本發(fā)明涉及植物生物工程組織培養(yǎng)技術領域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法。

背景技術：

煙草的愈傷組織(callus)是生產(chǎn)再生植株，獲得遺傳良性變異，進行品種改良的重要材料。同時，煙草作為植物生物技術研究的模式植物，其愈傷組織還是細胞生物學、分子生物學和基因學等基礎研究的重要試驗材料。所以，國內外對獲得煙草愈傷組織的技術研究報告頗多。但是歸納起來，其共同點有：①基本培養(yǎng)基。絕大多數(shù)是用MS(Murashige和Skoog,1962)，偶然有用H(Bourgin和Nitsch,1967)。②誘導劑。幾乎全部是使用以下2類5種植物生長物質。即生長素類(Auxin)中的三種：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，NAA(萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸)；細胞分裂素類(Cytokinin)中的兩種：BA(N⁶-芐基腺嘌呤)和KT(激動素)。而且還必定是其中的2種，甚至3種進行復配使用，才能達到誘導愈傷組織的效果。現(xiàn)有誘導獲得煙草愈傷組織技術的缺點是：1.培養(yǎng)基的配制程序繁瑣復雜費工；2.出愈率(出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100％)雖不算低(據(jù)不同報導，培養(yǎng)25d-30d可達75％-100％)，但是愈傷組織的實際產(chǎn)量卻不高，只是相關報導都避而不談而已；3.2,4-D，IBA和NAA(三者之中至少必用其一或二)均有明顯的毒性和殘留，特別是使用最多的2,4-D，原本就是除草劑，極易使剛獲得的愈傷組織發(fā)生褐化和板結，嚴重影響質量，使其增殖和再分化的能力顯著下降。所以，在相關報導中，幾乎無一例外，從外植體獲得少量愈傷組織后，都必須及時轉入另外某種不同的專用增殖培養(yǎng)基，才能進行擴繁。

藍桃菊等人公開了一種用靈發(fā)素誘導甘蔗愈傷組織的方法，專利號為ZL 2010 1 0216180.9，曾用LFS0.01-0.50mg·L^-1成功誘導單子葉植物綱禾本目禾本科植物甘蔗幼葉發(fā)生愈傷組織，最佳濃度為0.20mg·L^-1。許鴻源等人研究了靈發(fā)素對三七愈傷組織發(fā)生和增殖的影響，以MS為基本培養(yǎng)基，添加復合誘導劑2,4-D2.0mg·L^-1和LFS2.0mg·L^-1成功誘導雙子葉植物綱傘形目五加科三七的莖段發(fā)生愈傷組織。但是，對于在植物分類學上親緣關系極其遙遠的雙子葉植物綱合瓣花亞綱管狀花目茄科煙草屬的煙草來說，至今未見有單獨用靈發(fā)素，或將靈發(fā)素同其它物質復配后成功誘導其愈傷組織發(fā)生的技術報導。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，以靈發(fā)素作誘導劑制備的誘導培養(yǎng)基比傳統(tǒng)的培養(yǎng)基出愈快、產(chǎn)量高、質量優(yōu)，且該培養(yǎng)基還可直接用于愈傷組織的增殖擴繁，達到一基多用，能顯著提高整體工作效率。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，以靈發(fā)素作誘導劑制備誘導培養(yǎng)基進行煙草葉片外植體的愈傷組織誘導。

優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，所述誘導培養(yǎng)基為配方為：MS+靈發(fā)素0.05-2.0mg/L，pH為5.8～6.0。

優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，所述煙草葉片外植體的獲取方法為：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，當其長至5、6片葉時，自上至下取第3片葉，在無菌條件下，切成方片作為外植體，備用。

優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，將自上至下的第3片葉在無菌條件下切除葉柄以上2mm和葉尖以下2mm的葉片部分，留葉片中間部分，再沿其主脈兩側分切成5mm×5mm的方片作煙草葉片外植體。

優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，將煙草葉片外植體接種于滅菌后的誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-20天，獲得煙草愈傷組織。

優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，所述誘導培養(yǎng)基中靈發(fā)素的濃度為1.5mg/L。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

1)靈發(fā)素同時具有細胞分裂素(Cytokinin)和生長素(Auxin)兩類植物生長物質的生物活性，對培養(yǎng)物沒有毒副作用，采用靈發(fā)素添加于固體MS配制成單一的誘導培養(yǎng)基，大大簡化培養(yǎng)基的配制程序，節(jié)省物力人力，降低了培養(yǎng)成本；

2)本發(fā)明的誘導培養(yǎng)基以靈發(fā)素作為唯一的誘導劑成分，針對雙子葉植物煙草的特殊生物學特性，本申請研究人員對十多種未曾在誘導煙草愈傷組織中使用過的植物生長物質進行了大量篩選試驗，確定了靈發(fā)素的適宜濃度，使得煙草葉片外植體在誘導培養(yǎng)基作用下進行脫分化，以高效優(yōu)質地形成煙草愈傷組織，本發(fā)明的誘導培養(yǎng)基比傳統(tǒng)的培養(yǎng)基誘導效果更好，出愈快、產(chǎn)量高、質量優(yōu)，能顯著提高整體工作效率；其中以MS+LFS1.50mg·L^-1誘導煙草葉片獲得愈傷組織，不僅出愈快，出愈率高，褐化板結輕微，而且轉綠率達到傳統(tǒng)技術CK組的3.9倍，產(chǎn)量達CK組的4.9倍。

本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1：

一種用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，包括以下步驟：

步驟一、誘導培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，添加靈發(fā)素0.05mg/L，調整培養(yǎng)基pH為5.8～6.0，滅菌后備用；

