本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術領域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法。
背景技術：
衛(wèi)矛科植物膝柄木是一種極度瀕危的熱帶樹種，我國僅廣西海岸邊有分布，天然種群數(shù)量不到10株，被列入1992年第一批《國家珍貴樹種名錄》中。野生膝柄木生樹高可達十多米，一年生苗高可達1米，適宜在海邊鹽漬環(huán)境中生長，是我國華南熱帶海岸有發(fā)展利用前景的鄉(xiāng)土綠化樹種。由于膝柄木種群數(shù)量小，種子產量低，因此獲得種子繁殖的實生苗很少，開展無性繁殖是搶救性保護這一種群的有效途徑。
無性繁殖包括扦插、嫁接和組織培養(yǎng)，我們對膝柄木開展了2年多年的扦插育苗試驗，使用了多種生根劑和大量枝條，最好結果生根率還不到10％，因此采用扦插繁殖對膝柄木而言難度相當大。對膝柄木的組培培養(yǎng)也實施3年多時間，利用莖段、葉片、花粉、種子等不同的外植體做了試驗，并且在誘導胚乳愈傷組培方面取得了突破，這對膝柄木的組培快繁有極大的推動作用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，解決瀕危植物膝柄木保護與人工繁殖的技術突破。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：
步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；
步驟二、配制初始培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.3-1mg/L的萘乙酸和0.1-0.5mg/L的6-芐氨基嘌呤，并調節(jié)pH至5.8-6.0，并滅菌；
步驟三、將膝柄木胚乳接種于初始培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)6-8天，之后培養(yǎng)6-8天，每天用光照強度為1500～2000LX燈光照射9-12h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，得到初愈傷組織；
步驟四、配制繼代培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.08-0.4mg/L的萘乙酸和0.08-0.4mg/L的6-芐氨基嘌呤，并滅菌；
步驟五、將所述初愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天，每天用光照強度為1500～2000LX燈光照射9-12h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，即誘導完成。
優(yōu)選的是，所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將膝柄木種子去除表面泥土和污物后，用質量濃度為1％-5％的洗衣粉浸泡10-30min，自來水清洗后剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數(shù)為60-80％酒精浸泡20-40s，無菌水沖洗1-3次，再用0.1％氯化汞處理7-10min，無菌水沖洗5-6次即得。
優(yōu)選的是，初始培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基均采用120-130℃高壓滅菌12-20min。
優(yōu)選的是，初始培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基均加入有瓊脂粉2-6g/L，以及蔗糖；其中初始培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基中加入蔗糖的量均占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的1-6％。
優(yōu)選的是，選擇每年3月中旬采收的膝柄木種子來獲取膝柄木胚乳。
優(yōu)選的是，所述胚乳在用無菌水沖洗5-6次后接著浸泡于經過滅菌的質量分數(shù)為2％的牛奶樹汁液中15-20min。
優(yōu)選的是，初愈傷組織在接種于繼代培養(yǎng)基前，在經過滅菌的第一浸液中浸泡了3-5小時，并期間向第一浸液中持續(xù)通入氧氣，所述第一浸液包括2-2.3mol/L的植物鹽、0.8-0.9mol/L的維生素C磷酸酯鎂和0.6-0.7mol/L鉬酸銨、1-1.2mol/L的花青素、2..6×10-4-2.9×10-4mol/L的CrCl3、1.4×10-3-1.7×10-3mol/L的生化黃腐酸鉀，溶劑為水。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
1)將胚乳利用牛奶樹汁液浸泡后，有利于活化修復胚乳表面的細胞，再接種于培養(yǎng)基中培育得到的愈傷組織更加松散更容易分離，使愈傷組織內部細胞吸收營養(yǎng)物質更加充分均勻，得到的愈傷組織性狀更加均一，松散的膝柄木愈傷組織相較于緊密的膝柄木愈傷組織，其活性細胞更豐富，老化的細胞較少，并不像緊密的膝柄木愈傷組織只有外部的細胞可進行誘變再生，從而提高了誘變效率。
2)采用本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基和光照強度與光照時間的控制，大大縮短了繼代培養(yǎng)的次數(shù)，在初始培養(yǎng)完成后僅需更換一次繼代培養(yǎng)基，之后無需再更換培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)10-15天即可得到胚性愈傷組織；相較于傳統(tǒng)的組培需要繼代3-6次，大大簡化了工序。
3)由于膝柄木一種極度瀕危的熱帶樹種，天然種群數(shù)量不到10株，其每年2月-4月生長種子，由于2月的種子中的胚乳呈液體狀，還沒生長成熟，不適合用于進行組培，而4月份時膝柄木種子已完全成熟，導致胚乳進行組培誘導率低，當選取3月中旬膝柄木種子進行組培時(此時膝柄木果皮稍呈黃色，包裹1粒褐色種子，在果皮與種子之間有黃偏紅的肉質假種皮)，其誘導率幾乎可以達到100％，大大提高了誘導率。
4)初愈傷組織在第一浸液中浸泡后通過繼代培育形成的愈傷組織呈現(xiàn)多數(shù)胚狀體結構，有利于誘導分化形成幼苗，實現(xiàn)膝柄木的人工搶救繁殖。
本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1
一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：
步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月11號和12號采集的膝柄木種子去除表面泥土和污物后，用質量濃度為2％的洗衣粉浸泡20min，自來水清洗后剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數(shù)為70％酒精浸泡30s，無菌水沖洗1次，再用0.1％氯化汞處理8min，無菌水沖洗5次即得。
步驟二、配制初始培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.5mg/L的萘乙酸、0.3mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L，蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的4％，并調節(jié)pH至5.9，并滅菌，采用121℃高壓滅菌15min。
步驟三、將膝柄木胚乳接種于初始培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)7天，之后培養(yǎng)7天，每天用光照強度為1800LX燈光照射10h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。
