本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求提交于2014年4月3日的美國臨時申請?zhí)?1/974,672的權(quán)益，其通過引用整體并入本文。聯(lián)邦政府資助的研究本發(fā)明根據(jù)由陸軍研究辦公室(ArmyResearchOffice)頒發(fā)的合同No.W911NF-11-2-0056在政府支持下完成。政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容的一些方面涉及生物技術(shù)。具體而言，一些實施方案涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控和合成生物學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：最近，細菌II型CRISPR/Cas系統(tǒng)(成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)(CRISPR)/CRISPR相關(guān)系統(tǒng)(Cas)，clustered，regularlyinterspaced，shortpalindromicrepeats/CRISPRassociatesystem)已經(jīng)適用于獲得可編程的DNA結(jié)合，而不需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)改造。Cas蛋白為專門用于切割DNA的核酸酶。在II型CRISPR/Cas系統(tǒng)中，所述CasDNA結(jié)合蛋白的序列特異性通過導引RNA(guideRNA，gRNA)確定，其具有與靶DNA位點的核苷酸堿基配對互補性。這使得能夠簡單且高度靈活地編程Cas結(jié)合。技術(shù)實現(xiàn)要素：在哺乳動物細胞(例如人細胞)中構(gòu)建基于CRISPR的線路(circuit)的主要挑戰(zhàn)是多個gRNA對于獲得所需的激活水平經(jīng)常是必需的，特別是與內(nèi)源啟動子相互作用的情況下。目前的技術(shù)依賴于使用多個gRNA表達構(gòu)建體，每個構(gòu)建體具有其各自的啟動子。在一些實施方案中，本文描述的經(jīng)改造構(gòu)建體可用于從單個轉(zhuǎn)錄本中表達許多功能gRNA，從而使得對具有多個輸出的合成基因線路進行緊湊的編碼(compactencoding)，以及用于調(diào)節(jié)天然基因和重接(rewire)天然網(wǎng)絡(luò)的簡潔策略成為可能。因此，在一些實施方案中，本文提供了方法和組合物(例如核酸和細胞)，其使得能夠通過整合基于核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)的調(diào)控機制，如RNA干擾和CRISPR/Cas系統(tǒng)，產(chǎn)生可擴展的合成基因線路和/或?qū)?nèi)源基因及基因網(wǎng)絡(luò)進行修飾。例如，本文的多個實施方案在人細胞中，將多個哺乳動物RNA調(diào)控策略(包括RNA三螺旋結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子、微小RNA(microRNA)以及核酶)與基于細菌Cas的CRISPR轉(zhuǎn)錄因子(CRISPRtranscriptionfactors，CRISPR-TF)以及基于核糖核酸酶(例如基于Cas6/Csy4)的RNA處理相組合，以修飾基因表達。出人意料的是，本公開內(nèi)容的互補方法使得能夠從通過RNA聚合酶II(RNApolymeraseII，RNApolII或RNAPII)啟動子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本表達功能gRNA，同時允許目的蛋白質(zhì)的共表達。此外，在一些實施方案中，本文提供的遺傳構(gòu)建體使得能夠從單個轉(zhuǎn)錄本多重表達蛋白質(zhì)和/或RNA干擾分子(例如微小RNA)以及多個gRNA，以用于對合成構(gòu)建體和內(nèi)源人啟動子進行有效的調(diào)節(jié)。本文提供的經(jīng)改造構(gòu)建體可用于例如實施可調(diào)的合成基因線路，包括多階段轉(zhuǎn)錄級聯(lián)。此外，在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的方法和組合物可用于在具有多個輸出和反饋環(huán)(feedbackloop)的RNA依賴性基因線路中重接調(diào)控連接，以實現(xiàn)復(fù)雜的功能行為。本文提供的經(jīng)改造構(gòu)建體對于基礎(chǔ)生物學、治療以及合成生物學應(yīng)用之例如人細胞中的可擴展基因線路的構(gòu)建，以及天然調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)(例如微擾)是有價值的。本公開內(nèi)容的多個方面提供了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含(a)編碼至少1個導引RNA(gRNA)的核苷酸序列；以及(b)選自以下的一個或更多個核苷酸序列：(i)編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列和(ii)編碼RNA干擾分子的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述啟動子為RNA聚合酶II依賴性(RNApolII)啟動子。在一些實施方案中，至少1個gRNA的側(cè)翼為編碼核糖核酸酶識別位點的核苷酸序列。所述核糖核酸酶識別位點可以為例如Csy4核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，至少1個gRNA的側(cè)翼為編碼核酶的核苷酸序列。所述核酶可以選自例如錘頭狀核酶(hammerheadribozyme)和丁型肝炎病毒核酶(Hepatitisdeltavirusribozyme)。在一些實施方案中，(a)所述的核苷酸序列的側(cè)翼為同源內(nèi)含子剪接位點(cognateintronicsplicesites)。本公開內(nèi)容的一些方面提供了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼至少1個導引RNA(gRNA)的第一核苷酸序列，所述gRNA的側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述啟動子為RNA聚合酶II依賴性(RNApolII)啟動子。所述RNApolII啟動子可為例如人巨細胞病毒啟動子、人泛素啟動子、人組蛋白H2A1啟動子或人炎性趨化因子CXCL1啟動子。在一些實施方案中，所述第一核苷酸序列的側(cè)翼為同源內(nèi)含子剪接位點。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼目的蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列可在所述第二核苷酸序列內(nèi)，或者所述第二核苷酸序列可在所述第一核苷酸序列的上游。在一些實施方案中，所述經(jīng)改造構(gòu)建體還包含編碼至少1個微小RNA的核苷酸序列?？衫缭谒瞿康牡鞍踪|(zhì)內(nèi)編碼微小RNA。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列之間。在一些實施方案中，所述第一核苷酸序列編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或更多個gRNA，每個gRNA的側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述第一核苷酸序列編碼至少2個側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。在一些實施方案中，所述核糖核酸酶識別位點為Csy4核糖核酸酶識別位點。每個所述Csy4核糖核酸酶識別位點的長度可為例如28個核苷酸。在一些實施方案中，所述Csy4核糖核酸酶識別位點來自于銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。在一些實施方案中，所述三螺旋結(jié)構(gòu)由來自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列編碼。本公開內(nèi)容的一些方面提供了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼目的蛋白質(zhì)的第一核苷酸序列，以及編碼至少1個側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的導引RNA(gRNA)的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列的側(cè)翼為編碼同源內(nèi)含子剪接位點的核苷酸序列并且位于所述第一核苷酸序列內(nèi)。在一些實施方案中，所述啟動子為RNA聚合酶II依賴性(RNApolII)啟動子。所述RNApolII啟動子可為例如人巨細胞病毒啟動子、人泛素啟動子、人組蛋白H2A1啟動子或人炎性趨化因子CXCL1啟動子。在一些實施方案中，所述經(jīng)改造構(gòu)建體還包含編碼至少1個微小RNA的核苷酸序列?？衫缭谀康牡鞍踪|(zhì)內(nèi)編碼微小RNA。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的第三核苷酸序列，以及編碼至少1個側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的第四核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的下游，并且在所述第四核苷酸序列的上游。在一些實施方案中，所述第二核苷酸序列編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或更多個gRNA，每個gRNA的側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述第二核苷酸序列編碼至少2個側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。在一些實施方案中，所述核糖核酸酶識別位點為Csy4核糖核酸酶識別位點。所述Csy4核糖核酸酶識別位點的長度可為例如28個核苷酸。在一些實施方案中，所述Csy4核糖核酸酶識別位點來自于銅綠假單胞菌。在一些實施方案中，所述同源內(nèi)含子剪接位點來自于共有內(nèi)含子(consensusintron)。在一些實施方案中，所述同源內(nèi)含子剪接位點來自于HSV1潛伏相關(guān)內(nèi)含子(HSV1latency-associatedintron)。在一些實施方案中，所述同源內(nèi)含子剪接位點來自于sno-IncRNA2內(nèi)含子。在一些實施方案中，所述三螺旋結(jié)構(gòu)由來自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，所述第四核苷酸序列編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或更多個gRNA，每個gRNA的側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述第四核苷酸序列編碼至少2個側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。本公開內(nèi)容的一些方面提供了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼至少1個側(cè)翼為核酶的導引RNA(gRNA)的第一核苷酸序列。在一些實施方案中，所述啟動子為RNA聚合酶II依賴性(RNApolII)啟動子。所述RNApolII啟動子可為例如人巨細胞病毒啟動子、人泛素啟動子、人組蛋白H2A1啟動子或人炎性趨化因子CXCL1啟動子。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼目的蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上游。在一些實施方案中，所述經(jīng)改造構(gòu)建體還包含編碼至少1個微小RNA的核苷酸序列。可例如在所述目的蛋白質(zhì)內(nèi)編碼微小RNA。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列之間。在一些實施方案中，所述第四核苷酸序列編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或更多個gRNA，每個gRNA的側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述第一核苷酸序列編碼至少2個側(cè)翼為核酶的gRNA，并且其中所述gRNA彼此不同。在一些實施方案中，所述核酶為順式作用核酶。例如，順式作用核酶可以是錘頭狀核酶或丁型肝炎病毒核酶。在一些實施方案中，錘頭狀核酶位于所述至少1個gRNA的5’末端。在一些實施方案中，錘頭狀核酶位于所述至少1個gRNA的3’末端。在一些實施方案中，丁型肝炎病毒核酶位于所述至少1個gRNA的5’末端。在一些實施方案中，丁型肝炎病毒核酶位于所述至少1個gRNA的3’末端。在一些實施方案中，所述三螺旋結(jié)構(gòu)由來自于MALAT1基因座的3’末端或MENβ基因座的3’末端的核苷酸序列編碼。本公開內(nèi)容的一些方面提供了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼目的蛋白質(zhì)內(nèi)的至少1個RNA干擾分子的第一核苷酸序列，編碼至少1個側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的導引RNA的第二核苷酸序列，以及編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間。本公開內(nèi)容的一些方面提供了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼目的蛋白質(zhì)內(nèi)的至少1個RNA干擾分子的第一核苷酸序列，編碼至少1個側(cè)翼為核酶的導引RNA的第二核苷酸序列，以及編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間。在一些實施方案中，RNA干擾分子選自微小RNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNA)。在一些實施方案中，所述至少1個RNA干擾分子包含至少1個miRNA。一些方面提供了包含1個或更多個本公開內(nèi)容之經(jīng)改造構(gòu)建體的載體。一些方面提供了包含本公開內(nèi)容之經(jīng)改造構(gòu)建體和/或本公開內(nèi)容之載體的細胞。本文還提供了包含至少2個本公開內(nèi)容之經(jīng)改造構(gòu)建體和/或至少2個本公開內(nèi)容之載體的細胞。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩(wěn)定表達核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩(wěn)定表達Cas蛋白。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述細胞還包含經(jīng)改造核酸，所述核酸包含與編碼核糖核酸酶的核苷酸序列有效相連的啟動子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞還包含經(jīng)改造核酸，所述核酸包含與編碼Cas蛋白的核苷酸序列有效相連的啟動子。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述細胞還包含至少1個(或至少2個)額外的經(jīng)改造核酸，所述核酸包含與編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列有效相連的啟動子。在一些實施方案中，額外的經(jīng)改造核酸的所述目的蛋白質(zhì)與所述細胞中的任何其他目的蛋白質(zhì)不同。在一些實施方案中，所述細胞為細菌細胞。在一些實施方案中，所述細胞為人細胞。本文還提供了包括培養(yǎng)本公開內(nèi)容的任意細胞的方法。在一些實施方案中，所述方法包括在允許核酸表達的條件下培養(yǎng)所述細胞。本公開內(nèi)容的一些方面提供了產(chǎn)生、修飾或重接細胞遺傳線路(cellulargeneticcircuit)的方法，所述方法包括在細胞中表達第一經(jīng)改造構(gòu)建體，所述構(gòu)建體選自本文所提供的任意經(jīng)改造構(gòu)建體，以及在細胞中表達第二經(jīng)改造構(gòu)建體，所述構(gòu)建體選自本文所提供的任意經(jīng)改造構(gòu)建體，其中所述第一經(jīng)改造構(gòu)建體的至少1個gRNA與所述第二經(jīng)改造構(gòu)建體的啟動子的區(qū)域或者內(nèi)源啟動子的區(qū)域互補并結(jié)合。在一些實施方案中，所述方法還包括表達第三經(jīng)改造構(gòu)建體，所述構(gòu)建體選自本文所提供的任意經(jīng)改造構(gòu)建體，其中所述第二經(jīng)改造構(gòu)建體的至少1個gRNA與所述第三經(jīng)改造構(gòu)建體的啟動子的區(qū)域或者內(nèi)源啟動子的區(qū)域互補并結(jié)合。在一些實施方案中，所述方法還包括表達至少1個額外的經(jīng)改造核酸，所述核酸選自本文所提供的任意所述經(jīng)改造構(gòu)建體，其中所述至少1個額外的經(jīng)改造核酸的至少1個gRNA與所述細胞的任一個經(jīng)改造核酸的啟動子的區(qū)域或者至少1個內(nèi)源啟動子的區(qū)域互補并結(jié)合。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩(wěn)定表達核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩(wěn)定表達Cas蛋白。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述細胞還包含經(jīng)改造核酸，所述核酸包含與編碼核糖核酸酶的核苷酸序列有效相連的啟動子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞還包含經(jīng)改造核酸，所述核酸包含與編碼Cas蛋白的核苷酸序列有效相連的啟動子。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括培養(yǎng)所述細胞。本公開內(nèi)容的一些方面提供了多重細胞表達導引核糖核酸(gRNA)的方法，其包括在細胞中表達經(jīng)改造構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼至少2個gRNA的第一核苷酸序列，每個gRNA的側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼目的蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上游。在一些實施方案中，所述經(jīng)改造構(gòu)建體還包含編碼至少1個微小RNA的核苷酸序列。可例如在所述目的蛋白質(zhì)內(nèi)編碼微小RNA。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列之間。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩(wěn)定表達核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩(wěn)定表達Cas蛋白。