本發(fā)明涉及一種植物愈傷組織誘導及培養(yǎng)的方法，尤其是一種偏穗鵝觀草無毒條件下種子消毒及快速誘導繁殖其無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法。

背景技術：

愈傷組織的培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)過程中的一個重要階段，愈傷組織是幼嫩的薄壁細胞，具有潛在的分化能力，可以進一步分化形成完整植株，通過愈傷的培養(yǎng)也可獲得不同性質(zhì)的愈傷組織，可為原生質(zhì)體的分離，融合或遺傳轉(zhuǎn)化提供優(yōu)質(zhì)材料。偏穗鵝觀草(Roegneria komarovii(Nevski)Nevski)為禾本科鵝觀草屬多年生草本植物，原產(chǎn)于中國，除新疆、青海、西藏外，分布遍及全國。多生長在海拔100-2300米的山坡和濕潤草地。此種植物可作牲畜的飼料，葉質(zhì)柔軟而繁盛，產(chǎn)草量大，可食性高。目前對無毒條件下進行種子消毒并快速誘導偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的相關報道還比較少。當前急需一種以無升汞處理偏穗鵝觀草種子并以其無菌苗下胚軸為外植體誘導愈傷從而使其增殖的方法，通過人工控制環(huán)境條件來產(chǎn)生大量的愈傷組織，并進一步培養(yǎng)使其增殖，為偏穗鵝觀草與小麥體細胞雜交做準備，從而將其優(yōu)良性狀導入小麥，以期為小麥遺傳育種及研究提供中間材料。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種快速誘導繁殖偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法，該方法簡單易行，能夠高效快速的獲得大量偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織。

以無菌培養(yǎng)獲得的偏穗鵝觀草下胚軸為外植體，誘導愈傷組織發(fā)生，然后繼代培養(yǎng)，使其增殖。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為一種快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，其主要特點在于步驟如下：

(1)無毒條件下無菌外植體的獲得：將偏穗鵝觀草種子置于50％～55％的濃硫酸中,在條件為28℃～30℃，210r/min～220r/min的搖床里振蕩0.9～1.2小時做脫皮催芽處理，之后用蒸餾水洗去濃硫酸并置于超凈工作臺，首先用無菌水清洗種子，然后用75％的酒精振蕩沖洗2.5～3.5min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用20％～25％的次氯酸鈉振蕩沖洗14～16min,最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得偏穗鵝觀草無菌種子，將滅菌后的種子放置于培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15d，獲得無菌實生苗的下胚軸幼嫩部分作為誘導愈傷的外植體；

(2)愈傷組織誘導：將步驟(1)獲得的無菌實生苗下胚軸橫切為約0.3-0.5cm長的小段作為誘導愈傷的材料，接種于誘導愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)25-30d，誘導愈傷發(fā)生；

(3)愈傷組織增殖培養(yǎng)：將步驟(2)獲得的顏色黃綠，質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成直徑為0.1-0.2cm的小塊，然后轉(zhuǎn)接到誘導愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25-30d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的誘導愈傷組織增殖培養(yǎng)基中進行繼代增殖，最終獲得顏色黃綠，結(jié)構致密的優(yōu)良愈傷組織材料。

所述的快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，其步驟(1)中所述的培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基為MS營養(yǎng)液、5-7g/L瓊脂、20-30g/L蔗糖、0.05-0.1g肌醇組成，PH＝5.7-5.8；步驟(2)中所述的誘導愈傷組織培養(yǎng)基、步驟(3)中所述的誘導愈傷組織增殖培養(yǎng)基均為MS誘導培養(yǎng)基，其配比為：3.0-5.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5-7g/L瓊脂，20-30g/L蔗糖，0.05-0.1g肌醇組成，PH＝5.7-5.8。

所述的快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，所述的步驟(1)中偏穗鵝觀草發(fā)芽階段需暗培養(yǎng)，發(fā)芽以后階段及步驟(2)、(3)的下胚軸愈傷誘導和愈傷增殖均在連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強度在1500-20001x之間，濕度60-70％的環(huán)境下進行。

