本發(fā)明涉及一種利用沙冬青幼嫩側根誘導沙冬青愈傷組織形成的方法。

背景技術：

沙冬青屬于豆科沙冬青屬，其作為一種超旱生沙漠常綠灌木，能適宜沙漠各種極端環(huán)境(干旱、高溫、低溫和風蝕等)，同時又是第三紀古老的殘遺種，屬于瀕危物種，所以沙冬青是帶有較好抗逆有益基因資源植物，并同時具有基因和植物生物學性狀遺傳進化研究價值。前人只是開展了大量關于其自然保護、群落分布、生物學特性及遺傳背景分析等研究工作，直到近期，有部分的研究報道是關于沙冬青的基因克隆與轉錄組測序分析工作，其研究目標也是在于發(fā)掘沙冬青所蘊藏的寶貴抗逆基因資源及其抗逆機制，以解決當前農業(yè)生產和氣候變化問題。

但由于沙冬青生長周期長，種子結實率和發(fā)芽率低，同時易遭受蟲害，所以沙冬青繁殖能力弱；其成熟組織較老化，發(fā)芽后的幼苗生長后期也易于老化及木質化均不利于DNA和RNA提取等，而且科研人員無法在室內種植繁育沙冬青，必須每年采摘大量新種子開展科研，這在很大程度上限制了分子生物技術在沙冬青的基因克隆與功能研究方面的應用。目前還沒有關于沙冬青組織培養(yǎng)和愈傷誘導的專利報道，僅有部分中文期刊有少量有關沙冬青愈傷組織誘導的報道，但誘導效率偏低且不穩(wěn)定(3％～80％)，方法可重復性差。

技術實現要素：

本發(fā)明的主要目的在于克服現有技術的不足，提供一種利用沙冬青幼嫩側根誘導沙冬青愈傷組織形成的方法，簡便、高效、低成本和穩(wěn)定地獲得沙冬青愈傷組織。

為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種利用沙冬青幼嫩側根誘導沙冬青愈傷組織形成的方法，包括以下步驟：a.利用沙冬青種子進行無菌育苗，通過1/2MS培養(yǎng)基不斷誘導帶根毛的側根形成；b.然后剪取幼嫩的毛狀側根作為外植體，在暗處于CDB1 培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織，并在光下或暗處于CDB6-2培養(yǎng)基上繼代和擴繁所誘導出的愈傷組織。

進一步地：

在含有1/2MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中使種子發(fā)芽，然后轉至裝有1/2MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中誘導幼苗，待幼苗長出許多側根后，移栽到新的裝有1/2MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中，使部分側根露在培養(yǎng)基表面，誘導側根形成大量帶有根毛的短側根。

步驟a中利用沙冬青種子進行無菌育苗的過程包括：

(1)挑選成熟度好、外形完好、未被蟲子吃過的沙冬青種子，裝到已滅菌、密閉的瓶或管中；

(2)在瓶或管中，先用75％乙醇消毒沙冬青種子10min；

(3)去除乙醇，然后用6％次氯酸鈉消毒沙冬青種子30min；

(4)去除次氯酸鈉，用無菌水清洗滅菌種子5～6次；

(5)去除無菌水，稍微瀝干水分，即可轉接種子到含有固體1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；

(6)在22℃～28℃條件下培養(yǎng)2～5天，使種子發(fā)芽。

步驟a中通過1/2MS培養(yǎng)基不斷誘導帶根毛的側根形成的過程包括：

(1)挑選發(fā)芽勢好的種子轉接到裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，以利于發(fā)芽種子的生長；

(2)當沙冬青幼苗長出多條側根后，開展第二次轉接，將生長健壯的幼苗移栽到新的裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，并露出部分側根在培養(yǎng)基表面；

(3)生長20～40天后，露在培養(yǎng)基表面的側根會長出許多帶有根毛的短側根，以此作為誘導愈傷組織的外植體材料。

步驟b中在暗處于CDB1培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織的過程包括：

在無菌條件下，剪取部分毛狀側根置于CDB1培養(yǎng)基上，在暗處28℃條件下誘導培養(yǎng)20～35天，其中CDB1培養(yǎng)基成分為：MS+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA，pH5.8～7.5。