步驟四、配制繼代培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.2mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L、蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的4％，并滅菌，采用121℃高壓滅菌15min。
步驟五、將所述初愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天，每天用光照強度為1600LX燈光照射11h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，即誘導完成。
在實施例1中選取3月11號和12號采集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養(yǎng)，誘導率為88/90＝97.8％。
實施例2
一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：
步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月14號采集的膝柄木種子去除表面泥土和污物后，用質量濃度為1％的洗衣粉浸泡10min，自來水清洗后剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數(shù)為60％酒精浸泡20s，無菌水沖洗1次，再用0.1％氯化汞處理7min，無菌水沖洗5次即得。
步驟二、配制初始培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.3mg/L的萘乙酸、0.1mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉2g/L，蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的1％，并調節(jié)pH至5.8，并滅菌，采用120℃高壓滅菌12min。
步驟三、將膝柄木胚乳接種于初始培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)6天，之后培養(yǎng)8天，每天用光照強度為1500LX燈光照射9h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。
步驟四、配制繼代培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.08mg/L的萘乙酸和0.08mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉2g/L、蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的1％，并滅菌，采用120℃高壓滅菌12min。
步驟五、將所述初愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，每天用光照強度為2000LX燈光照射9h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，即誘導完成。
在實施例2中選取3月14號采集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養(yǎng)，誘導率為87/90＝96.7％。
實施例3
一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：
步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月15號采集的膝柄木種子去除表面泥土和污物后，用質量濃度為5％的洗衣粉浸泡30min，自來水清洗后剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數(shù)為80％酒精浸泡40s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞處理10min，無菌水沖洗6次即得。
步驟二、配制初始培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入1mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉6g/L，蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的6％，并調節(jié)pH至6.0，并滅菌，采用130℃高壓滅菌20min。
步驟三、將膝柄木胚乳接種于初始培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)8天，之后培養(yǎng)6天，每天用光照強度為1500LX燈光照射12h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。
步驟四、配制繼代培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.4mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉6g/L、蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的6％，并滅菌，采用130℃高壓滅菌20min。
步驟五、將所述初愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天，每天用光照強度為2000LX燈光照射12h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，即誘導完成。
在實施例3中選取3月15號采集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養(yǎng)，誘導率為88/90＝97.8％。
實施例4
一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：
步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月13號采集的膝柄木種子去除表面泥土和污物后，用質量濃度為2％的洗衣粉浸泡12min，自來水清洗后剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數(shù)為65％酒精浸泡22s，無菌水沖洗2次，再用0.1％氯化汞處理8min，無菌水沖洗6次，接著浸泡于經過滅菌的質量分數(shù)為2％的牛奶樹汁液中15min。。
步驟二、配制初始培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.7mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉3g/L，蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的4％，并調節(jié)pH至5.8，并滅菌，采用128℃高壓滅菌14min。
步驟三、將膝柄木胚乳接種于初始培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)7天，之后培養(yǎng)7天，每天用光照強度為1600LX燈光照射10h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。
步驟四、初愈傷組織在經過滅菌的第一浸液中浸泡了4小時，并期間向第一浸液中持續(xù)通入氧氣，所述第一浸液包括2mol/L的植物鹽、0.8mol/L的維生素C磷酸酯鎂、0.6mol/L鉬酸銨、1mol/L的花青素、2..6×10-4mol/L的CrCl3、1.4×10-3mol/L的生化黃腐酸鉀，溶劑為水。
步驟五、配制繼代培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.08mg/L的萘乙酸和0.08mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉2g/L、蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的5％，并滅菌，采用128℃高壓滅菌19min。
