專利名稱：一種以蓮子殼為原料生產(chǎn)飼用復合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵產(chǎn)酶的方法，特別是涉及一種以蓮子殼為原料生產(chǎn)飼用復合酶的方法背景技術(shù)
隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人民的生活水平不斷提高。對食品的需要量日漸增加， 促進了畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展。然而隨著人口增加和耕地面積的不斷減少，出現(xiàn)了人畜爭糧的現(xiàn)象，導致飼料價格居高不下，因此提高畜禽日糧中各種營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，一直是動物營養(yǎng)科學的研究目標之一。其中飼用酶制劑是近年來的研究熱點。酶制劑的科學使用不僅可以提高畜禽飼料的利用率，促進畜禽生產(chǎn)，而且酶制劑不會在畜禽產(chǎn)品中殘留。危害人類健康。此外，有些酶還可以增強畜禽的免疫力，提高動物的抗應激能力。目前，飼用酶在世界各國廣泛應用于豬、家禽、反芻動物和水產(chǎn)動物等的日糧中。
飼用復合酶是一類新型的活性飼料添加劑，是多種消化酶的混合制劑，主要由纖維素酶、半纖維素酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶多種水解酶組成。酶源主要來自動物、植物和微生物，而利用微生物發(fā)酵制取復合酶逐漸成為飼用酶制劑的主要來源。
蓮子殼是子蓮加工后產(chǎn)生的副產(chǎn)品，由于蓮殼質(zhì)硬壁厚，利用率較低，大多被焚燒填埋，據(jù)分析蓮殼中含有豐富的纖維素及適宜食用菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)，是一種良好的微生物培養(yǎng)基質(zhì)，具備生產(chǎn)飼用復合酶的潛力，但用蓮子殼為原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)復合酶制劑國內(nèi)外未見文獻報道。
本研究方法主要以廉價的廢物蓮子殼為原料，通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)飼用復合酶，為綜合利用蓮殼、提高經(jīng)濟效益提供理論參考。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以蓮子殼為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)飼用復合酶的方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種以蓮子殼為原料生產(chǎn)飼用復合酶的方法，其特征在于，它包括以下步驟
(a)菌種選取在產(chǎn)羧甲基纖維素酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、果膠酶、果膠裂解酶和木聚糖酶的產(chǎn)生菌中挑選出棘孢曲霉作為生產(chǎn)菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于 26 32°C下培養(yǎng)84 120h天成熟后保存?zhèn)溆茫?br> (b)菌種培養(yǎng)將挑選的棘孢曲霉菌株放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中在28°C的溫度條件下復壯培養(yǎng)84 120h，然后放入固體發(fā)酵培養(yǎng) 基中進行恒溫培養(yǎng)60 72h ；
(C)發(fā)酵處理按重量百分比取5% 8%的培養(yǎng)菌種的孢子懸浮液IO6 IO7個孢子/ml、接入已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基的重量百分比構(gòu)成為干燥蓮子殼45 55%，豆柏25% 35%，稻草粉10% 15%，硫酸銨I % 2%，氯化鈣I % 2%，混勻后加水調(diào)整至消毒后含水量為重量百分比60 70% ;恒溫生化培養(yǎng)箱中保持環(huán)境溫度為28 30°C，環(huán)境濕度為65 70%的條件下發(fā)酵60 84h ;發(fā)酵成熟的固體料進行真空冷凍干燥，直至含水量達到4 5%，再利用粉碎機低溫粉碎至40 50目，得到飼用復合酶。
所述的飼用復合酶包含有羧甲基纖維素酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、木聚糖酶。
本發(fā)明具有的有益的效果是1、對大量菌株進行篩選得到能利用蓮子殼生產(chǎn)高酶活復合酶的棘孢曲霉；2、以蓮子殼為主要原料，添加少量的豆柏、稻草粉及無機鹽，其原料來源廣，價格低廉，生產(chǎn)成本低；3、固態(tài)發(fā)酵能耗低，培養(yǎng)周期短，投資少且原料比較粗放， 終產(chǎn)物往往含有多種酶活性，很適合用作飼料添加劑；4、一次發(fā)酵即可獲得多酶種、高酶活的發(fā)酵曲料，真空冷凍干燥、粉碎，能制備出可直接添加的復合酶飼料添加劑。操作簡便，容易推廣；5、產(chǎn)品酶系全且酶活高，作為畜、禽和水產(chǎn)的養(yǎng)殖動物的綠色飼料添加劑，使用范圍廣；6、生產(chǎn)中不產(chǎn)生廢水廢渣，后處理簡單，基本無污染。具體實施方案
一、菌種制備
菌種為湘潭大學生物食品工程系分離保藏的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)。 囷種制備分為一、~■級囷種制備。
一級菌種培養(yǎng)基為新鮮馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基斜面，棘孢曲霉保藏菌株劃線法接種，28 30°C下培養(yǎng)84 120h，用無菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)移至無菌帶玻璃珠三角瓶，振蕩打散孢子，制成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)孢子濃度在IO6 IO7個/ml，待用。
