魯蘭多糖是一類具有重要應用價值的微生物胞外多糖，成膜性、成纖維、阻氣性、生物安全且無毒的特點，使其在食品、醫(yī)藥、化工和石油領域得到廣泛應用。淀粉廢水是加工淀粉過程中不可避免的一種副產物，營養(yǎng)豐富；麥芽根為麥芽制造過程中的副產物，含有豐富的淀粉酶、麥芽酶、果酸酶及蛋白酶，富含B族維生素，并含有大量未知生長因子。目前文獻中報道的普魯蘭多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源較多的是使用耐高溫淀粉酶酶解后的淀粉或者蔗糖，價格昂貴，工藝復雜，增加了普魯蘭多糖發(fā)酵成本。此外目前缺少色素產生少和胞外多糖合成能力高的菌株，這些都促使普魯蘭多糖整體成本的上升。

發(fā)明內容

為了解決上述由于技術不足產生的問題，進一步降低普魯蘭多糖的成本，本發(fā)明的目的在于提供一種以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，原料來源廣泛，利用麥芽根所含有的豐富酶系和生長因子來酶解淀粉工業(yè)廢水，培養(yǎng)基簡單，既提高了多糖產量，降低了多糖生產成本，也解決了由淀粉廢水及麥芽根帶來的環(huán)境問題。此外，通過該方法培養(yǎng)的菌株色素產生能力明顯下降，減少了脫色這個步驟，大大降低了普魯蘭多糖的成本。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是:一種以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，包括以下步驟:所述培養(yǎng)基制備方法如下:(I)將麥芽根粉碎，過20目篩，制備麥芽根汁，質量濃度20%_50% ；(2)將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水按照質量比20 40:100添加混合，在38 40°C浸潰25-40min ;控制溫度為45°C進行蛋白質(Pr)休止，保持20_40min，控制溫度為55°C進行第二次蛋白質休止保持30分鐘，控制溫度在63°C進行第一段糖化，保持時間40min ;第二段糖化溫度為68°C，至碘液反應為無色；升溫到76 78°C，過濾，洗糟，調pH到5.6-7.4，添加2 3g/L的NaCU0.2 0.4g/L的MgSO4,3 5g/L的K2HPO4,滅菌成為培養(yǎng)基。所述發(fā)酵培養(yǎng)方法如下:(I)將出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans)CGMCCN0.7055 菌株活化，即將其從蔗糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上轉接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為80ml，在恒溫28°C轉速180r/min，培養(yǎng) 30h。(2)以4%體積比將(I)所得種子菌液轉接到500ml培養(yǎng)基的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉速200r/min，培養(yǎng)84 104h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體。
(3)在上層清液中加入三倍體積的無水乙醇，攪拌，4°C放置過夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品。本發(fā)明的優(yōu)點如下:本發(fā)明利用工業(yè)廢棄物-淀粉工業(yè)廢水進行普魯蘭多糖的制備，不僅能變廢為寶，大大降低普魯蘭多糖的生產成本，還會減少淀粉工業(yè)廢水對環(huán)境所造成的污染，起到了資源和環(huán)境雙贏的效果。本發(fā)明利用了麥芽制造廠的副產物一麥芽根中的豐富酶系代替水解酶進行廢水中的淀粉水解，還利用了麥芽根中豐富的生長因子促進出芽短梗霉菌的生長代謝，提高了
普魯蘭多糖的產量。經本發(fā)明培養(yǎng)的菌株色素產生明顯降低，從而減少產品脫色步驟，大大降低了成本。
具體實施實例下面結合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1一種以淀粉廢水及麥芽根制備材料來發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，包括以下步驟:一、將麥芽根粉碎，過20目篩，制備麥芽根汁濃度50%。二、將麥芽根汁 與工業(yè)淀粉廢水按照質量比20:100的添加混合一浸潰(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45°C，30min) — Pr 休止 II (55°C，30min)—第一段糖化(63°C，40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反應為無色一升溫(76 78°C )—過濾一洗槽一調節(jié)pH至5.8，添加2g/L的NaCl、0.2g/L的MgS04、3g/L的K2HPO4經滅菌成為培養(yǎng)基。三、將CGMCCN0.7055活化，即將其從蔗糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上轉接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為80ml，在恒溫28°C轉速180r/min，培養(yǎng)30h。三、以4%體積比將種子菌液轉接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉速200r/min，培養(yǎng)84h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體。四、在上層清液中加入三倍體積的無水乙醇，攪拌，4°C放置過夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品，產量98g/L。