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述細胞還包含經(jīng)改造核酸，所述核酸包含與編碼核糖核酸酶的核苷酸序列有效相連的啟動子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞還包含經(jīng)改造核酸，所述核酸包含與編碼Cas蛋白的核苷酸序列有效相連的啟動子。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括培養(yǎng)所述細胞。附圖簡述圖1A示出了經(jīng)改造構(gòu)建體CMVp-mK-Tr-28-g1-28，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其在編碼三螺旋結(jié)構(gòu)(三鏈體，triplex)的核苷酸序列的上游，而所述三螺旋結(jié)構(gòu)在編碼側(cè)翼為Csy4識別位點(28bp)之導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上游。該改造的構(gòu)建體的構(gòu)造可被稱為“三鏈體/Csy4”構(gòu)造。圖1A中的示意圖示出在共表達轉(zhuǎn)錄活性形式的Cas9蛋白(taCas9)、Csy4核糖核酸酶、CMVp-mK-Tr-28-g1-28以及P1-EYFP的細胞中，mKate2蛋白和導引RNA均表達。該導引RNA(gRNA)與具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9蛋白締合以激活合成啟動子(P1)，從而驅(qū)動增強的黃色熒光蛋白(P1-EYFP)的表達。圖1B示出了比較來自共表達CMVp-mK-Tr-28-g1-28、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖。EYFP的表達水平有60倍的提高，證明了功能gRNA的產(chǎn)生。表達Csy4的質(zhì)粒濃度的提高導致mKate2表達水平的提高。以本圖和圖2B至圖2D的數(shù)據(jù)之間各自的最大熒光歸一化熒光值，以使得能夠在“三鏈體/Csy4”和“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)造之間進行交叉比較，如下文所討論。圖1C示出了比較在共表達CMVp-mK-Tr-28-g1-28、Csy4和Cas9之細胞中的Csy4和Cas9表達對于mKate2表達水平的作用的圖。Csy4和taCas9具有對mKate2熒光的相反作用。taCas9構(gòu)建體單獨降低mKate2水平，而Csy4構(gòu)建單獨增強mKate2熒光。以從四種檢測條件下所觀察到的最大mKate2表達值(僅Csy4)歸一化所述mKate2表達水平。圖1D示出了比較不同RNAPII啟動子對相對的IL1RNmRNA表達水平的作用的圖。使用了人RNAPII啟動子CXCL1p、H2A1p與UbCp，以及RNAPII啟動子CMVp，驅(qū)動4種不同gRNA(gRNA3-6，表1)的表達，其激活“三鏈體/Csy4”構(gòu)建體的IL1RN啟動子。將結(jié)果與RNAPIII啟動子U6p對相同gRNA的直接表達的作用進行比較。將4種各自含有指定的啟動子之一以及gRNA3-6的不同質(zhì)粒與編碼taCas9的質(zhì)粒、有或無表達Csy4的質(zhì)粒一起在細胞中共轉(zhuǎn)染。使用qRT-PCR監(jiān)測相比較于具有非特異性gRNA(NS、CMVp-mK-Tr-28-g1-28)的對照構(gòu)建體之相對IL1RNmRNA表達。RNAPII啟動子導致大范圍的IL1RN激活，相比于不存在Csy4，Csy4的存在極大地提高激活。即使不存在Csy4，通過RNAPII啟動子也會實現(xiàn)IL1RN的激活，雖然以比Csy4存在下低得多的水平。圖1E示出了比較通過“三鏈體/Csy4”構(gòu)建體對內(nèi)源IL1RN基因座激活的輸入-輸出轉(zhuǎn)移曲線的圖，其通過相對于相對IL1RNmRNA表達水平(作為輸出)繪制mKate2表達水平(作為輸入的代表)得以確定。該數(shù)據(jù)表明，可用不同長度的RNAPII啟動子實現(xiàn)內(nèi)源基因座的可調(diào)調(diào)節(jié)。IL1RN數(shù)據(jù)與圖1D所示相同。圖2A示出了經(jīng)改造構(gòu)建體CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內(nèi)含子-mKEx2，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼側(cè)翼為Csy4識別位點(28bp)之導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，其側(cè)翼為同源內(nèi)含子剪接位點，該位點在編碼mKate2蛋白的核苷酸序列內(nèi)。該改造的構(gòu)建體的構(gòu)造可被稱為“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)造。圖2A中的示意圖示出了在共表達轉(zhuǎn)錄活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內(nèi)含子-mKEx2以及P1-EYFP的細胞中，表達了導引RNA，之后其與具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9蛋白締合以激活合成啟動子(P1)，從而驅(qū)動增強的黃色熒光蛋白(P1-EYFP)的表達。與圖1A所示的“三鏈體/Csy4”構(gòu)造相反，在Csy4水平提高的情況下，該“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)造導致mKate2基因表達的降低，在不受理論束縛的情形下，這可能是由于剪接之前的前mRNA的切割。圖2B示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內(nèi)含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中所述同源內(nèi)含子剪接位點來自于共有內(nèi)含子。圖2C示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內(nèi)含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中所述同源內(nèi)含子剪接位點來自于snoRNA2內(nèi)含子。圖2D示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內(nèi)含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中所述同源內(nèi)含子剪接位點來自于HSV1內(nèi)含子。圖2E示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內(nèi)含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中單個Csy4結(jié)合位點位于HSV1內(nèi)含子內(nèi)的gRNA上游。該構(gòu)造不產(chǎn)生功能gRNA但在更高的Csy4水平下會導致mKate2熒光的降低。以該實驗和[28-g1-28]HSV1對照(圖11)之間的最大熒光水平歸一化熒光值。圖2F示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內(nèi)含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中單個Csy4結(jié)合位點位于HSV1內(nèi)含子內(nèi)的gRNA下游。該構(gòu)造產(chǎn)生低水平的功能gRNA并且也導致在更高的表達Csy4的質(zhì)粒濃度下mKate2水平的降低。以該實驗和[28-g1-28]HSV1對照(圖11)之間的最大熒光水平歸一化熒光值。圖3A示出了經(jīng)改造構(gòu)建體CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其在編碼三螺旋結(jié)構(gòu)(三鏈體)的核苷酸序列的上游，所述三螺旋結(jié)構(gòu)在編碼導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上游，所述導引RNA側(cè)翼為核酶(5’錘頭狀(HH)核酶，以及3’HDV核酶)。該改造的構(gòu)建體的構(gòu)造可被稱為“三鏈體/核酶”構(gòu)造。圖3A中的示意圖示出在共表達轉(zhuǎn)錄活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV的細胞中，mKate2蛋白和導引RNA均表達。圖3B示出了經(jīng)改造構(gòu)建體CMVp-mK-HH-g1-HDV，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其在編碼導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上游，所述導引RNA的側(cè)翼為核酶(5’錘頭狀(HH)核酶，以及3’HDV核酶)。圖3B中的示意圖示出在共表達轉(zhuǎn)錄活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-mK-HH-g1-HDV的細胞中，mKate2蛋白和導引RNA均表達。圖3C示出了經(jīng)改造構(gòu)建體CMVp-HH-g1-HDV，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，所述導引RNA的側(cè)翼為核酶(5’錘頭狀(HH)核酶，以及3’HDV核酶)。圖3C中的示意圖示出在共表達轉(zhuǎn)錄活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-HH-g1-HDV的細胞中，導引RNA表達。圖3D示出了比較共表達CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV、CMVp-mK-HH-g1-HDV或CMVp-HH-g1-HDV以及P1-EYFP的細胞中相對EYFP與mKate2表達水平的圖。示出了有或無Csy4情況下表達“三鏈體/Csy4”構(gòu)建體(mK-Tr-28-g1-28)的細胞，以及表達RNAPIII啟動子、U6p、驅(qū)動性gRNA1(U6p-g1)的細胞的表達水平，以用于比較。圖4A示出了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼側(cè)翼為Csy4識別位點(28bp)之導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，其側(cè)翼為同源內(nèi)含子剪接位點，所述位點在編碼mKate2蛋白的核苷酸序列內(nèi)，其位于編碼三螺旋結(jié)構(gòu)(三鏈體)的核苷酸序列的上游，所述三螺旋結(jié)構(gòu)位于編碼側(cè)翼為Csy4識別位點(28bp)之gRNA(gRNA2)的核苷酸序列的上游(輸入A，“內(nèi)含子-三鏈體”)。通過gRNA1特異性P1-EYFP構(gòu)建體和gRNA2特異性P2-ECFP構(gòu)建體的激活評估功能gRNA的表達。圖4B示出了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其位于編碼三螺旋結(jié)構(gòu)(三鏈體)的核苷酸序列的上游，所述三螺旋結(jié)構(gòu)位于編碼2個gRNA(gRNA1和gRNA2)的核苷酸序列的上游，所述gNRA各自的側(cè)翼為Csy4識別位點。所述gRNA與間插及側(cè)翼的Csy4識別位點串聯(lián)地編碼(輸入B，“三鏈體-串聯(lián)”)。通過gRNA1特異性P1-EYFP構(gòu)建體和gRNA2特異性P2-ECFP構(gòu)建體的激活評估功能gRNA的表達。圖4C示出的圖證明了這兩種多重gRNA表達構(gòu)建體(輸入A和輸入B)表現(xiàn)出在Csy4存在下，對EYFP及ECFP表達的有效激活，從而證明了從單個轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生多活性gRNA。此外，如從圖1和圖2所預(yù)計的，mKate2水平因為內(nèi)含子構(gòu)造隨著輸入A而降低，而mKate2水平因為非內(nèi)含子構(gòu)造隨著輸入B而提高。圖5A示出了經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其位于編碼三螺旋結(jié)構(gòu)(三鏈體)的核苷酸序列的上游，所述三螺旋結(jié)構(gòu)位于編碼4個不同的gRNA(gRNA3至gRNA6)的核苷酸序列的上游，所述gNRA各自的側(cè)翼為Csy4識別位點。所述gRNA與間插及側(cè)翼的Csy4識別位點串聯(lián)地編碼(mK-Tr-(28-g-28)3-6)。圖5B示出的圖證明了多重mK-Tr-(28-g-28)3-6構(gòu)建體表現(xiàn)出在Csy4的存在下相比于不存在Csy4的情況下相同構(gòu)建體之IL1RN表達的高水平激活。與具有通過“三鏈體/Csy4”構(gòu)造表達的非特異性gRNA1(NS，CMVp-mK-Tr-28-g1-28)的對照構(gòu)建體相比，確定相對IL1RNmRNA的表達。為了比較，示出了非多重質(zhì)粒組，其含有相同的gRNA(gRNA3至gRNA6)，每一個gRNA由分開的單獨質(zhì)粒表達。圖6A示出了通過使用內(nèi)含子gRNA1(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV-mKEX2)作為第一階段實施的三階段轉(zhuǎn)錄級聯(lián)。gRNA1特異性地靶向P1啟動子以表達gRNA2(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)，之后從P2啟動子激活ECFP的表達(P2-ECFP)。圖6B示出了通過使用“三鏈體/Csy4”構(gòu)造以表達gRNA1(CMVp-mK-Tr-28-g1-28)從而實施的三階段轉(zhuǎn)錄級聯(lián)。gRNA1特異性地靶向P1啟動子以表達gRNA2(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)，之后從P2啟動子激活ECFP的表達(P2-ECFP)。圖6C示出的圖證明了圖6A中的完整三階段轉(zhuǎn)錄級聯(lián)表現(xiàn)出所有三種熒光蛋白的表達。將級聯(lián)中的三個階段的任意一個移除會導致該具體階段及依賴性的下游階段的熒光喪失。圖6D示出的圖證明了圖6B中的完整三階段轉(zhuǎn)錄級聯(lián)表現(xiàn)出所有三種熒光蛋白的表達。將級聯(lián)中的三個階段的任意一個移除會導致該具體階段及依賴性的下游階段的熒光喪失。圖7A示出了經(jīng)改造構(gòu)建體，其通過從mKate2內(nèi)的內(nèi)含子表達miRNA以及從“三鏈體/Csy4”構(gòu)造(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)表達gRNA1，編碼miRNA以及基于CRISPR-TF的調(diào)控兩者。在存在taCas9但不存在Csy4的情況下，該線路不激活下游的gRNA1特異性P1-EYFP構(gòu)建體并且確實阻抑下游的ECFP轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本具有8個(8x)miRNA結(jié)合位點，所述位點的側(cè)翼為Csy4識別位點(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS)。在taCas9和Csy4兩者均存在的情況下，該線路通過激活gRNA1的產(chǎn)生及隨后的EYFP表達，以及通過將ECFP轉(zhuǎn)錄本從8xmiRNA結(jié)合位點分離而被重接，從而消除了miRNA對ECFP表達的抑制。圖7B示出的圖證明了Csy4表達可通過重接線路互連改變圖7A中所述線路的行為。圖7C示出了線路基序圖(circuitmotifdiagram)，其舉例說明了Csy4催化的重接。圖7D示出了通過編碼位于輸入轉(zhuǎn)錄本(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)3’末端的4xmiRNA結(jié)合位點而被并入描述于圖7A中線路的網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)的自我調(diào)控的反饋環(huán)路。該負反饋在Csy4不存在的情況下抑制mKate2的表達。然而，在Csy4存在下，所述4xmiRNA結(jié)合位點被從mKate2mRNA中分離，從而導致mKate2的表達。圖7E示出的圖證明了Csy4的表達可通過重接線路互連改變圖7D中線路的行為。與圖7A中的線路相反，mKate2在Csy4不存在的情況下被抑制，但當Csy4存在的情況下由于基于miRNA的自我調(diào)控負反饋的消除，mKate2大量表達。圖7F示出了線路基序圖，其舉例說明了Csy4催化的重接。以所有測試方案中的各自最大熒光水平歸一化圖7B和圖7E中mKate2、EYFP以及ECFP每一個的水平。重復(fù)圖7B和圖7E中第3列和第4列的對照，而將圖7A和圖7D中的2個線路在相同的實驗中用相同的對照進行測試。圖8A示出了對應(yīng)于“三鏈體/csy4”構(gòu)造以從RNAPII轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生功能gRNA的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)。圖8B示出了用于從RNAPII轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生功能gRNA的“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)造?？s寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。三鏈體：構(gòu)建體#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28，1μg)。共有、snoRNA2以及HSV1：分別為構(gòu)建體#8-構(gòu)建體#10(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]“內(nèi)含子類型”-mKEX2，對應(yīng)的內(nèi)含子序列在gRNA和Csy4識別序列(“28”)側(cè)翼)。將這些質(zhì)粒以1μg轉(zhuǎn)染。此外，指定了每個樣品中轉(zhuǎn)染的表達Csy4質(zhì)粒(構(gòu)建體#2)的量。其他轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)和#5(P1-EYFP，1μg)。圖9示出了對應(yīng)于圖1B的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)，以分析對于CMVp-mK-Tr-28-g1-28構(gòu)造，Csy4和taCas9的多種組合如何影響mKate2基因的表達?？s寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)。所有樣品都含有構(gòu)建體#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28，1μg)。將構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)與構(gòu)建體#2(Csy4，100ng)按照指定方式應(yīng)用。