二級菌種按照干燥的蓮子殼粉78%，豆柏粉20%，硫酸銨2%，培養(yǎng)基含水量 50%,自然pH值，121°C下高壓滅菌20min,冷卻，接入一級種子孢子懸浮液,每個三角瓶接 lml，攪拌均勻，于28 30°C下培養(yǎng)約84 120h，然后，用無菌水洗下孢子，制成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)孢子濃度為IO6 IO7個/ml。
二、固體發(fā)酵
培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基干料組分的重量百分比為干燥蓮子殼45 55%，豆柏25% 35 %,稻早粉10 15 *%，硫酸按I 2 *%，氣化韓I 2 *%，混勾后加水調(diào)整至滅囷后含水量為重量百分比60 70%;具體操作方法將蓮子殼、豆柏與稻草粉按比例混合均勻， 再將硫酸銨和氯化鈣溶于蒸餾水中，均勻，121°C下高壓滅菌20min，在恒溫生化培養(yǎng)箱中保持環(huán)境溫度為28 30°C，環(huán)境濕度為65 70%的條件下發(fā)酵60 84h。
三、干燥
發(fā)酵成熟的固體料利用真空冷凍干燥器在-110°C下進行干燥，直至含水量達到 4 5%,再利用粉碎機低溫粉碎至40 50目即可。
實施例1
將低溫保藏的棘孢曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到新鮮PDA培養(yǎng)基斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，溫度控制在28°C，經(jīng)過84小時培養(yǎng)，待菌絲長滿斜面并長滿灰黑色孢子后，加入適量的無菌水洗下孢子，制成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)孢子濃度到IO7個/ml，在250mL三角瓶中，裝入IOg 蓮子殼固體發(fā)酵培養(yǎng)基，其中包括蓮子殼粉4g，豆柏lg，硫酸銨O. lg，水5ml，121°C下滅菌 20min,冷卻后接入ImL孢子懸浮液，置于28°C生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)過72h待發(fā)酵固體表面布滿灰黑色孢子后，加入無菌水，洗下孢子，調(diào)節(jié)孢子濃度為IO7個/ml，備用。將上述培養(yǎng)好的孢子懸浮液Iml均勻噴灑在裝有11. 6g發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括3g干燥的蓮子殼粉，2g豆柏粉，Ig稻草粉，O.1g硫酸銨，O.1g氯化鈣，5. 4ml蒸餾水，121°C滅菌30min，在28°C下、濕度為70%條件下培養(yǎng)8 Ih后，培養(yǎng)基上的白色菌絲轉(zhuǎn)化成灰黑色孢子，然后在真空冷凍干燥器在-110°C下進行干燥，直至含水量達到4 5%，再利用粉碎機低溫粉碎至40 50目。
經(jīng)測定，羧甲基纖維素酶活13. 99U/g、β -葡萄糖苷酶活51. 36U/g、蔗糖酶活 128. 32U/g、果膠酶活126. 34U/g、果膠裂解酶活123. 18U/g、木聚糖酶活61. 23U/g。
實施例2
將低溫保藏的棘孢曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到新鮮PDA斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，溫度控制在28°C，經(jīng)過72小時培養(yǎng)，待菌絲長滿斜面并長滿灰黑色孢子后，加入適量的無菌水洗下孢子，制成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)孢子濃度到IO7個/ml，在250mL三角瓶中，裝入IOg蓮子殼固體發(fā)酵培養(yǎng)基，其中包括蓮子殼粉4g，豆柏lg，硫酸銨O. lg，水5ml，12rC下滅菌 20min，冷卻后接入ImL孢子懸浮液，置于28°C生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)過84h待發(fā)酵固體表面布滿灰黑色孢子后，加入無菌水，洗下孢子，調(diào)節(jié)孢子濃度為IO7個/ml，備用。將上述培養(yǎng)好的孢子懸浮液4ml均勻噴灑在裝有45g發(fā)酵培養(yǎng)基的IOOOml三角瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括12g干燥的蓮子殼粉，Sg豆柏粉，4g稻草粉，O. 4g硫酸銨，O. 4g氯化鈣，20ml蒸餾水， 121 °C滅菌30min，在28 °C下、濕度為70 %條件下培養(yǎng)8 Ih后，培養(yǎng)基上的白色菌絲轉(zhuǎn)化成灰黑色孢子，然后在真空冷凍干燥器在-110°C下進行干燥，直至含水量達到4 5%，再利用粉碎機低溫粉碎至40 50目。
經(jīng)測定，羧甲基纖維素酶活14.04U/g、葡萄糖苷酶活50.33U/g、蔗糖酶活 124. 41U/g、果膠酶活120. 61U/g、果膠裂解酶活119. 59U/g、木聚糖酶活62. 89U/g。
附酶活測定方法以及酶活定義
羧甲基纖維素酶的活性測定義在pH4. 8，50°C條件下，每分鐘水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生I μ mol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。
β-葡萄糖苷酶的活性測定義在pH4.8，5(TC條件下，每分鐘水解水楊苷產(chǎn)生 I μ mol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。