實施例2一、將麥芽根粉碎，過20目篩，制備麥芽根汁濃度30%。二、將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水按照質量比30:100添加混合一浸潰(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45 °C, 30min) — Pr 休止 II (55 °C, 30min)—第一段糖化(63 °C,40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反應為無色)一升溫(76 78°C )—過濾一洗槽一調節(jié)pH至6.6，添加3g/L的NaCl、0.3g/L的MgS04、4g/L的K2HPO4經滅菌成為培養(yǎng)基。三、將CGMCCN0.7055活化，即將其從蔗糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上轉接到500ml裝有上述培養(yǎng)基的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為80ml，在恒溫28°C轉速180r/min，培養(yǎng)30h。三、以4%體積比將種子菌液轉接到500ml裝有上述培養(yǎng)基的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉速200r/min，培養(yǎng)96h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體。
四、在上層清液中加入三倍體積的無水乙醇，攪拌，4°C放置過夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品，產量105g/L。實施例3一、將麥芽根粉碎，過20目篩，制備麥芽根汁濃度20%。二、將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水按照質量比40:100添加混合一浸潰(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45 °C, 30min) — Pr 休止 II (55 °C, 30min)—第一段糖化(63 °C,40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反應為無色)一升溫(76 78°C )—過濾一洗槽一調節(jié)pH至7.1，添加2g/L的NaCl、0.4g/L的MgS04、5g/L的K2HPO4經滅菌成為培養(yǎng)液。三、將CGMCCN0.7055活化，即·將其從蔗糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上轉接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為80ml，在恒溫28°C轉速180r/min，培養(yǎng)30h。三、以4%體積比將種子菌液轉接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉速200r/min，培養(yǎng)104h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體。四、在上層清液中加入三倍體積的無水乙醇，攪拌，4°C放置過夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品，產量102g/L。一株出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans),該菌株已經于2012年12月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，(郵編100101)，保藏編號為CGMCCN0.70551.誘變菌株的獲得(I)選擇生長良好的出芽短梗霉菌株TKPM10017斜面菌種，用無菌生理鹽水洗下孢子，制做106個/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下,30cm處，分別照射0.5min、lmin、
1.5min、2min、2.5min3min、3.5min、4min將孢子懸液梯度稀釋涂平板,避光28°C培養(yǎng),計算致死率；(2)選擇0.5min、2min、4min三個不同劑量的照射時間分別對菌株TKPM10017的孢
子懸浮液進行紫外照射處理；(3)然后把三個不同照射時間的孢子懸液混合均勻，進行10-1 10-6梯度稀釋，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6三個稀釋度的孢子懸浮液涂布平板，28°C避光培養(yǎng)3d ；(4)將(3)中的誘變菌株接種到含有10mg/L寡霉素的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將種子液置于28°C恒溫搖床，200r/min，振蕩培養(yǎng)3d ；(5)將(4)中的種子液進行梯度稀釋，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6三個稀釋度的孢子懸浮液涂布斜面培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)3d，篩選培養(yǎng)基中顏色乳白色、菌落大而粘稠、濕潤的菌株。(6)再將(5)中篩選的菌株分別接種到種子培養(yǎng)基中，在28°C，200r/min下，振蕩培養(yǎng)36h，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C、200r/min下發(fā)酵3d，離心，蒽酮硫酸法測定上清液中普魯蘭多糖的含量，復篩出普魯蘭多糖高產菌株BCSWGHPL101。2.誘變菌株BCSWGHPL101的特性(I)菌落形態(tài):發(fā)酵液中主要呈現(xiàn)酵母樣形態(tài)，橢圓形且大小均一，菌株的繁殖方式類似于酵母的出芽生殖方式。