圖10示出的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)提供了多種對照，以證明通過gRNA3(上方兩圖)的P1啟動子的最小非特異性激活以及具有內(nèi)含子gRNA1而沒有Csy4結(jié)合位點(下圖)的啟動子P1的最小EYFP激活?？s寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。上方兩圖每個樣品中轉(zhuǎn)染的Csy4DNA量如圖中所指定。下圖(CMVp-mKEX1-[g1]cons-mKEX2)在Csy4不存在的情況下測試。該實驗中其他轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)和構(gòu)建體#5(P1-EYFP，1μg)。圖11示出了對應(yīng)于圖2E和圖2F的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)，以分析在內(nèi)含子內(nèi)gRNA側(cè)翼的Csy4識別位點的多種構(gòu)造如何影響CRISPR-TF活性?？s寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comb-FITC-A(EYFP)。“28-gRNA-28”為HSV1內(nèi)含子gRNA，其側(cè)翼為2個Csy4識別位點(構(gòu)建體#4，CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2)；“28-gRNA”為HSV1內(nèi)含子gRNA，其僅有5’Csy4識別位點(構(gòu)建體#10，CMVp-mKEX1-[28-g1]HSV1-mKEX2)；“gRNA-28”為HSV1內(nèi)含子gRNA，其僅有3’Csy4識別位點(構(gòu)建體#11，CMVp-mKEX1-[g1-28]HSV1-mKEX2)。此外，在每個樣品中轉(zhuǎn)染的表達Csy4質(zhì)粒的量如每個圖中所指定。該實驗中其他轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)和構(gòu)建體#5(P1-EYFP，1μg)。圖12示出了對應(yīng)于圖3的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)?？s寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。“三鏈體-Csy4”機制含有構(gòu)建體#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28)。該實驗中其他轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)；構(gòu)建體#5(P1-EYFP，1μg)；構(gòu)建體#2(Csy4，指定的濃度)。“核酶設(shè)計1”包含構(gòu)建體#13(CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV)。該實驗中其他轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)；構(gòu)建體#5(P1-EYFP，1μg)?！昂嗣冈O(shè)計2”包含構(gòu)建體#14(CMVp-mK-HH-g1-HD)。該實驗中其他轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)；構(gòu)建體#5(P1-EYFP，1μg)?！昂嗣冈O(shè)計3”包含構(gòu)建體#15(CMVp-HH-g1-HDV)。該實驗中其他轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)；構(gòu)建體#5(P1-EYFP，1μg)?！癠6p-gRNA1”包含構(gòu)建體#7(U6p-g1，1μg)。該實驗中其他轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)。圖13示出了對應(yīng)于圖4C的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)?？s寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-PacificBlue-A(ECFP)?！皺C制1”指“內(nèi)含子-三鏈體”構(gòu)造，并且含有構(gòu)建體#16(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2-Tr-28-g2-28，1μg)；構(gòu)建體#5(P1-EYFP，1μg)；構(gòu)建體#6(P2-ECFP，1μg)；以及構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)。“機制2”指“串聯(lián)-三鏈體”構(gòu)造，并且含有構(gòu)建體#17(CMVp-mK-Tr-28-g1-28-g2-28，1μg)；構(gòu)建體#5(P1-EYFP，1μg)和構(gòu)建體#6(P2-ECFP，1μg)；以及構(gòu)建體#1(taCas9，1μg)。此外，在每個樣品中轉(zhuǎn)染的表達Csy4的質(zhì)粒DNA(構(gòu)建體#2)的量如上文每個圖中所指定。圖14示出了對應(yīng)于圖6C和圖6D的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-PacificBlue-A(ECFP)。所有樣品均用列于每個圖表名稱中的構(gòu)建體(每種1μg，表2)，以及200ng的表達Csy4的質(zhì)粒(構(gòu)建體#2)轉(zhuǎn)染。圖15示出了對應(yīng)于圖7B和圖7E的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)?？s寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-PacificBlue-A(ECFP)。“機制1”含有以下構(gòu)建體：構(gòu)建體#20(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)；構(gòu)建體#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)；以及構(gòu)建體#5(P1-EYFP)。這些質(zhì)粒以每種1μg的濃度轉(zhuǎn)染。該機制對應(yīng)于圖7A中的線路圖?！皺C制2”含有以下構(gòu)建體：構(gòu)建體#21(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)；構(gòu)建體#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)；以及構(gòu)建體#5(P1-EYFP)。這些質(zhì)粒以每種1μg的濃度轉(zhuǎn)染。該機制對應(yīng)于圖7D中的線路圖。“對照”樣品僅含有構(gòu)建體#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)以及構(gòu)建體#5(P1-EYFP)。這些質(zhì)粒以每種1μg的濃度轉(zhuǎn)染。此外，在每個樣品中轉(zhuǎn)染的表達Csy4的質(zhì)粒(構(gòu)建體#2)的量如上文每個圖中所指定。發(fā)明詳述建立復(fù)雜、穩(wěn)健并可擴展的對人工部分與天然細胞過程之間的限定的互連進行操作的合成基因網(wǎng)絡(luò)的能力，是改造生物系統(tǒng)的核心。該能力可以使例如用于重接、微擾以及探知自然生物網(wǎng)絡(luò)的新策略成為可能。大量可調(diào)、正交、緊湊以及可多重的基因調(diào)控機制對于這些應(yīng)用的實施具有根本的重要性。盡管在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和合成生物學領(lǐng)域中有許多進展，但在本公開內(nèi)容之前的可用工具無法滿足一種或更多種上述標準。轉(zhuǎn)錄調(diào)控利用與目的預(yù)定DNA序列相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)(例如，具有靶向DNA的Cas蛋白)已經(jīng)適用于獲得可編程的DNA結(jié)合而不需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)改造(Sander和Joung，2014)。在這些系統(tǒng)中，所述CasDNA結(jié)合蛋白的序列特異性通過導引RNA(gRNA)確定，其具有與靶DNA位點的堿基配對互補性。這使得能夠簡單且高度靈活地編程Cas結(jié)合。在本公開內(nèi)容以前，在人細胞中用于基因調(diào)控的gRNA僅從RNA聚合酶III(RNAPIII)啟動子表達。這對于將CRISPR/Cas調(diào)控與內(nèi)源基因網(wǎng)絡(luò)整合的情況是限制，因為RNAPIII啟動子僅包含小部分的細胞啟動子，而且大部分為組成型活性，因此阻止了大部分細胞啟動子和信號與基于CRISPR-TF的網(wǎng)絡(luò)的連接。此外，通常需要多個gRNA以有效地激活內(nèi)源啟動子，但在本公開內(nèi)容之前，沒有可用的從單個轉(zhuǎn)錄本多重產(chǎn)生gRNA以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的策略。因此，需要多個gRNA表達構(gòu)建體以微擾天然轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，從而限制了可擴展性。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外，天然線路通過基于RNA的翻譯和翻譯后調(diào)控，以獲得復(fù)雜的行為。本文所提供的將RNA與轉(zhuǎn)錄改造相結(jié)合的合成基因調(diào)控策略可用于天然系統(tǒng)的建?；蛉斯ば袨榈膶嵤?。因此，本文在多個方面中提供了整合基于哺乳動物與細菌RNA的調(diào)控機制的方法和組合物，以例如產(chǎn)生復(fù)雜的合成線路拓撲結(jié)構(gòu)以及調(diào)控內(nèi)源啟動子?？梢允褂枚鄠€哺乳動物RNA處理策略，包括3’RNA三螺旋(稱為三鏈體)、內(nèi)含子與核酶，連同哺乳動物miRNA調(diào)控、來源于細菌的CRISPR-TF以及來自于銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)的Csy4RNA修飾蛋白。這些構(gòu)建體可用于例如在人細胞中從RNAP-II調(diào)控的mRNA產(chǎn)生功能gRNA，同時使伴隨的mRNA翻譯可調(diào)。如本文所示，功能gRNA用于靶向合成的以及內(nèi)源啟動子兩者，以通過CRISPR-TF激活。此外，開發(fā)了用于多重gRNA產(chǎn)生的策略，從而使得能夠緊湊地編碼單個轉(zhuǎn)錄本中的蛋白質(zhì)和多個gRNA。為了證明這些調(diào)控部分的用途，實施了可用于復(fù)雜的合成基因線路構(gòu)建的多階段轉(zhuǎn)錄級聯(lián)。在一些實施方案中，通過基于Csy4的RNA處理，本文還組合了基于哺乳動物miRNA的調(diào)控以及CRISPR-TF，以產(chǎn)生多組件的遺傳線路，其具有反饋環(huán)、互連和可重接的行為。因此，通過使用合成轉(zhuǎn)錄和RNA依賴性的機制，本公開內(nèi)容的平臺可用于例如構(gòu)建、同步以及轉(zhuǎn)換人工和內(nèi)源這兩種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在一些實施方案中，基于CRISPR-TF的基因調(diào)控系統(tǒng)與哺乳動物RNA調(diào)控構(gòu)造的整合使得用于合成生物學以及基礎(chǔ)生物學應(yīng)用的可擴展基因調(diào)控系統(tǒng)成為可能。本公開內(nèi)容的一些方面涉及經(jīng)改造構(gòu)建體以及經(jīng)改造核酸?！敖?jīng)改造構(gòu)建體”為用于描述經(jīng)改造具有多個遺傳元件的核酸的術(shù)語，所述遺傳元件包括例如啟動子及多種核苷酸序列(例如，編碼蛋白質(zhì)和/或RNA干擾分子的核苷酸序列，如本文所提供的)。核酸是至少兩個共價連接在一起的核苷酸，并且在一些情況下，其可以含有磷酸二酯鍵(例如磷酸二酯“骨架”)。經(jīng)改造核酸是不天然存在的核酸。然而，應(yīng)該理解的是，盡管經(jīng)改造核酸整體上不是天然存在的，其可以包括天然存在的核苷酸序列。在一些實施方案中，經(jīng)改造核酸包含來自于不同生物體的核苷酸序列(例如，來自于不同物種)。例如，在一些實施方案中，經(jīng)改造核酸包括鼠核苷酸序列、細菌核苷酸序列、人核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。經(jīng)改造核酸包括重組核酸以及合成核酸。重組核酸是通過將核酸(例如，分離的核酸、合成核酸或其組合)連接構(gòu)建的分子，并且在一些實施方案中，其可以在活細胞中復(fù)制。合成核酸是擴增得到的或通過化學方法或其他手段合成的分子。合成核酸包括以化學方法修飾的或以其他方法修飾的，但可以與天然存在的核酸分子堿基配對的那些。重組和合成核酸也包括前述任一復(fù)制產(chǎn)生的那些分子。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的核酸被認為是核酸類似物，其可以含有至少一部分其他骨架，所述骨架包含例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亞磷酰胺鍵和/或肽核酸。具體而言，核酸可以為單鏈(single-stranded，ss)或雙鏈(double-stranded，ds)，或可以含有單鏈和雙鏈序列兩種部分。在一些實施方案中，核酸可含有三鏈序列的部分。核酸可以是DNA(基因組和/或cDNA兩者)，RNA或雜合體，其中核酸含有任何脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸的組合(例如，人工的或天然的)，以及任何堿基的組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶以及異鳥嘌呤。本公開內(nèi)容的經(jīng)改造構(gòu)建體(包括經(jīng)改造核酸)包含一個或更多個遺傳元件。“遺傳元件”指在核酸表達中具有作用的特定核苷酸序列(例如啟動子、增強子、終止子)或編碼經(jīng)改造核酸之不連續(xù)產(chǎn)物的特定核苷酸序列(例如編碼導引RNA、蛋白質(zhì)和/或RNA干擾分子的核苷酸序列)。本公開內(nèi)容遺傳元件的實例包括但不限于啟動子以及編碼蛋白質(zhì)、導引RNA、Csy4結(jié)合位點、三螺旋結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子和內(nèi)含子序列(例如，供體位點、接受體位點(acceptorsite)和/或分支位點)、外顯子以核酶的核苷酸序列。本公開內(nèi)容的經(jīng)改造核酸的遺傳元件的位置可相對于其他遺傳元件沿著5’至3’方向的編碼(有義)鏈限定。例如，圖1A示出了與編碼mKate2蛋白的核苷酸序列有效相連的CMV啟動子，該序列位于編碼三螺旋結(jié)構(gòu)(或三鏈體)的核苷酸序列的上游，該編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的核苷酸序列位于編碼側(cè)翼為Csy4結(jié)合位點的導引RNA的核苷酸序列的上游?；蛘?，圖1A所示的經(jīng)改造核酸可描述為具有編碼側(cè)翼為Csy4結(jié)合位點的導引RNA的核苷酸序列，該序列位于編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的下游，該編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的核苷酸序列位于編碼mKate2蛋白的核苷酸序列的下游，該編碼mKate2蛋白的核苷酸序列與上游的啟動子有效相連。因此，如果第一遺傳元件位于第二遺傳元件的3’，則認為所述第一遺傳元件位于所述第二遺傳元件的下游。相似地，如果第二遺傳元件位于第一遺傳元件的5’，則認為所述第二遺傳元件位于所述第一遺傳元件的上游。如果兩個遺傳元件彼此接近(例如，沒有其他遺傳元件位于兩者之間)，則認為一個遺傳元件是另一個遺傳元件的“緊接的下游”或“緊接的上游”。例如在圖1A所示的構(gòu)造中，編碼側(cè)翼為Csy4結(jié)合位點的導引RNA的核苷酸序列位于編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的緊接的下游。本公開內(nèi)容的一些方面涉及經(jīng)改造核酸，其包含(例如1個或更多個，至少1個)核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼(例如至少1個，包括至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個，或更多個)導引RNA(gRNA)。gRNA是CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成部分。多種細菌和古細菌使用CRISPR/Cas系統(tǒng)來介導針對病毒和其他外來核酸的防御。CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成部分協(xié)調(diào)選擇性地切割核酸。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)包括靶向DNA的Cas蛋白，而III型CRISPR/Cas系統(tǒng)包括靶向RNA的Cas蛋白。CasDNA結(jié)合蛋白的序列特異性由gRNA確定，其具有與靶DNA位點的堿基配對互補性。因此，Cas蛋白由gRNA“導引”至靶DNA位點。在一些實施方案中，gRNA的堿基配對互補性使得能夠簡單且靈活地編程Cas結(jié)合。堿基配對互補性指腺嘌呤與胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA)之間，以及鳥嘌呤與胞嘧啶之間的相區(qū)別的相互作用。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的導引RNA的長度為10至500個核苷酸。在一些實施方案中，gRNA的長度為10至20個核苷酸、10至30個核苷酸、10至40個核苷酸、10至50個核苷酸、10至60個核苷酸、10至70個核苷酸、10至80個核苷酸、10至90個核苷酸、10至100個核苷酸、20至30個核苷酸、20至40個核苷酸、20至50個核苷酸、20至60個核苷酸、20至70個核苷酸、20至80個核苷酸、20至90個核苷酸、20至100個核苷酸、30至40個核苷酸、30至50個核苷酸、30至60個核苷酸、30至70個核苷酸、30至80個核苷酸、30至90個核苷酸、30至100個核苷酸、40至50個核苷酸、40至60個核苷酸、40至70個核苷酸、40至80個核苷酸、40至90個核苷酸、40至100個核苷酸、50至60個核苷酸、50至70個核苷酸、50至80個核苷酸、50至90個核苷酸或50至100個核苷酸。在一些實施方案中，gRNA的長度為10至200個核苷酸、10至250個核苷酸、10至300個核苷酸、10至350個核苷酸、10至400個核苷酸或10至450個核苷酸。在一些實施方案中，gRNA的長度為超過500個核苷酸。在一些實施方案中，gRNA的長度為10、15、20、15、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或更多個核苷酸。出人意料的是，在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的方法和組合物允許從單個轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生多個導引RNA(gRNA)。