所述的快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，還包括有步驟(3)所述的產(chǎn)生的愈傷組織材料，通過稱量法測定愈傷組織的生長量,其具體步驟為：

1)將盛有MS誘導培養(yǎng)基的錐形瓶放在天平上進行稱量，得到數(shù)值a；

2)將1)中稱量過的錐形瓶放入超凈工作臺中進行愈傷組織的轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接結(jié)束后對錐形瓶進行稱量，得到數(shù)值b；

3)將轉(zhuǎn)接后的愈傷組織培養(yǎng)30天后再次對錐形瓶進行稱量，得到數(shù)值c；

愈傷組織的生長量為：c-(b-a)。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.在不用升汞的無毒條件下對偏穗鵝觀草種子進行消毒處理，用50％的濃硫酸對其進行脫皮催芽，繼而用70％的酒精和20％的次氯酸鈉依次處理。

2.以偏穗鵝觀草培養(yǎng)10-15d的無菌實生苗根部為取材對象，保證了材料的無菌，杜絕了由材料帶菌或滅菌不徹底造成的組培污染，并且此階段其下胚軸部分十分幼嫩。

3.以無菌實生苗下胚軸組織為誘導愈傷的材料，能夠高效地誘導愈傷組織的生成。

4.愈傷的誘導與繼代培養(yǎng)所產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)嫩，并且也可以通過稱量法測定愈傷組織的生長量。

5.愈傷的誘導與繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均以2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)為外源激素，實生苗培養(yǎng)、下胚軸愈傷誘導和愈傷增殖均在同一環(huán)境下進行，效果良好。實現(xiàn)了簡單、易行、高效獲得鵝觀草下胚軸愈傷組織的目標。

附圖說明：

圖1.本發(fā)明所用的無菌實生苗；

圖2.本發(fā)明所剪切的偏穗鵝觀草下胚軸部分；

圖3.本發(fā)明下胚軸組織培養(yǎng)28d后所得偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織；

圖4.本發(fā)明偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織繼代繁殖后的愈傷組織。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下面對本發(fā)明的內(nèi)容進行詳細的說明。

實施例1：一種快速誘導及繁殖偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法，將偏穗鵝觀草種子置于50％的濃硫酸中在條件為30℃，210r/min的搖床里振蕩0.9小時做脫皮催芽處理，之后用蒸餾水洗去濃硫酸并置于超凈工作臺，首先用無菌水清洗種子，然后用75％的酒精處理2.5min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用20％的次氯酸鈉處理14min,最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得偏穗鵝觀草無菌種子，將滅菌后的種子放置于培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d，培養(yǎng)基為MS營養(yǎng)液+5g/L瓊脂+20g/L蔗糖+0.05g肌醇組成，PH＝5.7。獲得無菌實生苗的下胚軸作為誘導愈傷的外植體；將無菌實生苗下胚軸橫切為約0.3cm的小段作為誘導愈傷的材料，接種于誘導愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)28d，培養(yǎng)基為MS誘導培養(yǎng)基，其配比為：3.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5g/L瓊脂，20g/L蔗糖，0.05g肌醇組成，PH＝5.7。誘導愈傷的發(fā)生，將獲得的顏色黃綠，質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成小塊，然后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)28d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基繼代增殖。誘導愈傷組織及繼代繁殖所用培養(yǎng)基主要由1/2MS營養(yǎng)液4.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L瓊脂20g/L蔗糖0.1g/L肌醇組成，PH＝5.8，愈傷誘導和愈傷繁殖均為連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強度在1500-20001x之間，濕度70％的環(huán)境下進行。