(2)菌落形態(tài):菌落呈圓形，中心隆起，表面光滑，濕潤，不易挑取，生長后期有菌絲體產生。(3)培養(yǎng)特征:28°C，200rpm下震蕩培養(yǎng)3d，發(fā)酵液顏色乳白到乳黃色。(4)可以利用的碳源:葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、糊精其中之一。(5)可以利用的氮源:牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、硝酸鈉、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨等，上述氮源可以混合使用，也可單一使用。(6)可以在10mg/L寡霉素存在的情況下生長良好。1.培養(yǎng)基的配置:(I)菌種活化培養(yǎng)基:土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200g/L，加葡萄糖 20g/L，瓊脂 20g/L，，pH 自然。121。。20min 滅菌。(2)種子培養(yǎng)基:蛋白胨 3g/L，蔗糖 50g/L，K2HPO4.7Η202.0g/L，MgSO4.7Η200.4g/L, NaC12.5g/L，調節(jié) pH 至 7.0，121 °C 高壓滅菌 20min，備用。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨 3g/L，蔗糖 100g/L，K2HPO4.7H203.0g/L,MgSO4.7Η20 0.4g/L, NaC12.5g/L, FeSO40.0lg/L 調節(jié) pH 至 7.0，121 °C 高壓滅菌 20min,備用。

(4)選擇培養(yǎng)基:寡霉素5mg/L(單獨滅菌)，蛋白胨3g/L,鹿糖50g/L,K2HPO4.7Η202.0g/L, MgSO4.7Η200.4g/L，NaC12.5g/L，調節(jié) pH 至 7.0，121 °C 高壓滅菌 20min,備用。(5)初篩培養(yǎng)基即PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200g/L，加葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH 自然。121 °C 20min 滅菌。
權利要求
1.粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟: (1)將麥芽根粉碎，過20目篩，制備麥芽根汁，質量濃度控制20-50%; (2)將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水按照質量比20 40:100添加混合，在38 40°C浸潰25-40min ;控制溫度為45°C進行蛋白質休止，保持20_40min，控制溫度為55°C進行第二次蛋白質休止保持30分鐘，控制溫度在63°C進行第一段糖化，保持時間40min，第二段糖化溫度為68°C，至碘液反應至無色，升溫到76 78°C，過濾，洗槽，調pH到5.6-7.4，添加2 3g/L的NaCU0.2 0.4g/L的MgS04、3 5g/L的K2HP04,滅菌成為培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權利要求1所述淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基的制備方法，所述PH為5.8。
3.根據(jù)權利要求1所述淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基的制備方法，所述PH為6.6。
4.一種利用如權利要求1所述淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基發(fā)酵的方法，包括如下步驟: (1)將普魯蘭多糖高產菌株(Aureobsidiumpullulans) CGMCCN0.7055菌株活化； (2)以4%體積比將種子菌液轉接到500ml培養(yǎng)基的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉速200r/min，培養(yǎng)84 104h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體； (3)在上層清液中加入三倍體積的無水乙醇，攪拌，4°C放置過夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來發(fā)酵普魯蘭多糖的方法。所述以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，培養(yǎng)基的制備制備包括以下步驟培養(yǎng)基的制備、菌株活化、發(fā)酵培養(yǎng)、乙醇處理干燥即得到白色或淺黃色多糖粗品。其中所述培養(yǎng)基制備方法包括(1)麥芽根粉碎，過篩，制備麥芽根汁；(2)將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水混合，浸漬；控溫進行蛋白質(Pr)休止；控溫進行糖化；升溫，過濾，洗糟，調pH，添加無機鹽，滅菌。本發(fā)明利用工業(yè)廢棄物—淀粉工業(yè)廢水進行普魯蘭多糖的制備，不僅能變廢為寶，大大降低普魯蘭多糖的生產成本，還會減少淀粉工業(yè)廢水對環(huán)境所造成的污染，起到了資源和環(huán)境雙贏的效果。
文檔編號C12P19/10GK103088085SQ201210594838
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權日2012年12月31日
發(fā)明者喬長晟, 宋亞瓊, 郝華璇, 李振海, 李政, 蓋麗豐 申請人:天津北洋百川生物技術有限公司