然而，應(yīng)理解，可在單細胞中從多個轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生多個gRNA。本文提供的所產(chǎn)生的gRNA可具有相同的核苷酸序列或可具有不同的核苷酸序列。因此，gRNA可靶向并結(jié)合相同的靶位點或不同的靶位點(例如，在特定啟動子內(nèi)的區(qū)域)。例如，一些經(jīng)改造核酸包含編碼第一gRNA的核苷酸序列以及編碼第二gRNA的核苷酸序列(或編碼至少2個gRNA的核苷酸序列)。所述第一gRNA可具有與第二gRNA相同的RNA序列，并且，因此這2個gRNA可靶向相同的位點?；蛘撸龅谝籫RNA可具有與第二gRNA不同的RNA序列，并且，因此這2個gRNA可靶向不同的位點(例如，在相同的啟動子內(nèi)或在不同的啟動子內(nèi))。如圖4A中所示例，“gRNA1”靶向與增強的黃色熒光蛋白(EYFP)有效連接的啟動子(P1)，而“gRNA2”靶向與增強的青色熒光蛋白(ECFP)有效連接的啟動子(2)。如果第一核苷酸序列插入第二核苷酸序列的2個核苷酸之間，或者如果該核苷酸序列替換了第二核苷酸序列的一段連續(xù)的核苷酸，則認為所述第一核苷酸序列在所述第二核苷酸序列“內(nèi)”。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)內(nèi)的gRNA或RNA干擾分子。例如在此構(gòu)造中，編碼gRNA的核苷酸序列位于目的蛋白質(zhì)的兩個相鄰?fù)怙@子之間，以使得當所編碼的gRNA被移除時(例如，如果該gRNA側(cè)翼為同源內(nèi)含子剪接位點，則通過RNA剪接)，該蛋白質(zhì)被翻譯。在一些實施方案中，如上文所討論的導引RNA“導引”Cas蛋白至核酸。Cas蛋白是切割核酸的核酸酶。在一些實施方案中，Cas蛋白(如Cas9蛋白)的核酸酶活性可被用于原核和真核細胞中的精確且有效的基因組編輯。本文還考慮到了突變的Cas蛋白。在一些實施方案中，突變的Cas蛋白缺乏核酸酶活性(例如，dCas9)。在一些實施方案中，對缺乏核酸酶活性的突變Cas蛋白進行修飾，以使得能夠在哺乳動物細胞中進行異位和天然啟動子的可編程轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以產(chǎn)生基于CRISPR的轉(zhuǎn)錄因子(CRISPR-TF)(Cheng等，2013；Farzadfard等，2013；Gilbert等，2013；Maeder等，2013a；Mali等，2013a；Perez-Pinera等，2013a)。例如，將激活結(jié)構(gòu)域(例如，VP16、VP64或p65)與Cas蛋白融合使得Cas具有轉(zhuǎn)錄活性(也稱為“taCas”蛋白)。轉(zhuǎn)錄激活蛋白募集RNA聚合酶II機器以及染色質(zhì)修飾活性至啟動子。因此，在一些實施方案中，根據(jù)本公開內(nèi)容使用了“具有轉(zhuǎn)錄活性的”Cas(taCas)蛋白，其缺乏核酸酶活性。在一些實施方案中，具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白為具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9(taCas9)蛋白。本文考慮了其他具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的導引RNA的側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點。核糖核酸酶(縮寫為RNA酶)是催化RNA水解的核酸酶。核糖核酸酶可以為核糖核酸內(nèi)切酶或核糖核酸外切酶。核糖核酸內(nèi)切酶切割單鏈或雙鏈RNA。核糖核酸外切酶通過從RNA的5’末端或3’末端移除末端核苷酸降解RNA。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的導引RNA的側(cè)翼為Csy核糖核酸酶識別位點(例如Csy4核糖核酸酶識別位點)。Csy4是核糖核酸內(nèi)切酶，其識別特定的RNA序列、切割該RNA并保持與上游片段的結(jié)合。在一些實施方案中，Csy核糖核酸酶(例如Csy4核糖核酸酶)被用于從經(jīng)改造核酸轉(zhuǎn)錄本釋放導引RNA。因此，在一些實施方案中，用包含編碼側(cè)翼為Csy4或其他Cas6核糖核酸酶識別位點之導引RNA的核苷酸序列的經(jīng)改造構(gòu)建體，以及編碼Csy4或其他Cas6核糖核酸酶的經(jīng)改造核酸對細胞共轉(zhuǎn)染。或者，或另外地，細胞可穩(wěn)定表達，或經(jīng)修飾而穩(wěn)定表達Csy4或其他Cas6核糖核酸酶。在一些實施方案中，Csy核糖核酸酶(例如Csy4核糖核酸酶)來自于銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)或硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)。本文考慮了其他核糖核酸酶及核糖核酸酶識別位點(參見例如，Mojica，F(xiàn).J.M.等，CRISPR-CasSystems，RNA-mediatedAdaptiveImmunityinBacteriaandArchaea，Barrangou，Rodolphe，vanderOost，John(編輯)，2013，ISBN978-3-642-34657-6，其涉及核糖核酸酶/識別位點的主題通過引用并入本文)。在一些實施方案中，核糖核酸酶識別位點(例如Csy4核糖核酸酶識別位點)的長度為10至50個核苷酸。例如，Csy核糖核酸酶識別位點的長度可以為10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30個核苷酸。在一些實施方案中，Csy核糖核酸酶識別位點的長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一些實施方案中，Csy核糖核酸酶識別位點(例如Csy4核糖核酸酶識別位點)的長度為28個核苷酸。在一些實施方案中，編碼核糖核酸酶識別位點的核苷酸序列包含SEQIDNO：26。本文還考慮了Csy同源物(參見例如，Mojica，F(xiàn).J.M.等，CRISPR-CasSystems，RNA-mediatedAdaptiveImmunityinBacteriaandArchaea，Barrangou，Rodolphe，vanderOost，John(編輯)，2013，ISBN978-3-642-34657-6，其涉及核糖核酸酶/識別位點的主題通過引用并入本文)。當?shù)谝贿z傳元件位于其他遺傳元件之間并與其緊鄰時，則稱所述第一遺傳元件的“側(cè)翼”為其他遺傳元件。例如，圖1A示出的示意圖，其為編碼側(cè)翼為Csy4結(jié)合位點(“28bp”)之“gRNA1”的核苷酸序列。相似的，圖2A中的示意圖代表編碼側(cè)翼為Csy4結(jié)合位點(“28bp”)之“gRNA1”的核苷酸序列，其側(cè)翼還有編碼同源內(nèi)含子剪接位點的核苷酸序列，其側(cè)翼還有編碼mKate2蛋白外顯子的核苷酸序列。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體含有多個串聯(lián)的gRNA，例如圖5A所示。這樣的構(gòu)建體本文可描述為具有編碼至少2個gRNA的核苷酸序列，每個gRNA的側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點。應(yīng)當理解的是該構(gòu)造意在包含多個串聯(lián)的gRNA，每個gRNA的側(cè)翼為單個核糖核酸酶識別位點(ribonucleaserecognitionsite，RRS)，如圖5A所示(在圖中RSS指代為“28bp”)；還包含多個串聯(lián)的gRNA，每個gRNA的側(cè)翼為2個或更多個核糖核酸酶識別位點。例如，在經(jīng)改造構(gòu)建體中，可以遺傳元件的順序可以如下：RRS1-gRNA1-RRS2-gRNA2-RRS3-gRNA-RRS4，其中單個核糖核酸酶識別位點將1個gRNA與相鄰的gRNA分開；或者RRS1-gRNA1-RRS2-RRS3-gRNA2-RRS4-RRS5-gRNA-RRS6，其中2個核糖核酸酶識別位點將1個gRNA與相鄰的gRNA分開。所述RRS可以是相同或不同的。即，在一些實施方案中，可以使用不同類型的核糖核酸酶以從經(jīng)改造構(gòu)建體釋放1個或更多個gRNA。本公開內(nèi)容的一些方面涉及經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含3’RNA穩(wěn)定序列(stabilizingsequence)，例如形成三螺旋結(jié)構(gòu)(或“三鏈體”)的RNA序列。3’RNA穩(wěn)定序列為添加到編碼產(chǎn)物之核苷酸序列3’末端以補充poly(A)尾缺乏的核苷酸序列。因此，在一些實施方案中，如那些形成三螺旋結(jié)構(gòu)的3’RNA穩(wěn)定序列使得能夠?qū)θ狈oly(A)尾的mRNA進行有效翻譯。三螺旋結(jié)構(gòu)是例如通過富含腺嘌呤和尿苷的基序所形成的的二級或三級RNA結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，3’RNA穩(wěn)定序列來自于核酸的3’非翻譯區(qū)(untranslatedregion，UTR)。在一些實施方案中，三螺旋結(jié)構(gòu)促進RNA穩(wěn)定性和/或翻譯。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的三螺旋結(jié)構(gòu)由來自于MALAT1(轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1，metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1)基因座或MENβ(多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成β，multipleendocrineneoplasia-β)基因座的3’末端的核苷酸片段編碼。在一些實施方案中，三螺旋結(jié)構(gòu)由來自于MALAT1基因座3’末端或MENβ基因座3’末端的核苷酸片段編碼(參見例如，Wilusz等，2012，通過引用并入本文；還參見，BrownJA等ProcNatlAcadSciUSA.201211月20；109(47)，通過引用并入本文)。在一些實施方案中，三螺旋結(jié)構(gòu)由來自于MALAT1基因座3’末端的110個核苷酸序列(例如，110個連續(xù)的核苷酸序列)編碼。在一些實施方案中，三螺旋結(jié)構(gòu)由包含SEQIDNO：1或由其組成的核酸編碼。本文考慮了其他3’RNA穩(wěn)定序列，包括編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的那些(參見例如，WiluszJ.E.等RNA2010.16：259-266，通過引用并入本文)。本公開內(nèi)容的一些方面涉及經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含編碼側(cè)翼為核糖核酸酶(例如，Csy4)識別位點的gRNA的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的側(cè)翼為編碼同源內(nèi)含子剪接位點的核苷酸序列。在本領(lǐng)域中，術(shù)語“內(nèi)含子”經(jīng)常指基因中的DNA序列以及在RNA轉(zhuǎn)錄本中的對應(yīng)序列兩者。本文為了清楚和一致，應(yīng)當理解的是，在經(jīng)改造構(gòu)建體的情景中，“編碼內(nèi)含子的核苷酸序列”指DNA序列，而術(shù)語“內(nèi)含子”指RNA序列。內(nèi)含子是非編碼RNA序列，其通過RNA剪接而被移除。RNA剪接是這樣的過程，通過其對前信使RNA進行修飾以移除內(nèi)含子并將外顯子(例如，核酸的編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域)連到一起，以形成成熟的信使RNA(mRNA)分子。“同源內(nèi)含子剪接位點”包括供體位點(例如，在內(nèi)含子的5’末端)、分支位點(例如，接近內(nèi)含子的3’末端)以及接受體位點(例如，在內(nèi)含子的3’末端)，以使得在RNA剪接期間，移除任何間插序列(例如在5’剪接位點與3’剪接位點之間的序列)。例如，圖2A所示的經(jīng)改造構(gòu)建體包含側(cè)翼為內(nèi)含子剪接位點的間插遺傳元件(例如，編碼側(cè)翼為Csy4結(jié)合位點之gRNA的核苷酸序列)。在從圖2A的經(jīng)改造構(gòu)建體產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本的過程中，所述間插遺傳元件被移除。在一些實施方案中，5’剪接供體位點在更大的、較不高度保守的區(qū)域內(nèi)包含幾乎不變的序列GU。在一些實施方案中，3’剪接接受體位點包含幾乎不變的AG序列。在一些實施方案中，在所述AG的上游有高嘧啶(例如，C和U)的區(qū)域，稱為多聚嘧啶串(polypyrimidinetract)。在一些實施方案中，在多聚嘧啶串上游是分支點(branchpoint)，其可以包含例如腺嘌呤核苷酸。在一些實施方案中，內(nèi)含子的共有序列(在IUPAC核酸標記法中)為：M-A-G-[切割]-G-U-R-A-G-U(供體位點)...內(nèi)含子序列...C-U-R-[A]-Y(分支序列，例如在接受體位點上游的20至50個核苷酸)...Y-富含-N-C-A-G-[切割]-G(接受體位點)。在一些實施方案中，本文考慮了產(chǎn)生相對穩(wěn)定的(例如“長壽命的”)內(nèi)含子的內(nèi)含子序列。該序列的實例包括但不限于HSV-1潛伏相關(guān)內(nèi)含子，其形成穩(wěn)定的環(huán)狀內(nèi)含子(Block和Hill，1997)，以及sno-IncRNA2內(nèi)含子(Yin等，2012)。所述sno-IncRNA2內(nèi)含子(或“sno-RNA2內(nèi)含子”)在snoRNA機器的兩端上處理，這防止其降解并導致側(cè)翼為snoRNA序列的IncRNA的累積，其缺乏5’帽和3’poly(A)尾。本文還考慮了其他對內(nèi)含子序列賦予結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的序列。本公開內(nèi)容的一些方面涉及經(jīng)改造構(gòu)建體，其包含編碼側(cè)翼為核酶的gRNA的核苷酸序列。核酶是能夠催化特異性生化反應(yīng)的RNA分子，與蛋白質(zhì)酶的作用相似。順式作用核酶通常為自體形成并且能夠自體切割。順式作用核酶可介導從RNApolII啟動子的功能gRNA表達。相比而言，反式作用核酶不進行自體切割。自體切割指分子內(nèi)的催化過程，其中含有核酶的RNA分子被其自身切割。根據(jù)本公開內(nèi)容所使用的順式作用核酶的實例包括但不限于錘頭狀(HH)核酶(參見例如，Pley等，1994，通過引用并入本文)以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶(參見例如，F(xiàn)erre-D’Amare等，1998，通過引用并入本文)。根據(jù)本公開內(nèi)容所使用的反式作用核酶的實例包括但不限于發(fā)現(xiàn)于煙草環(huán)斑病毒(tobaccoringspotvirus，sTRSV)、菊苣黃色斑駁病毒(chicoryyellowmottlevirus，sCYMV)和南芥菜花葉病毒(arabismosaicvirus，sARMV)之衛(wèi)星RNA中的發(fā)夾核酶的天然及人工形式。例如，圖3A至圖3C示出的示意圖為編碼側(cè)翼為核酶之“gRNA1”的核苷酸序列。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體含有多個串聯(lián)的gRNA，每個的側(cè)翼為編碼核酶的核苷酸序列。這樣的構(gòu)建體本文可描述為具有編碼至少2個gRNA的核苷酸序列，每個gRNA的側(cè)翼為核酶。應(yīng)當理解的是該構(gòu)造意在包含多個串聯(lián)的gRNA，每個gRNA的側(cè)翼為單個核酶(Ribo)；還包含多個串聯(lián)的gRNA，每個gRNA的側(cè)翼為2個或更多個核酶。例如，在經(jīng)改造構(gòu)建體中，遺傳元件的順序可以如下：Ribo1-gRNA1-Ribo2-gRNA2-Ribo3-gRNA-Ribo4，其中單個核酶將1個gRNA與相鄰的gRNA分開；或者Ribo1-gRNA1-Ribo2-Ribo3-gRNA2-Ribo4-Ribo5-gRNA-Ribo6，其中2個核酶將1個gRNA與相鄰的gRNA分開。所述核酶可以是相同或不同的。即，在一些實施方案中，可以使用不同類型的核酶以從經(jīng)改造構(gòu)建體釋放1個或更多個gRNA。本公開內(nèi)容的一些方面涉及編碼目的蛋白質(zhì)的核酸。目的蛋白質(zhì)可以是任何蛋白質(zhì)。目的蛋白質(zhì)的實例包括但不限于涉及細胞信號傳導(例如，受體/配體結(jié)合)及信號轉(zhuǎn)導的那些。例如，目的蛋白質(zhì)可以為纖維蛋白或球蛋白。纖維蛋白的實例包括但不限于細胞骨架蛋白和胞外基質(zhì)蛋白。球蛋白的實例包括但不限于血漿蛋白(例如凝血因子、急性期蛋白)、血紅素蛋白、細胞粘附蛋白、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白(例如，離子通道蛋白、同向轉(zhuǎn)運蛋白、逆向轉(zhuǎn)運蛋白)、激素和生長因子、受體(例如，跨膜受體、胞內(nèi)受體)、DNA結(jié)合蛋白(例如，轉(zhuǎn)錄因子或其他涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白質(zhì))、免疫系統(tǒng)蛋白、營養(yǎng)物儲存/轉(zhuǎn)運蛋白、伴侶蛋白，以及酶?？紤]了其他蛋白質(zhì)，并可以根據(jù)本公開內(nèi)容使用。本公開內(nèi)容的一些方面考慮了將基于CRISPR的機制與哺乳動物RNA干擾機制進行整合，以例如實施更復(fù)雜的線路拓撲結(jié)構(gòu)。如非限制性實施例8所示，將微小RNA調(diào)控與CRISPR-TF和Csy4合并，以通過移除同源miRNA結(jié)合位點破壞miRNA對靶RNA的抑制。RNA干擾通常指這樣的生物學過程，其中RNA分子通常通過對特定mRNA分子的破壞抑制基因表達。這樣的RNA分子的實例包括微小RNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNA)。miRNA是短的非編碼單鏈RNA分子。本公開內(nèi)容的miRNA可為天然存在的或合成的(例如，人工的)。miRNA通常通過與在所靶向的mRNA3’UTR(非翻譯區(qū))內(nèi)發(fā)現(xiàn)的靶位點結(jié)合來誘導基因沉默。該相互作用通過抑制蛋白質(zhì)的合成和/或通過啟動mRNA的降解而阻止蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。mRNA上的大多數(shù)靶位點與其對應(yīng)的微小RNA僅具有部分堿基互補性，因此，單獨的微小RNA可靶向100個不同的mRNA，或更多個。此外，單獨的mRNA可含有不同miRNA的多個結(jié)合位點，從而導致復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在一些實施方案中，miRNA的長度為10至50個核苷酸。例如，miRNA的長度可以為10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30個核苷酸。在一些實施方案中，miRNA的長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一些實施方案中，miRNA的長度為22個核苷酸。siRNA是短的非編碼單鏈RNA分子。