步驟二、外植體準備：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，在無菌條件下，將煙草葉片切成方片作為外植體，備用，方片可切成大小約為5mm×5mm；

步驟三、接種與誘導培養(yǎng)：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無菌條件下接入步驟一的誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10-20天。

實施例2：

一種用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，包括以下步驟：

步驟一、誘導培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，添加靈發(fā)素1.5mg/L，調整培養(yǎng)基pH為5.8～6.0，滅菌后備用；

步驟二、外植體準備：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，當其長至5、6片葉時，自上至下取第3片葉，在無菌條件下，切成方片作為外植體，備用，方片可切成大小約為5mm×5mm；

步驟三、接種與誘導培養(yǎng)：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無菌條件下接入步驟一的誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10-20天。

無菌煙草植株的葉片長至5、6片葉時，自上至下的第3葉為充分成熟健壯的功能葉，細胞代謝旺盛，生命力強，相比其他煙草葉片，作為外植體培養(yǎng)更易發(fā)生脫分化形成愈傷組織。

實施例3：

一種用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法，包括以下步驟：

步驟一、誘導培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，添加靈發(fā)素2.0mg/L，調整培養(yǎng)基pH為5.8～6.0，滅菌后備用；

步驟二、外植體準備：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，當其長至5、6片葉時，自上至下取第3片葉，在無菌條件下，切除葉柄以上2mm和葉尖以下2mm的葉片部分，留葉片中間部分，再沿其主脈兩側分切成5mm×5mm的方片作為外植體，備用，需要說明的是，前述的沿主脈切片是指棄用了葉片左右兩側的邊緣葉片部分，只要主脈兩側的葉片部分；

步驟三、接種與誘導培養(yǎng)：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無菌條件下接入步驟一的誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10-20天。

無菌煙草植株的葉片長至5、6片葉時，自上至下的第3葉為充分成熟健壯的功能葉，細胞代謝旺盛，生命力強，在切除葉片的上下兩端以及在沿主脈兩邊切取5mm×5mm的方片的同時也切除了左右兩側邊緣的葉片部分，這種操作更有利保證所用的煙草葉片外植體從外部形態(tài)到內在代謝水平都更為均勻一致，有效減少材料誤差對實驗結果的影響。

對比例1：

為了說明本發(fā)明的用靈發(fā)素誘導煙草愈傷組織的方法的效果，本發(fā)明的發(fā)明人以實施例3的方法，將誘導培養(yǎng)基中的靈發(fā)素濃度依次設定為：0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、1.50mg/L、2.00mg/L，并以傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基(其配方為：MS+2,4-D 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+BA 0.2mg/L)為對照組(CK)，在上述每組試驗中接種5瓶，每瓶接種5個方片，稱量并計算每組試驗中5個方片的平均鮮重FW₁(g)，以便最后計算每瓶(5個方片)愈傷組織的平均產(chǎn)量。在常規(guī)條件下培養(yǎng)誘導煙草愈傷組織，并統(tǒng)計各組培養(yǎng)10天的出愈率和培養(yǎng)20天的出愈率、褐變率、板結率和愈傷組織凈增鮮重，其中：

平均出愈率(％)＝出愈方片數(shù)/接種方片數(shù)×100％，不論方片污染與否及出愈多少；

褐變率(％)＝出愈方片褐變數(shù)/出愈方片數(shù)×100％；

褐變程度：以“+”多少表示；

板結率(％)＝愈傷組織緊實難以增殖分化的方片數(shù)/出愈方片數(shù)×100％；

轉綠率(％)＝有愈傷組織轉綠方片數(shù)/出愈方片數(shù)×100％，不論愈傷組織轉綠方片的實際轉綠程度，以肉眼可辨為準；

愈傷組織凈增鮮重：試驗終止，當即每組隨機取3瓶無污染者，去除培養(yǎng)基后，稱量每瓶培養(yǎng)物(含外植體方片，及其愈傷組織和附生物)的總鮮重FW₂(g)，計算每瓶愈傷組織的凈增鮮重FW(g)＝FW₂-FW₁(FW₁為培養(yǎng)前5個方片的平均鮮重)。

結果見表1。

表1.靈發(fā)素誘導煙草葉片愈傷組織的實施案例及與傳統(tǒng)技術的效果對比

在本申請試驗條件下，從表1可見，靈發(fā)素0.05-2.00mg/L都能誘導煙草葉片外植體脫分化發(fā)生愈傷組織，而且效果明顯優(yōu)于現(xiàn)有的技術方法(CK)，最佳濃度為1.50mg/L。以MS為基本培養(yǎng)基，添加單一誘導劑靈發(fā)素1.50mg/L，常規(guī)無菌培養(yǎng)10d，出愈率約相當CK組的4.8倍；培養(yǎng)20d出愈率達100％，而褐化率只有CK組的10％，板結率只有CK組的3.7％，都相當輕微；愈傷組織轉綠率卻是CK組的3.9倍；每瓶(5個方片)平均收獲愈傷組織凈鮮重達8.3g，是CK組1.7g的4.9倍。所以本申請技術的建立，實現(xiàn)了簡單、快速、優(yōu)質、高效生產(chǎn)煙草愈傷組織的目標。在科研及規(guī)?；a(chǎn)煙草愈傷組織時具有實用價值。

另外需要說明的是，本發(fā)明的誘導培養(yǎng)基還可直接用于愈傷組織的增殖擴繁，無需額外再另配專用增殖培養(yǎng)基，達到一基多用，顯著提高整體工作效率。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。