蔗糖酶的活性測定義在pH4. 8，50°C條件下，每分鐘水解水楊苷產(chǎn)生I μ mol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。
果膠酶的活性測定義在pH4. 8，45°C條件下，每分鐘水解果膠產(chǎn)生I μ moID-半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。
果膠裂解酶的活性測定義在pH4. 8，50°C條件下，每分鐘水解水楊苷產(chǎn)生I μ mol D-半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。
木聚糖酶的活性測定義在pH4. 8，50°C條件下,每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生I μ mol木糖所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。
羧甲基纖維素酶的活性測定方法
先加ImL的I %的CMC-Na溶液，再加0. 5mL酶液，在50°C下恒溫反應30min，然后加入1. 5mLDNS試劑，沸水浴反應5min，流動水冷卻，定容至25mL，在520nm下測定吸光值。
β -葡萄糖苷酶活性測定方法
先加ImL的I %的水楊苷溶液，再加0. 5mL酶液,在50°C下恒溫反應30min,然后加入1. 5mLDNS試劑，沸水浴反應5min，流動水冷卻，定容至25mL，在520nm下測定吸光值。
蔗糖酶活性測定方法
先加ImL的I %的蔗糖溶液，再加O. 5mL酶液，在50°C下恒溫反應30min，然后加入1. 5mLDNS試劑，沸水浴反應5min，流動水冷卻，定容至25mL，在520nm下測定吸光值。
果膠酶的活性測定方法
先加ImL的I %的果膠溶液，再加O. 5mL酶液，在50°C下恒溫反應30min，然后加入1. 5mLDNS試劑，沸水浴反應5min，流動水冷卻，定容至25mL，在520nm下測定吸光值。
果膠裂解酶的活性測定方法
先加ImL的I %的果膠溶液，再加O.1mL酶液與O. 4ml的緩沖液，在50°C下恒溫反應30min，然后加入1. 5mLDNS試劑，沸水浴反應lOmin，流動水冷卻，定容至25mL，在540nm 下測定吸光值。
木聚糖酶的活性測定方法
先加ImL的I %的果膠溶液，再加O. 2mL酶液與O. 3ml的緩沖液，在50°C下恒溫反應30min，然后加入1. 5mLDNS試劑， 沸水浴反應15min，流動水冷卻，定容至25mL，在550nm 下測定吸光值。
權(quán)利要求
1.一種以蓮子殼為原料生產(chǎn)飼用復合酶的方法，其特征在于，它包括以下步驟(a)菌種選取在產(chǎn)羧甲基纖維素酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、果膠酶、果膠裂解酶和木聚糖酶的產(chǎn)生菌中挑選出棘孢曲霉作為生產(chǎn)菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于26 32°C下培養(yǎng)84 120h天成熟后保存?zhèn)溆茫?b)菌種培養(yǎng)將挑選的棘孢曲霉菌株放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中在28°C的溫度條件下復壯培養(yǎng)84 120h，然后放入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行恒溫培養(yǎng)60 72h ；(c)發(fā)酵處理按重量百分比取5% 8%的培養(yǎng)菌種的孢子懸浮液IO6 IO7個孢子/ml、接入已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基的重量百分比構(gòu)成為干燥蓮子殼45 55%，豆柏25% 35%，稻草粉10% 15%，硫酸銨I % 2%，氯化鈣I % 2%，混勻后加水調(diào)整至消毒后含水量為重量百分比60 70% ;恒溫生化培養(yǎng)箱中保持環(huán)境溫度為28 30°C，環(huán)境濕度為65 70%的條件下發(fā)酵60 84h ;發(fā)酵成熟的固體料進行真空冷凍干燥，直至含水量達到4 5%，再利用粉碎機低溫粉碎至40 50目，得到飼用復合酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以蓮子殼為原料生產(chǎn)飼用復合酶的方法，其特征在于所述的飼用復合酶包含有羧甲基纖維素酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、木聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以蓮子殼為原料生產(chǎn)飼用復合酶的方法，它包括以下步驟菌種選取；菌種培養(yǎng)；發(fā)酵處理，得到飼用復合酶。本發(fā)明具有的有益的效果是1.對大量菌株進行篩選得到能利用蓮子殼生產(chǎn)高酶活復合酶的棘孢曲霉；2.以蓮子殼為主要原料，添加少量的豆粕、稻草粉及無機鹽，其原料來源廣，價格低廉，生產(chǎn)成本低；3.固態(tài)發(fā)酵能耗低，培養(yǎng)周期短，投資少且原料比較粗放，終產(chǎn)物往往含有多種酶活性，很適合用作飼料添加劑；4.一次發(fā)酵即可獲得多酶種、高酶活的發(fā)酵曲料，真空冷凍干燥、粉碎，能制備出可直接添加的復合酶飼料添加劑。操作簡便，容易推廣；5.產(chǎn)品酶系全且酶活高，作為畜、禽和水產(chǎn)的養(yǎng)殖動物的綠色飼料添加劑，使用范圍廣；6.生產(chǎn)中不產(chǎn)生廢水廢渣，后處理簡單，基本無污染。
文檔編號C12R1/66GK103045546SQ201210594538
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者陶能國, 吳鋒, 石文卿, 黃師榮 申請人:湘潭大學