本公開內(nèi)容的siRNA可為天然存在的或合成的(例如，人工的)。siRNA與同源mRNA的結(jié)合通常導致所述mRNA的降解。在一些實施方案中，siRNA的長度為10至50個核苷酸。例如，siRNA的長度可以為10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30個核苷酸。在一些實施方案中，siRNA的長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一些實施方案中，siRNA的長度為21至25個核苷酸。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的經(jīng)改造構(gòu)建體包含與核苷酸序列(例如，編碼目的蛋白質(zhì))有效相連的啟動子。“啟動子”是核酸的控制區(qū)，在該區(qū)核酸其余部分的轉(zhuǎn)錄起始和速率受到控制。啟動子也可含有亞區(qū)域，在該區(qū)域調(diào)控蛋白和分子可結(jié)合例如RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子。啟動子可以是組成型的、誘導型的、可激活的、可抑制的、組織特異性的、或其任意組合。啟動子驅(qū)動其調(diào)控的核酸序列的表達或轉(zhuǎn)錄。當啟動子位于其所調(diào)控的核苷酸序列相關(guān)的正確功能位置和方向以控制(“驅(qū)動”)該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達時，則認為所述啟動子被“有效連接”。可根據(jù)啟動子對RNA聚合酶(和/或σ因子)的親和性將其分類為強或弱；這與啟動子序列與聚合酶理想的共有序列相似的相近程度相關(guān)聯(lián)。啟動子的強度可依據(jù)在該啟動子上發(fā)生的轉(zhuǎn)錄起始是高頻還是低頻?？梢允褂镁哂胁煌瑥姸鹊牟煌瑔幼右詷?gòu)建具有不同基因/蛋白質(zhì)表達水平(例如，從弱啟動子起始的表達的水平低于從強啟動子起始的表達的水平)的核酸。啟動子可以是一個與基因或序列天然締合的啟動子，如可通過分離位于給定基因或序列編碼區(qū)段上游的5’非編碼序列獲得。這樣的啟動子可稱為“內(nèi)源的”。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的gRNA被設(shè)計為靶向內(nèi)源啟動子(例如，內(nèi)源人啟動子)。在一些實施方案中，核苷酸序列可位于重組或異源啟動子的控制下，其是指在其自然環(huán)境下通常不與該核苷酸序列締合的啟動子。這樣的啟動子可包括其他基因的啟動子；從任何其他原核細胞分離的啟動子；以及不“天然存在”的合成啟動子，例如包含不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和/或突變的不同元件的那些，其通過本領(lǐng)域已知的遺傳改造方法改變表達。除了通過合成產(chǎn)生啟動子的核苷酸序列之外，也可使用重組克隆和/或核酸擴增技術(shù)(包括聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR))產(chǎn)生序列。在一些實施方案中，從啟動子起始轉(zhuǎn)錄依賴于RNA聚合酶(也稱為DNA依賴性RNA聚合酶)的活性。RNA聚合酶是在RNA轉(zhuǎn)錄本的3’末端聚合核糖核苷酸的核苷酸基轉(zhuǎn)移酶。真核生物具有多種類型的細胞核RNA聚合酶，每一種負責不同RNA亞組的合成。所有RNA聚合酶均在結(jié)構(gòu)和機制上彼此相關(guān)以及與細菌RNA聚合酶相關(guān)。RNA聚合酶I合成前rRNA45S(在酵母中為35S)，其成熟為28S、18S和5.8SrRNA，它們將形成核糖體的主要RNA部分。RNA聚合酶II合成大多數(shù)snRNA和微小RNA以及mRNA的前體。RNA聚合酶III合成tRNA、rRNA5S以及其他發(fā)現(xiàn)于細胞核及胞質(zhì)中的小RNA。RNA聚合酶IV合成植物中的siRNA。RNA聚合酶V合成在植物中參與siRNA所引導的異染色質(zhì)形成的RNA。在一些實施方案中，本文考慮了RNApoiII和RNApolIII啟動子。通過RNA聚合酶II引導準確的轉(zhuǎn)錄起始的啟動子稱為RNApolII啟動子。根據(jù)本公開內(nèi)容所使用的RNApolII啟動子的實例包括但不限于人巨細胞病毒啟動子、人泛素啟動子、人組蛋白H2A1啟動子和人炎性趨化因子CXCL1啟動子。本文還考慮了其他RNApolII啟動子。通過RNA聚合酶III引導準確的轉(zhuǎn)錄起始的啟動子稱為RNApolIII啟動子。根據(jù)本公開內(nèi)容所使用的RNApolIII啟動子的實例包括但不限于U6啟動子、H1啟動子和轉(zhuǎn)移RNA的啟動子、5S核糖體RNA(rRNA)以及信號識別顆粒7SLRNA。在一些實施方案中，啟動子可以是誘導型啟動子。誘導型啟動子是這樣的啟動子，其特征在于，當其在誘導物或誘導劑存在、影響或接觸下，會起始或增強轉(zhuǎn)錄活性。誘導物或誘導劑可以是內(nèi)源的或通常為外源條件、化合物或蛋白質(zhì)，其以這樣的方式接觸經(jīng)改造核酸，從而在由該誘導型啟動子誘導轉(zhuǎn)錄活性中有活性。本公開內(nèi)容的經(jīng)改造核酸可使用標準分子生物學方法(參見，例如Green和Sambrook，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2012，ColdSpringHarborPress)產(chǎn)生。在一些實施方案中，使用GIBSONCloning(參見例如，Gibson，D.G.等NatureMethods，343-345，2009；和Gibson，D.G.等NatureMethods，901-903，2010，其各自通過引用并入本文)產(chǎn)生經(jīng)改造構(gòu)建體和/或經(jīng)改造核酸。GIBSON通常在單個試管反應(yīng)中使用3種酶促活性：5’核酸外切酶、DNA聚合酶的3’延伸活性和DNA連接酶活性。所述5’核酸外切酶活性回嚼(chewback)序列的5’末端，并暴露互補序列以用于退火。然后，聚合酶活性填補在退火區(qū)域上的空位中。然后DNA連接酶封住該缺口并將DNA片段共價連接到一起。鄰近片段的重疊序列遠遠長于用于GoldenGate組裝的那些，并且因此導致更高百分比的正確組裝。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體和/或經(jīng)改造核酸包在于載體內(nèi)。載體是用作人工地攜帶遺傳物質(zhì)(例如經(jīng)改造核酸)至另一個細胞中的載劑(vehicle)的核酸(例如DNA)，在該細胞中，例如，其可被復(fù)制和/或表達。在一些實施方案中，載體是附加型載體(episomalvector)(參見例如VanCraenenbroeckK.等Eur.J.Biochem.267，5665，2000，通過引用并入本文)。載體的一個非限制性實例是質(zhì)粒。質(zhì)粒是雙鏈的，通常為環(huán)狀的DNA序列，其能夠在宿主細胞中自動復(fù)制。質(zhì)粒載體通常含有復(fù)制起始及轉(zhuǎn)基因插入物，前者使所述質(zhì)粒得以在宿主中半獨立復(fù)制。質(zhì)?？删哂懈嗵卣?，包括例如，“多克隆位點”，其包括核苷酸突出端以用于核酸插入物的插入，以及在插入物任意一側(cè)的多個限制性酶共有位點。載體的另一個非限制性實例是病毒載體。本公開內(nèi)容的經(jīng)改造構(gòu)建體可表達于多種細胞類型中。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體表達于哺乳動物細胞中。例如，在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體表達于人細胞、靈長類動物細胞(例如vero細胞)、大鼠細胞(例如，GH3細胞、OC23細胞)或小鼠細胞(例如MC3T3細胞)中。有多種人細胞系，包括但不限于HEK細胞、HeLa細胞、來自于國家癌癥研究所的60個癌細胞系的癌細胞(NCI60)、DU145(前列腺癌)細胞、Lncap(前列腺癌)細胞、MCF-7(乳腺癌)細胞、MDA-MB-438(乳腺癌)細胞、PC3(前列腺癌)細胞、T47D(乳腺癌)細胞、THP-1(急性髓性白血病)細胞、U87(膠質(zhì)母細胞瘤)細胞、SHSY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞(克隆自骨髓瘤)以及Saos-2(骨癌)細胞。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體表達于人胚胎腎(humanembryonickidney，HEK)細胞(例如，HEK293或HEK293T細胞)中。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體表達于細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或其他類型細胞中。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體表達于干細胞(例如，人干細胞)，例如多能干細胞(例如，人多能干細胞，包括人誘導多能干細胞(humaninducedpluripotentstemcell，hiPSC))中?！案杉毎敝妇哂性谂囵B(yǎng)物中的不定期分裂能力以及產(chǎn)生特化細胞能力的細胞?！岸嗄芨杉毎敝高@樣類型的干細胞，其能夠分化為生物體的所有組織，但其單獨不能夠維持完整的生物體的發(fā)育。“人誘導多能干細胞”指這樣的體(例如，成熟或成體)細胞，其通過強制表達對于維持胚胎干細胞的規(guī)定特性重要的基因和因子而已經(jīng)被重編程為胚胎干細胞樣狀態(tài)(參見例如，Takahashi和Yamanaka，Cell126(4)：663-76，2006，通過引用并入本文)。人誘導多能干細胞表達干細胞標志物并能夠產(chǎn)生具有所有三個胚層(外胚層、內(nèi)胚層、中胚層)特征的細胞?？筛鶕?jù)本公開內(nèi)容所使用的細胞系的另外的非限制性實例包括293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CMLT1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepalc1c7、HighFive細胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L細胞、Jurkat、JY細胞、K562細胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel1、2、3....48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCKII、MG63、MONO-MAC6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCTPeer、PNT-1A/PNT2、PTK2、Raji、RBL細胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2細胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1以及YAR細胞。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的細胞被修飾。被修飾的細胞為含有外源核酸或不天然存在的核酸的細胞。在一些實施方案中，被修飾的細胞含有基因組核酸中的突變。在一些實施方案中，被修飾的細胞含有外源獨立復(fù)制的核酸(例如，存在于附加型載體上的經(jīng)改造核酸)。在一些實施方案中，被修飾的細胞通過向細胞中引入外來或外源核酸產(chǎn)生。核酸可通過常規(guī)方法引入細胞中，例如電穿孔(參見例如HeiserW.C.TranscriptionFactorProtocols：MethodsinMolecularBiologyTM2000；130：117-134)、化學方法(例如磷酸鈣或脂質(zhì))、轉(zhuǎn)染(參見例如LewisW.H.，等，SomaticCellGenet.19805月；6(3)：333-47；ChenC.，等，MolCellBiol.19878月；7(8)：2745-2752)、與含有重組質(zhì)粒的細菌原生質(zhì)體融合(參見例如SchaffnerW.ProcNatlAcadSciUSA.19804月；77(4)：2163-7)，或?qū)⒓兓腄NA直接微注射到細胞的核中(參見例如CapecchiM.R.Cell.198011月；22(2Pt2)：479-88)。在一些實施方案中，細胞被修飾以過表達目的內(nèi)源蛋白質(zhì)(例如，通過引入或者修飾啟動子或編碼目的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因附近的其他調(diào)控元件，以提高其表達水平)。在一些實施方案中，通過誘變修飾細胞。在一些實施方案中，為了產(chǎn)生目的遺傳改變，通過向細胞中引入重組核酸修飾細胞(例如通過插入或同源重組)。在一些實施方案中，經(jīng)改造核酸可以經(jīng)過密碼子優(yōu)化，例如，以用于在人細胞或其他類型細胞中表達。密碼子優(yōu)化是在活生物體中通過將一個物種的DNA核苷酸序列轉(zhuǎn)換至另一個物種的DNA核苷酸序列來提高目的基因的翻譯效率，從而將蛋白質(zhì)表達最大化的技術(shù)。密碼子優(yōu)化的方法是公知的。本公開內(nèi)容的經(jīng)改造構(gòu)建體可瞬時表達或穩(wěn)定表達?！八矔r細胞表達”指未整合入細胞的細胞核基因組中的核酸的細胞表達。相比之下，“穩(wěn)定細胞表達”指存留于細胞及其子細胞的細胞核基因組中的核酸的細胞表達。通常，為了獲得穩(wěn)定細胞表達，用標志物基因和旨在細胞中穩(wěn)定表達的外源核酸(例如，經(jīng)改造核酸)共轉(zhuǎn)染細胞。所述標志物基因為細胞提供了某些可選擇的優(yōu)勢(例如，對毒素、抗生素或其他因子的抗性)。極少的經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞有機會將外源核酸整合至其基因組中。然后，如果例如向細胞培養(yǎng)物添加毒素，則僅有那些將毒素抗性標志物基因整合入其基因組中的少量細胞將能夠增殖，而其他細胞將死亡。在將該選擇壓力施加一段時間后，僅具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞保留，并且可進一步培養(yǎng)。根據(jù)本公開內(nèi)容所使用的標志物基因和選擇劑的實例包括但不限于二氫葉酸還原酶與甲氨蝶呤、谷氨酰胺合成酶與甲硫氨酸亞砜亞胺(methioninesulphoximine)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶與潮霉素、嘌呤霉素N乙酰轉(zhuǎn)移酶與嘌呤霉素，以及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶與遺傳霉素，也稱為G418。本文考慮了其他標志物基因/選擇劑。在瞬時轉(zhuǎn)染的和/或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中的核酸表達可以是組成型或誘導型。本文提供使用的誘導型啟動子已于上文中描述。經(jīng)修飾以包含本公開內(nèi)容經(jīng)改造構(gòu)建體的哺乳動物細胞(例如，人細胞)可使用常規(guī)哺乳動物細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)(例如，維持于細胞培養(yǎng)物中)(參見例如PhelanM.C.CurrProtocCellBiol.20079月；第1章：1.1節(jié)，通過引用并入本文)。例如細胞可生長并維持在細胞培養(yǎng)箱中的合適的溫度以及氣體混合物中(例如，對于哺乳動物細胞為37℃，5％CO2)。對于每種細胞類型的培養(yǎng)條件可以變化。例如，細胞生長培養(yǎng)基可在pH、葡萄糖濃度、生長因子以及其他營養(yǎng)物的存在方面變化。用于補充培養(yǎng)基的生長因子通常來自于動物血液的血清，如胎牛血清(FBS)、小牛血清、馬血清和/或豬血清。在一些實施方案中，本文提供使用的培養(yǎng)基可以是市售的和/或詳細描述的(參見例如BirchJ.R.，R.G..Spier(編輯)EncyclopediaofCellTechnology，Wiley.411-424，2000；KeenM.J.Cytotechnology17：125-132，1995；Zang，等Bio/Technology.13：389-392，1995)。在一些實施方案中，使用了化學成分確定的培養(yǎng)基(chemicallydefinedmedia)。本文也在多個方面考慮了用于在細胞(例如，哺乳動物細胞，如人細胞)內(nèi)構(gòu)建遺傳線路(包括轉(zhuǎn)錄級聯(lián))的方法和組合物。許多復(fù)雜的基因線路需要實施級聯(lián)的能力，其中在一個階段整合的信號被傳送到多個下游階段中，以進行處理和促動(actuation)。例如，基因級聯(lián)對于合成生物學應(yīng)用是重要的，如在活細胞中進行計算的多層人工基因線路(Weber和Fussenegger，2009)。轉(zhuǎn)錄級聯(lián)對于天然調(diào)控系統(tǒng)是重要的，如控制分節(jié)(segmentation)、性別決定以及發(fā)育的那些(Dequeant和Pourquie，2008；Peel等，2005；Sinha等，2014)。圖6A和6B提供了本公開內(nèi)容的多個經(jīng)改造構(gòu)建體可如何在單細胞中一起使用以構(gòu)建轉(zhuǎn)錄級聯(lián)的非限制性實例。如圖6A所示，例如，可將細胞用以下構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染：具有“內(nèi)含子-Csy4”構(gòu)造的第一經(jīng)改造構(gòu)建體，以表達第一gRNA(“gRAN1”)，具有“三鏈體-Csy4”構(gòu)造的第二經(jīng)改造構(gòu)建體mKate2，以表達第二gRNA(“gRNA2”)及EYFP，以及第三經(jīng)改造構(gòu)建體，設(shè)置為表達ECFP。所述細胞也表達Csy4和具有轉(zhuǎn)錄活性的Cas9(taCas9)。這些經(jīng)改造構(gòu)建體這樣設(shè)置，以使得當在Csy4核糖核酸酶存在下表達時，gRNA1從構(gòu)建體釋放并導引taCas9蛋白至互補的在第二經(jīng)改造構(gòu)建體啟動子內(nèi)的gRNA1結(jié)合位點(并使mKate2表達)。然后，所述taCas9蛋白激活第二經(jīng)改造構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生第二gRNA(“gRNA2”)(并使EYFP表達)。然后，gRNA導引taCas9蛋白至互補的在第三經(jīng)改造構(gòu)建體啟動子內(nèi)的gRNA2結(jié)合位點。然后，taCas9蛋白激活第三經(jīng)改造構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄，其表達ECFP。如圖6B所示，細胞可被例如2個經(jīng)改造構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染，每個均具有“三鏈體-Csy4”構(gòu)造，其中由第一構(gòu)建體所編碼的gRNA(“gRNA1”)與由第二構(gòu)建體所編碼的gRNA(“gRNA2”)不同。圖6B中每個構(gòu)建體的激活機制與圖6A所述的機制相似。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容考慮了本文所提供的多個經(jīng)改造構(gòu)建體的表達。例如，細胞可表達2至500個或更多個不同的經(jīng)改造構(gòu)建體。