本發(fā)明屬于生物技術(shù)和病毒學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種基于腺病毒載體表達全長西妥昔單抗治療腫瘤的方法。

背景技術(shù)：

西妥昔單抗(cetuximab)是第一個在全球多個國家獲準(zhǔn)上市，是靶向作用于表皮生長因子受體(EGFR)的人鼠嵌合型lgG1單克隆抗體(Iressa:first angiogenesis inhibitor approved for the treatment of advanced NSCLC.Expert Rev Anticancer Ther，2003.3(3):p.257)。西妥昔單抗可與EGFR特異性結(jié)合，競爭性阻斷表皮生長因子和其配體的結(jié)合，并且，與EGFR結(jié)合的親和性是天然配體EGF的10倍。結(jié)合后可抑制EGFR的異源二聚體化，并下調(diào)其下游基因，阻斷PI3K-AKT，RAS-RAF-MAPK等信號傳導(dǎo)途徑，這些途徑在腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。西妥昔單抗還能使EGFR被內(nèi)吞，從而降低EGFR的表達。此外，還可能通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)殺死目標(biāo)細(xì)胞。西妥昔單抗通過以上這些途徑阻斷腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲以及血管生成，達到治療腫瘤的目的。

研究發(fā)現(xiàn)，許多直腸結(jié)腸癌、頭頸部癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、腎癌等患者的癌細(xì)胞都存在EGFR過表達，這就預(yù)示著西妥昔單抗可能成為這些癌癥的候選藥。目前，西妥昔單抗已經(jīng)作為一線治療藥物聯(lián)合相關(guān)的化療藥，用于轉(zhuǎn)移性直腸結(jié)腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的治療。同時，西妥昔單抗聯(lián)合其他化療藥治療非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性胰腺癌、晚期胃癌等也進入Ⅲ期臨床試驗。

目前，臨床上使用的西妥昔單抗是在哺乳動物細(xì)胞(鼠類骨髓瘤細(xì)胞)中培養(yǎng)生產(chǎn)的。此方法存在制備周期長，工藝復(fù)雜，雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定和抗性易丟失等缺陷，使得西妥昔單抗的制備成本較高，使用西妥昔單抗治療一 個療程的費用大概為2.4萬人民幣，一年則需要115萬人民幣，昂貴的費用使受益于西妥昔單抗的病人難以承擔(dān)。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)降低成本的制備西妥昔單抗的方法，以顯著性地降低臨床病人的治療成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于腺病毒載體表達全長西妥昔單抗治療腫瘤的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種表達全長西妥昔單克隆抗體的方法，所述方法包括：應(yīng)用腺病毒表達全長西妥昔單克隆抗體。

在一個優(yōu)選例中，所述方法中，由腺病毒載體來形成所述的腺病毒，所述的腺病毒載體中包含表達西妥昔單克隆抗體的元件。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，形成所述腺病毒的腺病毒載體以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68載體或E1和E3缺失的人Hu5載體作為骨架載體。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述的表達西妥昔單克隆抗體的元件依次(按照5’→3’順序)包括：啟動子，信號肽1編碼序列，西妥昔單克隆抗體重鏈編碼序列，連接序列，信號肽2編碼序列，西妥昔單克隆抗體輕鏈編碼序列，終止子。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述的啟動子包括：CASI啟動子，CMV啟動子；較佳地為CASI啟動子；或所述的終止子包括(但不限于)：SV40PloyA，BGH PloyA；較佳地為BGH PloyA。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述的信號肽1或信號肽2是分泌信號肽；較佳地包括：HLA-A*0201信號肽；較佳地，所述的信號肽1和信號肽2相同或不同。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述的連接序列包括：F2A，2A，IRES；較佳地為F2A。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述的西妥昔單克隆抗體重鏈編碼序列如SEQ ID NO:1中第1-1356位所示，或所述的西妥昔單克隆抗體輕鏈編碼序列如SEQ ID NO:1第1357-1998位所示。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，形成所述的腺病毒載體以E1和E3缺失 的黑猩猩型AdC68載體或人AdHu5載體作為骨架載體，所述的表達西妥昔單克隆抗體的元件被插入到該載體中被刪除的E1區(qū)域。

在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述的表達全長西妥昔單克隆抗體的方法是非診斷或治療性的方法。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種腺病毒表達載體，該載體以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68載體或人AdHu5載體作為骨架載體；且依次(按照5’→3’順序)包括以下表達西妥昔單克隆抗體的元件：啟動子，信號肽1編碼序列，西妥昔單克隆抗體重鏈編碼序列，連接序列，信號肽2編碼序列，西妥昔單克隆抗體輕鏈編碼序列，終止子。