步驟b中在光下或暗處于CDB6-2培養(yǎng)基上繼代和擴繁所誘導出的愈傷組織的過程包括：

將誘導出的愈傷組織轉接到CDB6-2培養(yǎng)基上，在28℃有光條件或暗處下培養(yǎng)，每隔10～15天繼代一次，其中CDB6-2培養(yǎng)基成分為：MS+0.2 mg/L IBA+0.1mg/L KT+0.5mg/L GA3，pH5.8～7.5。

本發(fā)明的有益效果：

利用本發(fā)明形成沙冬青愈傷組織，可以開展沙冬青DNA和RNA提取，進行基因組測序或基因克隆與功能研究等分子生物學研究，而不需要再額外采種育苗，因而可以降低研究成本，提高研究效率，同時保護原生地國家瀕危植物沙冬青的種群。

本發(fā)明的優(yōu)勢具體體現在以下方面：

(1)沙冬青無菌育苗長出許多側根后，通過無菌條件再移栽，并留部分根系露在1/2MS無菌培養(yǎng)基表面，可以誘導其側根上再長出許多帶根毛的短側根，剪取幼嫩的毛狀側根即可作為沙冬青愈傷組織培養(yǎng)的外植體材料。該取材方法不會影響無菌瓶中該單株的正常生長，又能長期獲得幼嫩的外植體材料，供后續(xù)愈傷組織誘導之用。

(2)幼嫩的毛狀側根易于誘導愈傷形成(誘導率≥80％)，愈傷誘導穩(wěn)定，而且無需再采種育苗。

(3)本發(fā)明僅需要在暗處用CDB1培養(yǎng)基誘導愈傷，再轉到光下或暗處用CBD6-2培養(yǎng)基將愈傷組織繼代與擴繁培養(yǎng)，步驟簡單。

(4)可獲得大量無菌、均一、穩(wěn)定的沙冬青愈傷組織，供沙冬青分子生物學研究(如基因克隆與功能研究)之用，無需再去野外采種或育苗。

(5)沙冬青愈傷組織可用于DNA或RNA提取，用于有益基因資源發(fā)掘。

(6)如果愈傷組織能再生成苗，可以實現沙冬青的分子遺傳改良，獲得繁殖力強、抗逆性強的沙冬青，實現沙冬青種質的保護，和用于防風固沙、園林綠化等。

附圖說明

圖1為沙冬青滅菌種子接種在1/2MS培養(yǎng)基的實驗樣本示意圖；

圖2為沙冬青種子在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽5天表型的實驗樣本示意圖；

圖3為無菌培育的帶根毛短側根沙冬青幼苗(35天)的實驗樣本示意圖；

圖4為帶根毛側根在CDB1培養(yǎng)基上誘導出愈傷組織(20天)的實驗樣本示意圖；

圖5為沙冬青愈傷組織在CDB6-2培養(yǎng)基上繼代與擴繁的實驗樣本示意圖(光照培養(yǎng))。

圖6為沙冬青愈傷組織在CDB6-2培養(yǎng)基上繼代與擴繁的實驗樣本示意圖(暗培養(yǎng))。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的實施方式作詳細說明。應該強調的是，下述說明僅僅是示例性的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍及其應用。

在一種實施例中，一種利用沙冬青幼嫩側根誘導沙冬青愈傷組織形成的方法，包括以下步驟：a.利用少量沙冬青種子進行無菌育苗，通過1/2MS培養(yǎng)基不斷誘導帶根毛的側根形成；b.然后剪取幼嫩的毛狀側根作為外植體，在暗處于CDB1培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織，并在光下或暗處于CDB6-2培養(yǎng)基上繼代和擴繁所誘導出的愈傷組織。

在優(yōu)選的實施例中，步驟a包括：通過無菌育苗，在含有1/2MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中使種子發(fā)芽，然后轉至裝有1/2MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中誘導幼苗，待幼苗長出許多側根后，移栽到新的裝有1/2MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中，使部分側根露在培養(yǎng)基表面，誘導側根形成大量帶有根毛的短側根。步驟b中，將此帶根毛短側根作為幼嫩外植體，在CDB1培養(yǎng)基誘導愈傷組織和在CDB6-2培養(yǎng)基上繼代與擴繁，從而獲得大量均一的沙冬青愈傷組織，供開展沙冬青后續(xù)相關研究之用。優(yōu)選地，在暗處用CDB1(MS+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA，pH5.8～7.5)培養(yǎng)基誘導愈傷組織形成，然后在光下或暗處用CBD6-2(MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/L KT+0.5mg/L GA3，pH5.8～7.5)培養(yǎng)基進行愈傷組織的繼代與擴繁培養(yǎng)。