結(jié)果：誘導愈傷率70％，誘導愈傷黃綠色，無褐變；在繼代增殖過程中，愈傷組織生長迅速，最終愈傷組織呈現(xiàn)黃綠色。

實施例2：一種快速誘導及繁殖偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法，將偏穗鵝觀草種子置于55％的濃硫酸中在條件為28℃，220r/min的搖床里振蕩1小時做脫皮催芽處理，之后用蒸餾水洗去濃硫酸并置于超凈工作臺，首先用無菌水清洗種子，然后用75％的酒精處理3min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用22％的次氯酸鈉處理15min,最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得偏穗鵝觀草無菌種子，將滅菌后的種子放置于培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12d，培養(yǎng)基為MS營養(yǎng)液+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖+0.1g肌醇組成，PH＝5.8。獲得無菌實生苗的下胚軸作為誘導愈傷的外植體；將無菌實生苗下胚軸橫切為約0.5cm的小段作為誘導愈傷的材料，接種于誘導愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d，培養(yǎng)基為MS誘導培養(yǎng)基，其配比為：5.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，7g/L瓊脂，30g/L蔗糖，0.1g肌醇組成，PH＝5.8。誘導愈傷的發(fā)生；將獲得的顏色黃綠，質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成小塊，然后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)28d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基繼代增殖。誘導愈傷組織及繼代繁殖所用培養(yǎng)基主要由MS營養(yǎng)液3.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L瓊脂25g/L蔗糖0.1g/L肌醇組成，PH＝5.8，愈傷誘導和愈傷繁殖均為連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強度在1500-20001x之間，濕度60％的環(huán)境下進行。

結(jié)果：誘導愈傷率70％，誘導愈傷黃綠色，無褐變；在繼代增殖過程中，愈傷組織生長迅速，最終愈傷組織呈現(xiàn)黃綠色。

實施例3：

一種快速誘導及繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，將偏穗鵝觀草種子置于52％的濃硫酸中在條件為30℃，210r/min的搖床里振蕩1.2小時做脫皮催芽處理，之后用蒸餾水洗去濃硫酸并置于超凈工作臺，首先用無菌水清洗種子，然后用75％的酒精處理3.5min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用25％的次氯酸鈉處理16min,最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得偏穗鵝觀草無菌種子，將滅菌后的種子放置于培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d，培養(yǎng)基為MS營養(yǎng)液+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖+0.08g肌醇組成，PH＝5.8。獲得無菌實生苗的下胚軸作為誘導愈傷的外植體；將無菌實生苗下胚軸橫切為約0.5cm的小段作為誘導愈傷的材料，接種于誘導愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)28d，培養(yǎng)基為MS誘導培養(yǎng)基，其配比為：4.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，6g/L瓊脂，25g/L蔗糖，0.08g肌醇組成，PH＝5.8。誘導愈傷的發(fā)生，將獲得的顏色黃綠，質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成小塊，然后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)28d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基繼代增殖。誘導愈傷組織及繼代繁殖所用培養(yǎng)基主要由MS營養(yǎng)液5.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L瓊脂30g/L蔗糖0.1g/L肌醇組成，PH＝5.8，愈傷誘導和愈傷繁殖均為連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強度1500-20001x之間，濕度70％的環(huán)境下進行。

結(jié)果：誘導愈傷率75％，誘導愈傷黃綠色，無褐變；在繼代增殖過程中，愈傷組織生長迅速，最終愈傷組織呈現(xiàn)黃綠色。

實施例4：一種快速誘導繁殖偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法，還包括有步驟(3)所述的產(chǎn)生的愈傷組織材料，通過稱量法測定愈傷組織的生長量。其具體步驟為：

1)將盛有MS誘導培養(yǎng)基的錐形瓶放在天平上進行稱量，得到數(shù)值a；

2)將1)中稱量過的錐形瓶放入超凈工作臺中進行愈傷組織的轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接結(jié)束后對錐形瓶進行稱量，得到數(shù)值b；

3)將轉(zhuǎn)接后的愈傷組織培養(yǎng)30天后再次對錐形瓶進行稱量，得到數(shù)值c；

4)愈傷組織的生長量為：c-(b-a)。

試驗例：

在偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織誘導及增殖過程中，外源誘導激素的選擇與配比對愈傷組織的誘導及增殖起到了關鍵作用，本試驗通過對激素的選擇與配比進行優(yōu)化，最終確定了最佳的偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織誘導及其增殖的方法。