在一些實施方案中，細胞可表達2至10、2至25、2至50、2至75、2至100、2至200、2至300或2至400個不同的經(jīng)改造構(gòu)建體。在一些實施方案中，細胞可表達2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多個不同的本公開內(nèi)容的經(jīng)改造構(gòu)建體。如果經(jīng)改造構(gòu)建體的遺傳元件的構(gòu)造不同，則認為這些構(gòu)建體是彼此不同的，如圖6A所示。如果經(jīng)改造構(gòu)建體的遺傳元件的構(gòu)造相同，但是具體的元件不同，則也認為這些構(gòu)建體是彼此不同的，如圖6B所示。應(yīng)當理解的是，在一些實施方案中，本文所提供的遺傳元件為模塊化的(modular)，以使得細胞可包含多個本公開內(nèi)容的經(jīng)改造構(gòu)建體，每個構(gòu)建體包含以不同方式設(shè)置的不同元件組合，只要元件設(shè)置的方式允許轉(zhuǎn)錄激活以及隨后的核酸表達。例如，經(jīng)改造構(gòu)建體可包含與核酸有效相連的啟動子(例如，RNApolII啟動子)，所述核酸包含：(a)編碼至少1個導引RNA(gRNA)的核苷酸序列；以及(b)選自以下的一個或更多個核苷酸序列：(i)編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列和(ii)編碼RNA干擾分子的核苷酸序列。這樣的經(jīng)改造構(gòu)建體可以還包含或可以不包含gRNA或RNA干擾分子(例如，miRNA)側(cè)翼的同源內(nèi)含子剪接位點。編碼gRNA的核苷酸序列側(cè)翼可以為核糖核酸酶識別位點(例如Csy4核糖核酸酶識別位點)或者gRNA的側(cè)翼可以為核酶。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體包含編碼側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的核苷酸序列與編碼側(cè)翼為核酶的gRNA的核苷酸序列的組合。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體包含編碼側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的第一核苷酸序列與編碼側(cè)翼為核酶的gRNA的第二核苷酸序列的組合，其中所述第一核苷酸序列或所述第二核苷酸序列的側(cè)翼為同源內(nèi)含子剪接位點。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體包含編碼側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的第一核苷酸序列與編碼側(cè)翼為核酶的gRNA的第二核苷酸序列的組合，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列每個的側(cè)翼均為同源內(nèi)含子剪接位點。在一些實施方案中，經(jīng)改造構(gòu)建體包含編碼側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的第一核苷酸序列和/或編碼側(cè)翼為核酶的gRNA的第二核苷酸序列，以及側(cè)翼為同源內(nèi)含子剪接位點的編碼gRNA(其側(cè)翼有或沒有核糖核酸酶識別位點或核酶)的額外的核苷酸序列的組合。在一些實施方案中，編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列也可編碼側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA，其側(cè)翼為同源內(nèi)含子剪接位點。在一些實施方案中，側(cè)翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA也可在目的蛋白質(zhì)內(nèi)編碼RNA干擾分子(例如miRNA和/或siRNA)。本公開內(nèi)容的經(jīng)改造構(gòu)建體依據(jù)構(gòu)建體具體的構(gòu)造和穩(wěn)定性，可包含或可不包含編碼三螺旋結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。本文在多個方面也考慮了用于“重接”細胞調(diào)控線路的方法和組合物?；贑RISPR轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控可與RNA干擾整合，例如以使抑制輸出無活性，和/或反之激活無活性的輸出。如圖7A至7F所示，本公開內(nèi)容整合的方法可用于重接遺傳組件之間的多個互連和反饋環(huán)，從而導致線路行為同步轉(zhuǎn)換(synchronizedshift)。因此，本公開內(nèi)容的多個方面和實施方案可用于促進多機制遺傳線路的構(gòu)建，該線路整合RNA干擾和基于CRISPR的系統(tǒng)以用于可調(diào)的、多輸出基因調(diào)控。此外，基于核糖核酸酶的RNA處理可用于重接遺傳組件之間的多個互連和反饋環(huán)，從而導致線路行為的同步轉(zhuǎn)換。實施例實施例1.用RNA三螺旋和Csy4產(chǎn)生功能gRNA使得復(fù)雜的基于CRISPR-TF線路成為可能的重要的第一步是從人細胞的RNAPII啟動子產(chǎn)生功能gRNA，其允許gRNA產(chǎn)物與特異性調(diào)控信號偶聯(lián)。例如，gRNA依賴性線路的激活可在限定的細胞類型或狀態(tài)下，或響應(yīng)于外界輸入被起始。此外，從單個轉(zhuǎn)錄本同時表達gRNA以及蛋白質(zhì)的能力是有益的。這使得能夠從簡潔的遺傳構(gòu)造產(chǎn)生多個輸出，所述輸出包括效應(yīng)物蛋白質(zhì)和調(diào)控連接。其也可使得能夠?qū)RNA表達整合到內(nèi)源基因座中。因而，本實施例證明了這樣的系統(tǒng)，其中通過內(nèi)源RNAPII啟動子，同時產(chǎn)生功能gRNA和蛋白質(zhì)。在本實施例中利用來自于銅綠假單胞菌之Csy4蛋白的RNA結(jié)合與RNA核酸內(nèi)切酶能力(Haurwitz等，2012；Sternberg等，2012)。Csy4識別28個核苷酸的RNA序列(下文中稱為“28”序列)，切割RNA，并保持與RNA片段上游的結(jié)合(Haurwitz等，2012)。因此，利用Csy4以從由RNAPII啟動子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本釋放gRNA，其也編碼功能蛋白質(zhì)序列。為了產(chǎn)生含有g(shù)RNA的轉(zhuǎn)錄本，使用強效的CMV啟動子(CMVp)以表達mKate2蛋白。在mKate2編碼區(qū)的下游編碼側(cè)翼為2個Csy4結(jié)合位點的gRNA(gRNA1)(圖1A)。在該構(gòu)造中，通過Csy4切割RNA釋放出功能gRNA，而且從上游mRNA(在該情況中編碼mKate2)移除了poly(A)尾，從而導致大多數(shù)真核生物mRNA的翻譯受損(Jackson，1993；Proudfoot，2011)。為了使得缺乏poly(A)尾的mRNA能夠有效地翻譯，使用了三螺旋結(jié)構(gòu)以功能性地補充poly(A)的喪失。將來源于小鼠MALAT1基因座3’末端的110bp片段(Wilusz等，2012)克隆至mKate2的下游以及側(cè)翼為Csy4識別位點的gRNA序列的上游。在許多人癌癥中，MALAT1IncRNA失調(diào)(Lin等，2006)，并且盡管缺乏poly(A)尾，MALAT1仍是穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄本(Wilusz等，2008；Wilusz等，2012)，其被高度保守的3’三螺旋結(jié)構(gòu)(三鏈體)保護以防止外來體和3，-5，核酸外切酶(Wilusz等，2012)。因此，最終的“三鏈體/Csy4”構(gòu)造是由CMVp驅(qū)動的mKate2轉(zhuǎn)錄本，其具有3’三鏈體序列，之后為28-gRNA-28序列(CMVp-mK-Tr-28-gRNA-28)(圖1A)。為了表征gRNA活性，用CMVp-mK-Tr-28-gRNA1-28表達質(zhì)粒以及編碼合成P1啟動子的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，所述P1啟動子特異性地由gRNA1激活以表達EYFP。該P1啟動子含有g(shù)RNA1的8x結(jié)合位點并且基于最小啟動子構(gòu)建體(Farzadfard等，2013)。在本實驗及隨后的那些實驗中(除非另有說明)，用CMV啟動子表達的具有轉(zhuǎn)錄活性的dCas9-NLS-VP64蛋白(taCas9)共轉(zhuǎn)染細胞。用0ng至400ng的Csy4表達質(zhì)粒(其中通過鼠PGK1啟動子產(chǎn)生Csy4)以及1μg的其他質(zhì)粒(原始數(shù)據(jù)見圖1B和圖8A)共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞。提高的Csy4濃度水平未導致mKate2水平的降低，而是導致5倍的提高(圖1B)。此外，產(chǎn)生自該構(gòu)建體的功能gRNA誘導了從P1啟動子EYFP的達60倍的表達。雖然mKate2表達隨著Csy4表達質(zhì)粒的濃度繼續(xù)提高，但是EYFP激活在50ng的Csy4產(chǎn)生質(zhì)粒之后達到平臺(plateau)。此外，有證據(jù)表明400ng的Csy4質(zhì)粒濃度具有細胞毒性。因此，在后續(xù)實驗中使用了100ng至200ng的Csy4質(zhì)粒(除非某處另有說明)，盡管這會減少轉(zhuǎn)染之后的Csy4陽性細胞數(shù)目。或者，可使用更弱的啟動子以降低Csy4表達水平，或者可以用低或中等的Csy4水平產(chǎn)生穩(wěn)定細胞系。有趣的是，盡管5’Csy4識別位點單獨應(yīng)足以從RNA轉(zhuǎn)錄本釋放gRNA，然而該變體構(gòu)造并未產(chǎn)生能夠激活下游靶啟動子至背景水平之上的功能gRNA(數(shù)據(jù)未展示)。不被理論束縛，這可能是由于RNA不穩(wěn)定、poly(A)介導的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運、具有taCas9活性的poly(A)尾的干擾，或其他機制。還對Csy4和taCas9對mKate2表達的相對作用進行了表征。在Csy4和taCas9、Csy4單獨、taCas9單獨，或沒有其中任何一種蛋白質(zhì)存在的情況下，測量了來自基于“三鏈體/Csy4”的gRNA表達構(gòu)建體的mKate2熒光(圖1C和圖9)。最低的mKate2熒光水平來源于僅有taCas9的條件。不被理論束縛，因為使用了具有強細胞核定位序列(nuclearlocalizationsequence，NLS)的taCas9，所述該作用可能產(chǎn)生自taCas9與在mRNA內(nèi)的gRNA的結(jié)合并將轉(zhuǎn)錄本定位于核。該理論得到了數(shù)據(jù)的支持，該數(shù)據(jù)證明，即便不存在Csy4，內(nèi)源啟動子可被產(chǎn)生自基于“三鏈體/Csy4”構(gòu)造的gRNA激活(參見下文及圖1D、圖1E)。用單獨Csy4獲得了最高的mKate2表達水平，表明Csy4處理可增強mKate2水平。在Csy4和taCas9兩者都不存在以及Csy4和taCas9兩者都存在的情況下，mKate2表達相似，并且相比于僅有Csy4的情況降低了3倍至4倍。實施例2.用從人啟動子表達的CRISPR-TF對內(nèi)源基因座進行調(diào)節(jié)為了證實“三鏈體/Csy4”構(gòu)造的穩(wěn)健，對其進行調(diào)整以調(diào)節(jié)人細胞中天然基因組靶標的表達。通過共表達4個不同的gRNA，即gRNA3至gRNA6，靶向內(nèi)源IL1RN基因座以用于基因激活(表1)(Perez-Pinera等，2013a)。表1.該研究中使用的序列4個gRNA的每一個均被設(shè)計為與mKate2伴隨地表達，每個均來自于單獨的質(zhì)粒。每組的4個gRNA由下列啟動子中的1個調(diào)控(根據(jù)其在HEK-293T細胞中的活性水平降序排列)：巨細胞病毒立即早期(CMVp)、人泛素C(UbCp)、人組蛋白H2A1(H2A1p)(Rogakou等，1998)，以及人炎性趨化因子CXCL1(CXCL1p)啟動子(Wang等，2006)。作為對照，使用了RNAPIII啟動子U6(U6p)驅(qū)動4個gRNA的表達。對于每種測試的啟動子，將4種編碼所述4個不同gRNA的質(zhì)粒與表達taCas9和Csy4的質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染。作為陰性對照，用表達gRNA1的質(zhì)粒替代靶向IL1RN的gRNA表達質(zhì)粒，所述表達gRNA1的質(zhì)粒對于IL1RN啟動子為非特異性的(圖1D，“NS”)。使用qRT-PCR以對內(nèi)源IL1RN基因的mRNA水平進行定量，并以陰性對照歸一化結(jié)果。對于U6啟動子調(diào)控的4個gRNA，IL1RN激活水平相對于陰性對照，在不存在Csy4的情況下提高了8,410倍，而在有100ng的Csy4表達質(zhì)粒的情況下提高了6,476倍(圖1D，“U6p”)。用從CMV啟動子表達的gRNA明顯激活I(lǐng)L1RN(圖1D，“CMVp”)，在不存在Csy4的情況下有61倍的增強，而存在Csy4的情況下有1539倍的增強。人RNAPII啟動子在不存在Csy4的情況下產(chǎn)生了約2至7倍的激活，而在存在Csy4的情況下產(chǎn)生了約85至328倍的激活(圖1D，“CXCLp”、“H2A1p”、“UbCp”)。為了進一步表征內(nèi)源基因調(diào)控的輸入-輸出轉(zhuǎn)移功能，將由每種啟動子所產(chǎn)生的mKate2熒光用作多種RNAPII啟動子之輸入啟動子活性的標志(圖1E)。在所測試的mKate2的范圍中，所得到的IL1RN激活中的轉(zhuǎn)移函數(shù)幾乎為線性。該數(shù)據(jù)表明，IL1RN的激活在所測試的條件下并未飽和，并且用人RNAPII啟動子可獲得大動態(tài)范圍的內(nèi)源基因調(diào)控。因此，使用具有從“三鏈體/Csy4”構(gòu)造表達的gRNA的CRISPR-TF可達到天然基因的可調(diào)調(diào)節(jié)。實施例3.從具有Csy4的內(nèi)含子產(chǎn)生功能gRNA作為對“三鏈體/Csy4”構(gòu)造的補充，開發(fā)出了用于通過在基因編碼序列中的內(nèi)含子內(nèi)編碼gRNA，而從RNAPII啟動子產(chǎn)生功能gRNA的一個替代策略。具體而言，使用“共有”接受體、供體，以及分支序列，將gRNA1作為mKate2編碼序列內(nèi)的內(nèi)含子進行編碼(圖2A)(Smith等，1989；Taggart等，2012)。出人意料的是，該簡單的構(gòu)造產(chǎn)生不可檢測的EYFP水平(圖10，下圖)。不被理論束縛，沒有任何穩(wěn)定化的情況下，內(nèi)含子gRNA表現(xiàn)為快速地降解。為了穩(wěn)定內(nèi)含子gRNA，使用了產(chǎn)生長壽命內(nèi)含子的內(nèi)含子序列。這些序列包括如HSV1潛伏相關(guān)內(nèi)含子和sno-IncRNA2(snoRNA2)內(nèi)含子，前者形成穩(wěn)定的環(huán)狀內(nèi)含子(Block和Hill，1997)。所述snoRNA2內(nèi)含子的兩端被snoRNA機器處理，這保護該內(nèi)含子不被降解并導致側(cè)翼為snoRNA序列的IncRNA的累積，所述snoRNA序列缺乏5’帽和3’poly(A)尾(Yin等，2012)。然而，這些用于產(chǎn)生穩(wěn)定內(nèi)含子gRNA的方法也導致了靶啟動子不可檢測的激活(數(shù)據(jù)未示出)。作為一個替代策略，通過在gRNA盒側(cè)翼添加2個Csy4識別位點穩(wěn)定內(nèi)含子gRNA。不被理論束縛，經(jīng)剪接的含有g(shù)RNA的內(nèi)含子應(yīng)當被Csy4結(jié)合，這應(yīng)當釋放功能gRNA。與“三鏈體/Csy4”設(shè)置相比，Csy4也可在剪接發(fā)生之前潛在地結(jié)合并消化前mRNA。在此情況下，將會產(chǎn)生功能gRNA，但含有mKate的前mRNA在該過程中被破壞(圖2A)。因此，提高的Csy4濃度預(yù)期會導致mkate2水平降低但功能gRNA的水平更高。不被理論束縛，在該構(gòu)造中，隨著Csy4濃度的mKate2水平的降低以及功能gRNA的提高預(yù)期依賴于幾種因素，其示于圖2A中(黑線，不依賴于Csy4的過程；灰線，Csy4介導的過程)。這些競爭性因素包括Csy4與其靶位點結(jié)合并切割RNA的速率、剪接的速率，以及Csy4不存在下經(jīng)剪接的gRNA的降解速率。為了檢查“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)造的行為，使用了CMV啟動子以驅(qū)動HSVl、snoRNA和含有側(cè)翼為兩個Csy4結(jié)合位點的gRNA1的共有內(nèi)含子與mKate2(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]內(nèi)含子-mKEX2)，以及調(diào)控EYFP表達的合成P1啟動子的表達(圖2A)。通過EYFP激活測定，Csy4的存在產(chǎn)生功能gRNA1(原始數(shù)據(jù)參見圖2B至圖2D和圖8B)。產(chǎn)生自HSV1內(nèi)含子的gRNA1產(chǎn)生了最強的EYFP激活(圖2D)，其在200ng的Csy4質(zhì)粒下達到飽和。相比之下，snoRNA2內(nèi)含子使EYFP表達在50ng的Csy4質(zhì)粒下達到飽和，但由該內(nèi)含子產(chǎn)生的最大EYFP水平在所有測試的內(nèi)含子中最低(約為HSV1內(nèi)含子的65％)。此外，Csy4水平的提高伴隨地降低了mKate2的水平。雖然這些趨勢對所有三種測試的內(nèi)含子是相似的，但作用的量級是內(nèi)含子特異性的。snoRNA2內(nèi)含子表現(xiàn)出隨著Csy4質(zhì)粒濃度提高的最大的mKate2水平降低，在400ng的Csy4質(zhì)粒下，相比于無Csy4條件，具有15倍的mKate2熒光的降低(圖2C)。共有和HSV1內(nèi)含子表現(xiàn)出mKate2水平對Csy4水平提高的較低敏感性(圖2B和圖2D)。因此，該“內(nèi)含子/Csy4”方法與“三鏈體/Csy4”構(gòu)造一起，提供了用于從翻譯的基因可調(diào)產(chǎn)生功能gRNA的一套組件。具體地，含有g(shù)RNA的基因及下游靶基因的絕對蛋白質(zhì)水平，以及它們之間的比，可通過Csy4的濃度和具體組件的選擇確定。實施例4.Csy4和內(nèi)含子gRNA之間的相互作用為了確定是否5’和3’Csy4識別位點兩者對于功能gRNA從內(nèi)含子產(chǎn)生都是必需的，使用了mKate2內(nèi)基于HSV1的內(nèi)含子。該內(nèi)含子包含gRNA1序列，所述序列在其5’側(cè)的前面有Csy4結(jié)合位點(“28-gRNA”，圖2E和圖11)，或者在其3’末端的后面有Csy4結(jié)合位點(“gRNA-28”，圖2F和圖11)。使用了合成P1-EYFP構(gòu)建體評估gRNA1活性。以“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)造的性能歸一化圖2E和2F的數(shù)據(jù)，其中內(nèi)含子gRNA1側(cè)翼為2個Csy4結(jié)合位點(“28-gRNA-28”，圖11)。這兩種僅含有單個Csy4結(jié)合位點的構(gòu)造的mKate2水平，相對于無Csy4的情況，都隨著Csy4的添加而降低(圖2E，圖2F)。相比之下，通過gRNA1引導的CRISPR-TF的下游EYFP激活對于單個Csy4結(jié)合位點構(gòu)造(圖2E，圖2F)顯著低于“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)建體(圖2D)。