在優(yōu)選的實施例中，沙冬青無菌育苗過程具體包括以下步驟：

(1)挑選成熟度好、外形完好、未被蟲子吃過的沙冬青種子，裝到已滅菌、密閉的瓶或管中；

(2)在瓶或管中，先用75％乙醇消毒沙冬青種子10min；

(3)倒掉75％乙醇，然后用6％次氯酸鈉消毒沙冬青種子30min；

(4)倒掉6％次氯酸鈉，用無菌水清洗滅菌種子5～6次；

(5)倒掉無菌水，稍微瀝干水分，即可轉接種子到含有固體1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；

(6)在22℃～28℃條件下培養(yǎng)2～5天，使種子發(fā)芽。

在優(yōu)選的實施例中，沙冬青毛狀側根誘導過程具體包括以下步驟：

(1)沙冬青種子發(fā)芽后，挑選發(fā)芽勢好的種子轉接到裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，以利于發(fā)芽種子的生長；

(2)當沙冬青幼苗長出多條側根后，可以開展第二次轉接，將生長健壯的幼苗移栽到新的裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，并露出部分 側根在培養(yǎng)基表面；

(3)生長20～40天后，露在培養(yǎng)基表面的側根會長出許多帶有根毛的短側根，以此作為誘導愈傷的外植體材料。

在優(yōu)選的實施例中，沙冬青愈傷組織誘導過程具體包括以下步驟：

在無菌條件下，剪取部分毛狀側根置于CDB1(MS+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA，pH5.8～7.5)愈傷誘導培養(yǎng)基上，在暗處28℃條件下誘導培養(yǎng)20～35天。

在優(yōu)選的實施例中，沙冬青愈傷組織繼代與擴繁過程具體包括以下步驟：

將誘導出的愈傷組織再轉接到CDB6-2(MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/L KT+0.5mg/L GA3，pH5.8～7.5)愈傷組織繼代與擴繁培養(yǎng)基上，在28℃有光或暗處條件下培養(yǎng)，每隔10～15天繼代一次。

實例

(1)挑選外形完好，未被蟲吃過的沙冬青種子，裝到50mL已滅菌離心管中；

(2)在無菌操作臺上，先加入40mL 75％乙醇消毒沙冬青種子10min，期間不時振蕩；

(3)倒掉75％乙醇，然后用40mL高樂氏漂白水(含6.25％次氯酸鈉活性)消毒沙冬青種子30min，期間不時振蕩；

(4)倒掉高樂氏漂白水，用無菌水清洗滅菌種子5～6次；

(5)倒掉無菌水，在無菌操作臺上，用滅菌的鑷子，從離心管中取出種子直接接種到含有固體1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(90×15mm)中(如圖1所示)；

注：1/2MS培養(yǎng)基，2.22g/L MS(含Gamborg's vitamins)(Sigma)；2g/100mL Sucrose(Caisson)；8g/L phytoblend(Caisson)，用1M KOH調pH至5.7；

(6)22℃光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天，使種子發(fā)芽；

(7)沙冬青種子發(fā)芽后，挑選發(fā)芽整齊的種子(如圖2所示)轉接到裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，以利于發(fā)芽種子的生長；

(8)當沙冬青幼苗長出多條側根后，可以開展第二次轉接，將生長健壯的幼苗移栽到新的裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，并露出部分側根在培養(yǎng)基表面；

(9)35天后，露在培養(yǎng)基表面的側根會長出許多帶有根毛的短側根(如圖3所示)，以此作為愈傷誘導的外植體材料；

(10)在無菌操作臺上，剪取部分毛狀側根于CDB1(MS+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L 6-BA，pH5.8～7.5)愈傷誘導培養(yǎng)基上，在暗處28℃條件下誘導培養(yǎng)20天，誘導出的愈傷組織如圖4所示；

(11)將誘導出的愈傷組織再轉接到CDB6-2(MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/L KT+0.5mg/L GA3，pH5.8～7.5)愈傷組織繼代與擴繁培養(yǎng)基上，在28℃有光條件(或暗處)下愈傷組織擴繁，每隔15天繼代一次，擴繁的愈傷組織如圖5(光照培養(yǎng)，20天，培養(yǎng)基pH5.8)，圖6(暗培養(yǎng)，40天，左圖pH7.5，右圖pH5.8)所示。

以上內容是結合具體/優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，其還可以對這些已描述的實施方式做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。