步驟六、將在經過滅菌的第一浸液中浸泡了的初愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)11天，每天用光照強度為1700LX燈光照射11h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，即誘導完成。
在實施例4中選取3月13號采集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養(yǎng)，誘導率為89/90＝98.9％。
實施例5
一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：
步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將3月14號采集的膝柄木種子去除表面泥土和污物后，用質量濃度為5％的洗衣粉浸泡30min，自來水清洗后剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數(shù)為80％酒精浸泡40s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞處理10min，無菌水沖洗6次，接著浸泡于經過滅菌的質量分數(shù)為2％的牛奶樹汁液中20min。
步驟二、配制初始培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入1mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉6g/L，蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的6％，并調節(jié)pH至6.0，并滅菌，采用130℃高壓滅菌20min。
步驟三、將膝柄木胚乳接種于初始培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)6天，之后培養(yǎng)7天，每天用光照強度為1500LX燈光照射10h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。
步驟四、初愈傷組織在經過滅菌的第一浸液中浸泡了4小時，并期間向第一浸液中持續(xù)通入氧氣，所述第一浸液包括2.3mol/L的植物鹽、0.9mol/L的維生素C磷酸酯鎂、0.7mol/L鉬酸銨、1.2mol/L的花青素、2.9×10-4mol/L的CrCl3、1.7×10-3mol/L的生化黃腐酸鉀，溶劑為水。
步驟五、配制繼代培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.4mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉6g/L、蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的6％，并滅菌，采用130℃高壓滅菌20min。
步驟六、將在經過滅菌的第一浸液中浸泡了的初愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天，每天用光照強度為2000LX燈光照射12h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，即誘導完成。
在實施例5中選取3月14號采集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養(yǎng)，誘導率為90/90＝100％。
對照例1
一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：
步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將4月10號采集的膝柄木種子去除表面泥土和污物后，用質量濃度為2％的洗衣粉浸泡20min，自來水清洗后剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數(shù)為70％酒精浸泡30s，無菌水沖洗1次，再用0.1％氯化汞處理8min，無菌水沖洗5次即得。
步驟二、配制初始培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.2mg/L的萘乙酸、0.7mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L，蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的4％，并調節(jié)pH至5.9，并滅菌，采用121℃高壓滅菌15min。
步驟三、將膝柄木胚乳接種于初始培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)7天，之后培養(yǎng)7天，每天用光照強度為1000LX燈光照射6h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。
步驟四、配制繼代培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.01mg/L的萘乙酸和0.01mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L、蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的4％，并滅菌，采用121℃高壓滅菌15min。
步驟五、將所述初愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天，每天用光照強度為1000LX燈光照射6h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，即誘導完成。
在對照組1中選取4月10號采集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養(yǎng)，誘導率為27/90＝30％。
對照例2
一種膝柄木胚乳誘導愈傷組織方法，包括以下步驟：
步驟一、選擇膝柄木胚乳作為外植體；所述膝柄木胚乳的獲取方法為：將4月3號采集的膝柄木種子去除表面泥土和污物后，用質量濃度為2％的洗衣粉浸泡20min，自來水清洗后剝開種皮取出胚乳，在無菌條件下，用體積分數(shù)為70％酒精浸泡30s，無菌水沖洗1次，再用0.1％氯化汞處理8min，無菌水沖洗5次即得。
步驟二、配制初始培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入1.5mg/L的萘乙酸、1mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L，蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的4％，并調節(jié)pH至5.9，并滅菌，采用121℃高壓滅菌15min。
步驟三、將膝柄木胚乳接種于初始培養(yǎng)基中，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)7天，之后培養(yǎng)7天，每天用光照強度為2800LX燈光照射18h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，得到初愈傷組織。
步驟四、配制繼代培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中加入0.8mg/L的萘乙酸和0.8mg/L的6-芐氨基嘌呤、瓊脂粉4g/L、蔗糖占所加入MS培養(yǎng)基質量分數(shù)的4％，并滅菌，采用121℃高壓滅菌15min。
步驟五、將所述初愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天，每天用光照強度為2800LX燈光照射18h，培養(yǎng)溫度控制在25℃，即誘導完成。
在對照組2中選取4月3號采集的膝柄木種子共90粒，分為三組，每組30瓶進行誘導培養(yǎng)，誘導率為34/90＝37.8％。
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。