當僅有1個Csy4結(jié)合位點位于gRNA1內(nèi)含子的5’末端時，EYFP的表達不可檢測(圖2E)。當僅有1個Csy4結(jié)合位點位于gRNA1內(nèi)含子的3’末端時，相比于“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)造(其含有g(shù)RNA1側(cè)翼的Csy4識別位點)(圖2D)，觀察到EYFP水平6倍的降低(圖2F)。不受理論束縛，可能Csy4可以幫助穩(wěn)定內(nèi)含子gRNA。例如，被Csy4切割的RNA的5’末端含有羥基(OH-)，其可保護它們不受主要的5’-＞3’細胞RNA酶(如XRN家族)的作用，所述RNA酶需要5’磷酸以用于底物識別(Houseley和Tollervey,2009；Nagarajan等，2013)。此外，Csy4蛋白與被切割的gRNA3’末端的結(jié)合(Haurwitz等，2012)可保護其不受由真核生物外來體復(fù)合物所介導的3’-＞5’降解(Houseley和Tollervey，2009)。實施例5.用順式作用核酶產(chǎn)生功能gRNA除了上文描述的基于“三鏈體/Csy4”和“內(nèi)含子/Csy4”的機制外，還利用了自體切割核酶以使得能夠在人細胞中通過產(chǎn)生自RNAPII啟動子的gRNA進行基因調(diào)控。具體而言，對gRNA進行改造，以使其在其5’末端含有錘頭狀(HH)核酶(Pley等，1994)并在其3’末端含有HDV核酶(Ferre-D′Amare等，1998)，如圖3所示。測試了3種不同構(gòu)造中的核酶，所有均由CMVp驅(qū)動：(1)mKate2轉(zhuǎn)錄本，其后為三鏈體和HH-gRNA1-HDV序列(CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV，圖3A)；(2)mKate2轉(zhuǎn)錄本，其后為HH-gRNA1-HDV序列(CMVp-mK-HH-g1-HDV，圖3B)；以及(3)HH-gRNA1-HDV序列本身，無相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)編碼序列(CMVp-HH-g1-HDV，圖3C)。將從這些構(gòu)造產(chǎn)生的gRNA與之前所述的通過RNAPIII啟動子U6和“三鏈體/Csy4”構(gòu)造(具有200ng的Csy4質(zhì)粒)產(chǎn)生的gRNA相比較。所有構(gòu)建體使用gRNA1，其驅(qū)動從含有P1-EYFP的質(zhì)粒的EYFP表達。所有含有mKate2的構(gòu)建體均表現(xiàn)出可檢測的mKate2熒光水平(圖3D和圖12)。出人意料的是，這包括CMVp-mK-HH-g1-HDV，其不含有三鏈體序列，并因此，由于poly(A)尾的移除而預(yù)期為具有低mKate2水平。不受理論束縛，這可能是由于無效的核酶切割(Beck和Nassal，1995；Chowrira等，1994；RHormes，1997)，這允許未處理的轉(zhuǎn)錄本被轉(zhuǎn)運至胞漿并翻譯，mKate2轉(zhuǎn)錄本受到殘留的3’核酶序列的保護，或其他機制。在輸出EYFP激活的方面，最高EYFP熒光水平從U6p表達的gRNA產(chǎn)生，隨后為CMVp-HH-g1-HDV和CMVp-mK-HH-g1-HDV構(gòu)建體(圖3D)。CMVp-mK-Tr-HH-gRNA1-HDV和“三鏈體/Csy4”構(gòu)造具有相似的EYFP水平。順式作用核酶是有用的，并可介導從RNAPII啟動子的功能gRNA表達。具有可由外界配體調(diào)控的活性的核酶(如茶堿)也可用于引發(fā)gRNA的外源釋放。然而，這樣的策略不能將胞內(nèi)核酶活性與單細胞內(nèi)所產(chǎn)生的內(nèi)源信號相關(guān)聯(lián)。相比之下，如下所示，遺傳編碼的Csy4的表達可用于重接由RNA引導的遺傳線路并改變其行為(圖7)。因此，反式作用核酶可用于將RNA切割和gRNA產(chǎn)生與細胞內(nèi)事件相關(guān)聯(lián)。實施例6.從單RNA轉(zhuǎn)錄本進行多重gRNA表達為了證明從單個RNA轉(zhuǎn)錄本表達2個獨立的gRNA激活2個獨立的下游啟動子，使用了2種構(gòu)造。在第一種構(gòu)造(“內(nèi)含子-三鏈體”)中，在HSV1內(nèi)含子內(nèi)編碼gRNA1，其側(cè)翼為位于mKate2編碼序列內(nèi)的2個Csy4結(jié)合位點。此外，被2個Csy4結(jié)合位點包圍的gRNA2在mKate2-三鏈體序列的下游編碼(圖4A，CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2-Tr-28-g2-28)。在第二種構(gòu)造中(“三鏈體-串聯(lián)”)，gRNA1和gRNA2兩者都用Csy4結(jié)合位點所圍繞，并串聯(lián)放置于mKate2-三鏈體序列的下游(圖4B，CMVp-mK-Tr-28-g1-28-g2-28)。在這兩種構(gòu)造中，gRNA1和gRNA2分別靶向合成啟動子P1-EYFP和P2-ECFP。如圖4C所示(原始數(shù)據(jù)參見圖13)，這兩種策略均導致活性多重gRNA的產(chǎn)生?！皟?nèi)含子-三鏈體”構(gòu)建體表現(xiàn)出在200ng的Csy4質(zhì)粒存在下，相比于無Csy4，有3倍的mKate2下降、10倍的EYFP提高，以及100倍的ECFP提高。在“三鏈體-串聯(lián)”構(gòu)造中，在200ng的Csy4存在下，相比于無Csy4，mKate2、EYFP和ECFP的表達分別提高了3倍、36倍和66倍。與“三鏈體-串聯(lián)”構(gòu)建體相比，“內(nèi)含子-三鏈體”構(gòu)造具有更高的EYFP和ECFP水平。因此，這兩種用于多重gRNA表達的策略均使得在多個下游靶標有CRISPR-TF活性，并可以對所需的應(yīng)用進行調(diào)整。為了進一步探究多重構(gòu)建體的可擴展性，并證明其在靶向內(nèi)源基因座中的應(yīng)用，從單個轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生了4個不同的gRNA種類。將這4個對于IL1RN激活所需的gRNA串聯(lián)地克隆到單個轉(zhuǎn)錄本上的mKate2-三鏈體序列的下游，由Csy4結(jié)合位點分開(圖5A)。將由該多重單個轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建體激活的IL1RN與這樣的構(gòu)造相比較，該構(gòu)造中從4種不同的質(zhì)粒表達4個不同的gRNA(圖5B，分別為“多重”對“非多重”)。在100ng的Csy4質(zhì)粒存在下，多重構(gòu)造導致了相對于非特異性gRNA1(“NS”)約1111倍的激活，并比單gRNA表達質(zhì)粒的非多重組更有效約2.5倍。此外，即使不存在Csy4，檢測到多重構(gòu)造的約155倍的IL1RN的激活，這表明即便不存在Csy4，taCas9也可結(jié)合gRNA并募集其用于基因激活。這些結(jié)果證明，有可能從單個的簡潔RNA轉(zhuǎn)錄本編碼多個功能gRNA，以用于多重表達。因此，這些構(gòu)造使得能夠緊湊編程Cas9功能，以用于實施多輸出的合成基因線路、用于調(diào)節(jié)內(nèi)源基因，以及用于潛在地獲得有條件的多重基因組編輯。實施例7.具有RNA導引的調(diào)控的合成轉(zhuǎn)錄級聯(lián)為了證明RNA依賴性調(diào)控構(gòu)建體的用途，本文使用其創(chuàng)建了第一基于CRISPR-TF的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)。將“三鏈體/Csy4”和“內(nèi)含子/Csy4”策略整合以建立2種不同的三階段CRISPR-TF介導的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)(圖6)。在第一種設(shè)計中，來自“內(nèi)含子/Csy4”構(gòu)建體的由CMVp驅(qū)動的gRNA1表達從HSV1內(nèi)含子產(chǎn)生gRNA1，其激活合成啟動子P1以從“三鏈體/Csy4”構(gòu)造產(chǎn)生gRNA2，其隨后激活下游調(diào)控ECFP的合成啟動子P2(圖6A)。在第二種設(shè)計中，級聯(lián)第一階段中的內(nèi)含子gRNA表達盒被替換為“三鏈體/Csy4”構(gòu)造，以表達gRNA1(圖6B)。這兩種設(shè)計在200ng的Csy4質(zhì)粒存在下進行測試(圖6C、6D和圖14)。在第一種級聯(lián)設(shè)計中，相比于對照，觀察到EYFP76倍的提高和ECFP13倍的提高，對照中將級聯(lián)的第二階段(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)替換為空質(zhì)粒(圖6C)。在第二種級聯(lián)設(shè)計中，相比于對照，觀察到EYFP31倍的提高和ECFP21倍的提高，對照中將級聯(lián)的第二階段(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)替換為空質(zhì)粒(圖6D)。這些結(jié)果證明，存在通過gRNA1的啟動子P2的最小非特異性激活，其對于轉(zhuǎn)錄級聯(lián)的可擴展性和可靠性是關(guān)鍵的。此外，級聯(lián)中每一階段的倍數(shù)激活依賴于所有上游節(jié)點(node)的存在，這是在正確起作用的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)中所預(yù)期的(圖6C、6D)。實施例8.重接RNA依賴性的合成調(diào)控線路下述實驗試圖證明CRISPR-TF調(diào)控如何可以與哺乳動物RNA干擾整合，以實施更復(fù)雜的線路拓撲結(jié)構(gòu)。此外，下述實驗示出了網(wǎng)絡(luò)基序如何可以基于以Csy4為基礎(chǔ)的RNA處理而被重接。具體而言，將miRNA調(diào)控與CRISPR-TF合并，并使用Csy4通過移除同源miRNA結(jié)合位點干擾miRNA對靶RNA的抑制。建立單個RNA轉(zhuǎn)錄本，其能夠表達功能miRNA(Greber等，2008；Xie等，2011)和功能gRNA兩者。這是通過編碼mKate2基因內(nèi)共有內(nèi)含子內(nèi)部的哺乳動物miRNA，以及隨后的三鏈體序列和側(cè)翼為Csy4識別位點的gRNA1序列所實現(xiàn)的(圖7A，CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)。也使用了2種輸出構(gòu)建體，以證明用經(jīng)改造構(gòu)建體進行多重基因調(diào)控的潛力。第一輸出為組成型表達的ECFP基因，其后為三鏈體序列、Csy4識別位點、8xmiRNA結(jié)合位點(8xmiRNA-BS)，以及另一個Csy4識別位點(圖7A)。第二輸出為合成P1啟動子，其調(diào)控EYFP表達(圖7A)。在Csy4不存在下，ECFP和EYFP水平低，因為miRNA抑制了ECFP表達，并且沒有功能gRNA1產(chǎn)生(圖7B和圖15“機制1”)。在Csy4存在下，相比于無Csy4條件，ECFP表達提高30倍，我們將其歸因于Csy4誘導的8xmiRNA-BS與ECFP轉(zhuǎn)錄本的分離(圖7B)。此外，Csy4的存在產(chǎn)生了功能gRNA1，導致相比于無Csy4條件EYFP表達提高了17倍(圖7B)。mKate2熒光水平在Csy4陽性和Csy4陰性條件下均高。因此，通過同時使抑制性輸出連接失活并使激活性輸出連接有功能，Csy4催化了基于RNA的線路連接的重接，該連接位于輸入節(jié)點及其2個輸出之間(圖7C)。為了證明使用RNA依賴性機制可對額外的線路拓撲結(jié)構(gòu)進行編程的便捷特性，通過在含有mKate的轉(zhuǎn)錄本3’末端并入額外的4xmiRNA-BS，對圖7A中的設(shè)計進行了擴展(圖7D，CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)。在Csy4不存在下，這通過產(chǎn)生于mKate2內(nèi)含子內(nèi)的miRNA導致了mKate2表達的自調(diào)控負反饋抑制(圖7E和圖15，“機制2”)。此外，由于miRNA對ECFP的抑制及缺乏功能gRNA1的產(chǎn)生，ECFP和EYFP兩者的水平均保持較低。然而，在Csy4存在下，由于Csy4介導的4xmiRNA-BS與mKate2轉(zhuǎn)錄本的分離，mKate2水平提高了21倍。此外，miRNA對ECFP的抑制以相似的方式得到緩解，導致了ECFP水平27倍的提高。最后，產(chǎn)生了功能gRNA1，導致EYFP水平50倍的提高(圖7E)。因此，通過同時使抑制性輸出連接失活、使激活性輸出連接有功能，并使自調(diào)控反饋環(huán)路失活，Csy4催化了基于RNA的線路連接的重接，該連接位于輸入節(jié)點及其2個輸出之間(圖7F)。合成生物學提供了用于通過破壞、重接以及模仿天然網(wǎng)絡(luò)基序(networkmotif)來研究天然調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的工具。此外，合成線路可用于連接外源信號與內(nèi)源基因調(diào)控，以實施生物醫(yī)學應(yīng)用及進行細胞計算。盡管許多合成基因線路基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控，然而基于RNA的調(diào)控可用于構(gòu)建多種合成基因線路。盡管有許多優(yōu)勢，然而先前的工作并未將基于RNA的調(diào)控與CRISPR-TF整合，考慮到其可編程性以及多重的潛力，它們對于實施可擴展的遺傳線路均是有前景的策略。本文提供了用于在人細胞中對人工基因線路和內(nèi)源基因調(diào)控進行改造的構(gòu)建體。該框架整合了哺乳動物RNA調(diào)控機制與來自于細菌的RNA依賴性蛋白質(zhì)dCas9和RNA加工蛋白Csy4。此外，這使得能夠基于核酸之間的堿基配對互補對調(diào)控連接進行方便的編程。在一些實施方案中，本文提供了多種互補的方法，以從RNAPII啟動子調(diào)控的蛋白質(zhì)編碼序列產(chǎn)生功能gRNA，其也允許目的蛋白質(zhì)的伴隨表達。所使用的基因為熒光基因，因為它們是啟動子活性的方便的報告基因。然而，這些基因可容易地與任何其他蛋白質(zhì)編碼序列交換，從而使得能夠從單個構(gòu)建體多重表達gRNA以及任意蛋白質(zhì)輸出。基于RNA三鏈體與Csy4、RNA內(nèi)含子與Csy4、以及順式作用核酶，證實了這些策略通過靶向合成啟動子產(chǎn)生功能gRNA的能力。此外，當gRNA側(cè)翼為Csy4識別位點并位于RNA三鏈體之前的基因的下游時，所述基因的水平隨著Csy4的水平而提高。相反的作用發(fā)現(xiàn)于當gRNA側(cè)翼為Csy4識別位點并位于內(nèi)含子之內(nèi)時，該作用的量級根據(jù)所使用的特定內(nèi)含子序列而變化。因此，這些互補的構(gòu)造使得能夠在合成基因線路內(nèi)獲得可調(diào)的RNA和蛋白質(zhì)水平。作為對合成線路的補充，在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的經(jīng)改造構(gòu)建體可用于從多個不同的人RNAPII啟動子以及CMV啟動子激活內(nèi)源啟動子。在一些實施方案中，本文提供了新策略以用于從緊湊的單個轉(zhuǎn)錄本的多重gRNA表達，以對合成和天然啟動子兩者進行調(diào)節(jié)。該特征是有用的，因為其可用于例如從單個節(jié)點調(diào)控多個節(jié)點。在單個轉(zhuǎn)錄本內(nèi)簡潔地編碼多個gRNA的能力使得具有大量平行“輸出端(fan-ont)”(例如，來自給定節(jié)點的對外互連)的復(fù)雜線路以及具有密集互連的網(wǎng)絡(luò)成為可能。此外，用幾個gRNA以精簡的方式協(xié)同調(diào)節(jié)內(nèi)源基因座的能力是有優(yōu)勢的，因為例如，經(jīng)常需要多個gRNA以對天然啟動子進行明顯的調(diào)節(jié)。因此，在一些情況下，本文所述的經(jīng)改造構(gòu)建體可用于建立有效的人工基因網(wǎng)絡(luò)以及微擾天然調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外，在一些實施方案中，也可使用成熟的核酸酶Cas9(nuclease-proficientCas9)代替taCas9，以通過gRNA表達的調(diào)控條件性將多重基因組編輯活性與細胞信號連接。這使得能夠在體內(nèi)環(huán)境(例如細胞特異性的、時間或空間控制)下條件性地多重敲除。除了遺傳研究之外，在一些實施方案中，該能力可用于創(chuàng)建體內(nèi)基于DNA的將細胞事件與突變相連的“紙帶(tickertape)”。在一些實施方案中，這些構(gòu)造為人細胞中復(fù)雜且緊湊的合成基因線路的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。不受理論束縛，因為用經(jīng)改造構(gòu)建體的調(diào)控互鏈的特異性僅由RNA序列決定，所以可構(gòu)建具有幾乎任何網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)的可擴展的線路。例如，多層網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)在人工和天然遺傳環(huán)境下，對于獲得復(fù)雜行為是重要的。因此，為了證明本構(gòu)建體對于實施更復(fù)雜合成線路的用途，將其用于創(chuàng)建高度特異且有效的第一基于CRISPR-TF的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)。本文通過所提供的實施例證明了這是可靠的具有2種不同構(gòu)造的三步轉(zhuǎn)錄級聯(lián)，所述不同構(gòu)造合并了RNA三鏈體、內(nèi)含子、Csy4和CRISPR-TF。在所述級聯(lián)的不同階段之間不存在不希望的串擾，這突出了RNA依賴性調(diào)控方案對于合成基因線路設(shè)計的正交性及可擴展性。在一些情況下，可使用多重gRNA表達與轉(zhuǎn)錄級聯(lián)的組合以創(chuàng)建多階段、多輸入/多輸出的基因網(wǎng)絡(luò)，其能夠推理、計算、以及與內(nèi)源系統(tǒng)交互。此外，在一些實施方案中，可用的拓撲結(jié)構(gòu)，如多階段前饋和反饋環(huán)，可被容易地編程。此外，RNA調(diào)控部分(如CRISPR-TF和RNA干擾)被整合在一起以創(chuàng)建多種線路拓撲結(jié)構(gòu)，其可通過條件性RNA處理而重接。因為正調(diào)控和負調(diào)控兩者均可能以相同的taCas9蛋白和miRNA進行可調(diào)的負調(diào)控，許多重要的多組件網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)可使用該組調(diào)控部分實施。此外，Csy4可用于例如通過修飾RNA轉(zhuǎn)錄本催化基因表達中的改變。例如，釋放功能gRNA以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，并且從RNA轉(zhuǎn)錄本移除miRNA結(jié)合位點以消除基于miRNA的連接。此外，Csy4的不存在或存在用于分別轉(zhuǎn)換基于miRNA的自調(diào)控負反饋環(huán)的開與關(guān)(圖7B)。在一些實施方案中，該特征可在線路中擴展以使得將正反饋環(huán)中不需要的泄漏最小化，并使線路在不同狀態(tài)之間動態(tài)地轉(zhuǎn)換。