1.外源激素種類的選擇

選擇常用誘導愈傷組織的3種外源激素，設置六個處理，分別為處理A(0.1mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA)，處理B(0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)，處理C(1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)，處理D(5.0mg/L 2,4-D)，處理E(1.0mg/L NAA),處理F(1.0mg/L 6-BA)，其中6-BA是6-芐氨基嘌呤，NAA是萘乙酸，2,4-D是2,4-二氯苯氧乙酸。所用的基礎培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。將培養(yǎng)15d實生苗的下胚軸組織接種于以上六種不同誘導培養(yǎng)基中，3次重復，每瓶接種8塊，連續(xù)光照培養(yǎng)25-30d，觀察誘導愈傷組織情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：處理A，B，C，E，F(xiàn)均無愈傷組織產(chǎn)生，且產(chǎn)生白色絮狀物，處理D誘導愈傷率高達70％，且全為黃綠色的愈傷組織。因此，確定2,4-D是最佳的誘導下胚軸愈傷組織的外源激素。

然后選擇使愈傷增殖的3種外源激素，設置六個處理，分別為處理A(0.1mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA)，處理B(0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)，處理C(1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)，處理D(5.0mg/L 2,4-D)，處理E(1.0mg/L NAA),處理F(1.0mg/L 6-BA)，其中6-BA是6-芐氨基嘌呤，NAA是萘乙酸，2,4-D是2,4二氯苯氧乙酸。所用的基礎培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。在誘導愈傷培養(yǎng)基上生長25-30d的愈傷組織轉(zhuǎn)接至以上六種不同激素處理的增殖培養(yǎng)基中，3次重復，每瓶轉(zhuǎn)接8塊，連續(xù)光照培養(yǎng)25-30d，觀察愈傷組織的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：處理A，B，C，E，F(xiàn)愈傷增值不明顯，并隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織顏色逐漸變黑；處理D愈傷組織明顯增大，且全為黃綠色的愈傷組織。因此，確定2,4-D是最佳的下胚軸愈傷組織增殖的外源激素。

2.外源激素用量的選擇

通過試驗1優(yōu)選出適合誘導偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的外源激素，在此基礎上，繼續(xù)對2,4-D用量進行優(yōu)化，設處理A(3mg/L)、處理B(4mg/L)和處理C(5mg/L)3個梯度，所用基礎培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。將培養(yǎng)15d實生苗的下胚軸組織接種于以上三種不同誘導培養(yǎng)基中，3次重復，每瓶接種8塊，連續(xù)光照培養(yǎng)25-30d，觀察誘導愈傷組織情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：處理A，B，C愈傷誘導率依次為50％，70％，75％，處理A的出愈速度較慢、B愈傷組織黃綠，結(jié)構松軟，處理C愈傷組織黃綠，結(jié)構致密。

然后，在優(yōu)選出最佳偏穗鵝觀草下胚軸誘導愈傷組織2,4-D用量的基礎上，繼續(xù)對下胚軸愈傷組織增殖培養(yǎng)基中2,4-D用量進行優(yōu)化，設處理A(3mg/L)、處理B(4mg/L)和處理C(5mg/L)3個梯度，所用基礎培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。在誘導愈傷組織培養(yǎng)基上生長25-30d的愈傷組織轉(zhuǎn)接至以上三種不同的2,4-D用量的增殖培養(yǎng)基中，3次重復，每瓶轉(zhuǎn)接8塊，連續(xù)光照培養(yǎng)25-30d，觀察愈傷組織的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：處理A愈傷組織生長緩慢，處理B愈傷組織黃綠，結(jié)構松散，處理C明顯增殖，并且愈傷組織黃綠，結(jié)構質(zhì)密。

綜上所述，故確定外源激素2,4-D是偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織誘導及增殖的最適激素配比，同時5.0mg/L 2,4-D是誘導偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織最適的激素用量，5.0mg/L 2,4-D是偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織增殖的最適激素用量。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。