通過連接Csy4表達與例如內(nèi)源啟動子，線路與網(wǎng)絡(luò)行為之間的互連也可條件性地與特定的組織、事件(例如，細胞周期階段，突變)或環(huán)境條件相連。通過基因組發(fā)掘或?qū)sy4的定向誘變，正交的Csy4變體可用于更復(fù)雜的RNA處理方案。此外，通過使用正交的Cas9蛋白可獲得額外的靈活性和可擴展性?？傊?，本公開內(nèi)容提供了多樣的構(gòu)建體組，以用于建立可擴展的調(diào)控基因線路、對其調(diào)整、修飾線路組件之間的連接，以及使網(wǎng)絡(luò)中的多個基因表達同步。此外，在一些實施方案中，這些調(diào)控部分可用于交互合成基因線路與內(nèi)源系統(tǒng)以及用于重接內(nèi)源網(wǎng)絡(luò)。將RNA依賴性調(diào)控機制與RNA處理整合將使得復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控成為可能，加快合成生物學，并促進在人細胞中的基礎(chǔ)生物學的研究。質(zhì)粒構(gòu)建CMVp-dCas9-3xNLS-VP64(taCas9，構(gòu)建體1，表2)質(zhì)粒的建立如前所述(Farzadfard等，2013)。來自于銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(Qi等，2012)的csy4基因被密碼子優(yōu)化以用于在人細胞中表達，經(jīng)PCR擴增含有N端6x-His標簽以及TEV識別序列，并克隆至PGK1-EBFP2質(zhì)粒(Farzadfard等，2013)中HindIII/SacI位點之間的PGK1啟動子下游，以創(chuàng)建PGK1p-Csy4-pA(構(gòu)建體2，表2)。表2.構(gòu)建體名稱、設(shè)計及縮寫使用GIBSON由用合適的同源突出端擴增的三個部分建立質(zhì)粒CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA(構(gòu)建體3，表2)：1)mKate2的全長編碼序列；2)小鼠MALAT13’三螺旋的前110個堿基對(bp)(Wilusz等，2012)；以及3)含有20bp特異性決定序列(SpecificityDeterminingSequence，SDS)和釀膿鏈球菌(S.pyogenes)gRNA骨架以及28個核苷酸(nt)Csy4識別位點的gRNA1。報告質(zhì)粒P1-EFYP-pA(構(gòu)建體5，表2)和P2-ECFP-pA(構(gòu)建體6，表2)為通過將gRNA1結(jié)合位點的8個重復(fù)和gRNA2結(jié)合位點的8個重復(fù)經(jīng)由對互補寡核苷酸退火克隆到pG5-Luc(Promega)的NheI位點中建立。然后，將EYFP和ECFP分別克隆到NcoI/FseI位點中。通過GIBSON由具有合適同源性突出端的以下部分建立質(zhì)粒CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2-EX2-pA(構(gòu)建體4，表2)：1)mKate2的mKate2_EX1(a.a.1-90)；2)mKate2的mKate_EX2(a.a.91-239)以及3)gRNA1，其含有20bpSDS，之后為釀膿鏈球菌gRNA骨架，所述骨架的側(cè)翼為Csy4識別位點和HSV1接受體、供體及分支序列。以相似的方式建立CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pA質(zhì)粒的變化，所述質(zhì)粒含有共有接受體和SnoRNA2接受體、供體及分支序列，并且具有或不具有Csy4識別序列(構(gòu)建體8至12，表2)。通過GIBSON由XmaI消化的CMVp-mKate2和經(jīng)PCR延伸的gRNA1擴增子(具有或不具有三鏈體，并在5’末端上含有HHRibo(Gao和Zhao，2014)以及在3’末端上含有HDVRibo(Gao和Zhao，2014))建立核酶表達質(zhì)粒CMVp-mKate2-三鏈體-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA和CMVp-mKate2-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA質(zhì)粒(分別為構(gòu)建體13和14，表2)。相似地通過GIBSON由SacI消化的CMVp-mKate2和經(jīng)PCR延伸的gRNA1擴增子(在5’末端上含有HHRibo，且在3’末端上含有HDVRibo)建立質(zhì)粒CMVp-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA(構(gòu)建體15，表2)。使用合適的同源性通過GIBSON由以下部分建立質(zhì)粒CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-三鏈體-28-gRNA2-28-pA(構(gòu)建體16，表2)：1)XmaI消化的CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pA(構(gòu)建體4，表2)以及2)從CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA(構(gòu)建體3，表2)之經(jīng)PCR擴增的三鏈體-28-gRNA2-28。使用合適的同源性通過GIBSON的以下部分建立質(zhì)粒CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-gRNA2-28-pA(構(gòu)建體17，表2)：1)XmaI消化的CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA(構(gòu)建體3，表2)以及2)經(jīng)PCR擴增的28-gRNA2-28。利用GoldenGate方法，使用II型限制性酶，BsaI構(gòu)建質(zhì)粒CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA3-28-gRNA4-28-gRNA5-28-gRNA6-28-pA(構(gòu)建體19，表2)。具體而言，PCR擴增靶向含有20bpSDS的gRNA3、gRNA4、gRNA5、gRNA6序列的IL1RN以及釀膿鏈球菌gRNA骨架，以使其含有5’末端上的BsaI限制性位點以及Csy4“28”和3’末端上的BsaI限制性位點。使PCR擴增產(chǎn)物進行30個如下交替的循環(huán)：消化隨后分別在37℃和20℃連接。將含有g(shù)RNA3-28-gRNA4-28-gRNA5-28-gRNA6-28排列的540bpPCR產(chǎn)物擴增并用NheI/XmaI消化，并且克隆至CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA質(zhì)粒(構(gòu)建體3，表2)中。以來自LilaWroblewska的贈送接受含有內(nèi)含子FF4(合成miRNA)的CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-pA質(zhì)粒。將合成FF4miRNA克隆至位于mKate2的a.a.90與91之間的具有共有接收者、供體及分支序列的內(nèi)含子中，以產(chǎn)生CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA(構(gòu)建體20，表2)以及CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-三鏈體-28-gRNA1-28-4xFF4BS-pA(構(gòu)建體21，表2)。質(zhì)粒CMVp-ECFP-三鏈體-28-8xmiRNA-BS-28-pA(構(gòu)建體22，表2)通過具有以下部分的GIBSON克?。?)ECFP的全長編碼序列，和2)110nt的MALAT13’三螺旋序列，其用含有8個FF4miRNA結(jié)合位點及兩端上的Csy4識別序列的寡核苷酸通過PCR延伸擴增。細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HEK293T細胞獲自美國組織保藏中心(AmericanTissueCollectionCenter，ATCC)，并在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′sModifiedEagleMedium，DMEM)中在37℃、5％CO2下維持，所述培養(yǎng)基補充有10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)、1％青霉素-鏈霉素、1％GlutaMAX、非必需氨基酸。將HEK293T細胞用HD轉(zhuǎn)染試劑(Promega)根據(jù)制造商的說明書轉(zhuǎn)染。在6孔板中，使用200,000細胞/孔進行每個轉(zhuǎn)染。作為對照，使用了2μg的單質(zhì)粒，其中CMV啟動子調(diào)控mKate2，轉(zhuǎn)染效率常規(guī)地高于90％(通過用與實驗相同的設(shè)置進行的流式細胞術(shù)測定)。除非另有說明，每種質(zhì)粒以1μg/樣品轉(zhuǎn)染。所有樣品用taCas9轉(zhuǎn)染，除非具體說明。在轉(zhuǎn)染后72小時將細胞進行流式細胞術(shù)或qRT-PCR分析。定量反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)下述實驗過程描述于(Perez-Pinera等，2013a)中。在轉(zhuǎn)染后72小時收獲細胞。使用RNeasyPlusRNA分離試劑盒(Qiagen)分離總RNA。使用qScriptcDNASuperMix(QuantaBiosciences)進行cDNA合成。用具有以下寡核苷酸引物的Mastercyclereprealplex實時PCR系統(tǒng)(Eppendorf)進行使用PerfeCTaSYBRGreenFastMix(QuantaBiosciences)的實時PCR：IL1RN-正向GGAATCCATGGAGGGAAGAT(SEQIDNO：22)，反向TGTTCTCGCTCAGGTCAGTG(SEQIDNO：23)；GAPDH-正向CAATGACCCCTTCATTGACC(SEQIDNO：24)，反向TTGATTTTGGAGGGATCTCG(SEQIDNO：25)。使用Primer3Plus軟件設(shè)計所述引物并且其購自IDT。通過熔化曲線分析確定引物特異性。計算了合適動態(tài)范圍內(nèi)的反應(yīng)效率，以確保標準曲線的線性。通過ddCt法計算以GAPDH表達歸一化的目的基因mRNA表達的倍數(shù)提高。然后，我們以非特異性gRNA1對照條件歸一化mRNA水平。報告的值為用對每個實驗進行平均的技術(shù)性重復(fù)的三次獨立生物學重復(fù)的平均值。誤差條代表平均值的標準差(standarderrorofthemean，s.e.m)。流式細胞術(shù)轉(zhuǎn)染后72小時用胰蛋白酶收獲細胞，用DMEM培養(yǎng)基和1xPBS洗滌，用1xPBS重懸到流式細胞術(shù)管中并立即用BectonDickinsonLSRIIFortessa流式細胞儀測定。在每個數(shù)據(jù)組中對每個樣品至少記錄50,000個細胞。每個實驗結(jié)果代表來自至少3次生物學重復(fù)的數(shù)據(jù)。誤差條為對加權(quán)中位熒光值的s.e.m(關(guān)于數(shù)據(jù)分析的詳細信息參見擴展的實驗流程)。補償對照補償對照是嚴格的并設(shè)計為移除假陽性細胞，甚至以移除真陽性細胞為代價。用BDFACSDiva(版本號6.1.3；BDBiosciences)完成補償，詳細信息如下：表3.用于流式細胞術(shù)的補償設(shè)置熒光染料-％熒光染料光譜重疊PE-Tx-Red-YGFITC0％PacificBlueFITC0.2％FITCPE-Tx-Red-YG21.1％PacificBluePE-Tx-Red-YG1％FITCPacificBlue7.5％流式細胞術(shù)分析對補償?shù)牧魇郊毎g(shù)結(jié)果使用FlowJo軟件(vX.0.7r2)進行分析。按以下描述進行計算：對所有樣品進行設(shè)門(gate)以排除細胞團塊和碎片(群P1)。根據(jù)以下設(shè)門分析P1細胞的柱狀圖，根據(jù)在相同獲取條件下非轉(zhuǎn)染細胞的自體熒光對其進行確定，以使得假陽性細胞的比例低于0.1％：mKate2：“mKate2陽性”細胞限定為高于100a.u.的熒光閾值的細胞。EYFP：“EYFP陽性”細胞限定為高于300a.u.的熒光閾值的細胞。ECFP：“ECFP陽性”細胞限定為高于400a.u.的熒光閾值的細胞。計算每個“陽性細胞”群的陽性細胞的百分比(％陽性)和中位熒光。將％陽性細胞乘以中位熒光，得到加權(quán)中位熒光表達水平，其將熒光強度與細胞數(shù)目相關(guān)聯(lián)。該檢測策略與幾個先前的研究(Auslander等，2012；Xie等，2011)相一致。確定每個樣品的加權(quán)中位熒光。計算生物學重復(fù)的加權(quán)中位熒光的平均值。這些是展示于文章中的數(shù)據(jù)。還計算了平均值的標準差(s.e.m)并以誤差條表示。為了促進不同構(gòu)建體之間的比較以及說明不同熒光蛋白的亮度變化，將每種實驗條件的加權(quán)中位熒光除以相同實驗設(shè)置下測試的所有條件中相同熒光團的最大加權(quán)中位熒光。示于補充信息中的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)圖代表來自單個實驗的補償數(shù)據(jù)。如上文所述，對細胞進行設(shè)門以排除細胞團塊和碎片(群P1)，并將活細胞的整個設(shè)門的群呈現(xiàn)于每個圖中。根據(jù)上述閾值設(shè)定每個亞群Q1至Q4的閾值。每個亞群中細胞的百分比如圖中所示。圖中的黑色十字表明了具體亞群的中位熒光。雖然本文描述并舉例說明了幾個創(chuàng)造性實施方案，然而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地預(yù)見到用于實施本文所描述的功能和/或獲得結(jié)果和/或一種或更多種優(yōu)勢的多種其他手段和/或構(gòu)建體，并且每個這樣的變化和/或修改都被認為是在本文所描述的創(chuàng)造性實施方案的范圍內(nèi)。更普遍地說，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，所有本文描述的參數(shù)、尺寸、材料和構(gòu)造意在作為示例，并且實際的參數(shù)、尺寸、材料和/或構(gòu)造將取決于使用該創(chuàng)造性教導的具體應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，或能夠僅使用常規(guī)實驗確定本文所描述的具體創(chuàng)造性實施方案的許多等同方案。因此，應(yīng)當理解的是，上述實施方案僅通過實例的方式展示，并且除非具體描述和要求保護，創(chuàng)造性實施方案可在附加權(quán)利要求及其等同方案的范圍內(nèi)實施。本公開內(nèi)容的創(chuàng)造性實施方案針對本文所述的每個單獨特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法。此外，如果這些特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法相互不一致，則任何2種或更多種所述特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法的組合均包括在本公開內(nèi)容的創(chuàng)造性范圍內(nèi)。本文所限定并使用的所有定義應(yīng)當理解為相比于詞典的定義、通過參考并入的文件中的定義，和/或所限定的術(shù)語的普通含義，以本文所限定并使用的所有定義為準。除非清楚指明相反，否則本文用于說明書和權(quán)利要求中的沒有數(shù)詞限定的表述應(yīng)理解為意指“至少一個/種”。本文用于說明書和權(quán)利要求中的短語“和/或”應(yīng)理解為意指這樣連接的要素的“任一個或兩者全部”，即要素在一些情況下相結(jié)合，而在其他情況下不結(jié)合。用“和/或”列出的多個要素應(yīng)以相同方式詮釋，即這樣連接的要素的“一個/種或更多個/種”。除了通過“和/或”分句具體限定的要素外的其他要素可以任選地存在，無論其是否與那些具體限定的要素相關(guān)。因此，作為一個非限制性實例，提及“A和/或B”，當其與開放式語句(如“包含”)聯(lián)用時，在一個實施方案中，可指僅有A(任選地包括除B以外的要素)；在另一個實施方案中，可指僅有B(任選地包括除A以外的要素)；而在另一個實施方案中，可指A與B兩者(任選地包括其他要素)；等。本文用于說明書和權(quán)利要求中的“或”應(yīng)理解為具有與上文限定的“和/或”相同的含義。例如，當分離列表中的項目時，“或”或者“和/或”應(yīng)解釋為包括性的，即包括許多要素或要素列表的至少一個/種，但也包括多于一個/種，并且任選地包括未列出的額外項目。僅有清楚相反指明的短語時，如“僅其中一個/種”或“確切地其中一個/種”或當用于權(quán)利要求中時的“由...組成”，指確切地包括許多要素或要素列表中的一個要素。通常，當前面是排他性短語，如“兩者之一”、“其中一個/中”、“僅其中一個/種”或“確切地其中一個/種”時，本文所使用的術(shù)語“或”僅應(yīng)當被解釋為表示排斥的選擇(即，“一個/種或另一個/種但并非兩者全部”)。當“基本上由...組成”用于權(quán)利要求中時，應(yīng)具有其在專利法領(lǐng)域使用時的普通含義。本文用于說明書和權(quán)利要求中的涉及一個/種或更多個/種要素列表的短語“至少一個/種”應(yīng)理解為意指選自該要素列表中的任何一個/種或更多個/種要素中的至少一個/種要素，但并非必須包括該要素列表內(nèi)所具體列出的各個/種和每個/種要素的至少一個/種，也不排除該要素列表中的要素的任意組合。該定義也允許除了短語“至少一個/種”所指的要素列表內(nèi)所具體限定的要素外的要素可以任選地存在，無論其是否與所具體限定的要素相關(guān)。因此，作為一個非限制性實例，“A和B中的至少一個/種”(或等同地，“A或B中的至少一個/種”，或等同地，“A和/或B中的至少一個/中”)在一個實施方案中可指至少一個/種，任選地包括多于一個/種，A而不存在B(并且任選地包括除B以外的要素)；在另一個實施方案中，指至少一個/種，任選地包括多于一個/種，B而不存在A(并且任選地包括除A以外的要素)；而在另一個實施方案中，指至少一個/種，任選地包括多于一個/種A，以及至少一個/種，任選地包括多于一個/種B(并且任選地包括其他要素)；等。應(yīng)當理解的是，除非清楚相反指明，在本文所要求保護的任何包括多于一個步驟或動作的方法中，所述方法的步驟或動作的順序并不必須受限于其中記載了所述方法的步驟或動作的順序。本文所公開的所有參考文獻、專利及專利申請均以其各自被引用的主題通過引用并入，在一些情況下其可包括整個文件。在權(quán)利要求以及上述說明書中，所有過渡短語如“包含”、“包括”、“帶有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容納”、“由...構(gòu)成”等應(yīng)理解為開放式的，即意指包括但不限于。只有過渡短語“由...組成”和“基本上...組成”應(yīng)分別為封閉的或半封閉的過渡短語，如美國專利局專利審查程序手冊，章節(jié)2111.03所闡釋的。參考文獻(下面的每一篇參考文獻均通過引用并入本文。)Alon，U.(2007).Networkmotifs:theoryandexperimentalapproaches.NatRevGenet8，450-461.Audibert，A.，Weil，D.，andDautry，F(xiàn).(2002).InvivokineticsofmRNAsplicingandtransportinmammaliancells.MolCellBio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