在一個優(yōu)選例中，所述的腺病毒表達載體中，所述表達西妥昔單克隆抗體的元件被插入到該載體中被刪除的E1區(qū)域。

在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒表達載體中，所述的啟動子包括：CASI啟動子，CMV啟動子；較佳地為CASI啟動子；或所述的終止子包括(但不限于)：SV40PloyA。

在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒表達載體中，所述的信號肽1或信號肽2是分泌信號肽；較佳地包括：HLA-A*0201信號肽；較佳地，所述的信號肽1和信號肽2相同或不同。

在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒表達載體中，所述的連接序列包括：F2A，2A，IRES；較佳地為F2A。

在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒表達載體中，所述的西妥昔單克隆抗體重鏈編碼序列如SEQ ID NO:1中第1-1356位所示，或所述的西妥昔單克隆抗體輕鏈編碼序列如SEQ ID NO:1第1357-1998位所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒表達載體中，以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68載體作為骨架載體時，所述腺病毒表達西妥昔單抗的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；或以E1和E3缺失的人pHu5載體作為骨架載體時，所述腺病毒表達西妥昔單抗的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的腺病毒表達載體的用途，用于制備腺病毒，所述的腺病毒能表達全長西妥昔單克隆抗體。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種腺病毒，所述腺病毒由所述的腺病毒表達載體制備而成。

在一個優(yōu)選例中，將所述的腺病毒表達載體線性化后，轉(zhuǎn)入病毒生產(chǎn)細(xì)胞如HEK 293細(xì)胞，從而制備腺病毒。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的腺病毒的用途，用于制備抗腫瘤藥物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括所述的腺病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于表達全長西妥昔單克隆抗體的試劑盒，所述的試劑盒中包括：所述的腺病毒表達載體，或所述的腺病毒；或所述的抗腫瘤藥物。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、全長Cetuximab表達框示意圖。單抗基因插入腺病毒載體被刪除的E1區(qū)域，由CASI啟動子啟動表達，單抗重鏈lgG HC、輕鏈lgG LC前面分別帶有分泌信號肽HLA-A*0201，中間由F2A連接，后面帶有SV40 PloyA。

圖2、重組腺病毒質(zhì)粒酶切鑒定。A：重組腺病毒質(zhì)粒pAdC 68-CTB經(jīng)Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ、Mfe Ⅰ酶切鑒定；B：重組腺病毒質(zhì)粒pHu 5-CTB經(jīng)Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ酶切鑒定。

圖3、重組腺病毒基因組酶切鑒定。A：重組腺病毒AdC 68-CTB基因組經(jīng)Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ、Mfe Ⅰ酶切鑒定；B：重組腺病毒Hu 5-CTB基因組經(jīng)Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ酶切鑒定。

圖4、Western Bolt檢測重組腺病毒體外表達全長Cetuximab。10¹⁰vp/孔重組腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染HEK 293細(xì)胞，以10¹⁰vp/孔AdC68-empty、Hu5-empty為陰性對照，24h后收取細(xì)胞上清。以商業(yè)化Cetuximab為陽性對照。A為非還原條件下，全長單抗的表達；B為還原條件下，重鏈和輕鏈的分別表達。

圖5、ELISA檢測Cetuximab在體外的表達量。以10¹⁰vp、10⁹vp/孔重組腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染MRC 5細(xì)胞，以10⁸vp、10⁷vp/孔重組腺病毒感染HEK 293細(xì)胞，分別在3天、5天收取細(xì)胞上清。以10¹⁰vp、10⁹vp、10⁸vp、10⁷vp/孔空載腺病毒AdC68-empty、Hu5-empty為陰性對照。

圖6、間接免疫熒光檢測重組腺病毒所表達Cetuximab結(jié)合特異性。選取EGFR⁺的HCEpi C、NCI-H 508和EGFR^-的CHO細(xì)胞，以注射AdC68-CTB、Hu5-CTB小鼠血清為實驗組，AdC68-empty、Hu5-empty小鼠血清為陰性對照組，商業(yè)化Erbitux為陽性對照組。

圖7、間接ELISA檢測重組腺病毒所表達Cetuximab的親和力。以注射AdC68-CTB、Hu5-CTB小鼠血清為實驗組，商業(yè)化Erbitux為陽性對照，Cetuximab單抗的親和性通過檢測EC₅₀值進行比較。

圖8、MTT檢測重組腺病毒對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖的影響。結(jié)直腸癌細(xì)胞系DiFi和NCI-H508經(jīng)10⁷、10⁸和10⁹vp重組腺病毒處理72h后，MTT檢測細(xì)胞增殖活性。

圖9、裸鼠腫瘤模型評估重組腺病毒對結(jié)腸癌的抑制作用。A為早期治療組；B為晚期治療組。

圖10、NCI-H508腫瘤中增殖特異性蛋白Ki-67的免疫組化檢測。Ki-67陽性信號呈棕黃色，定位于腫瘤細(xì)胞胞核。A：晚期治療組Ki-67的檢測；B：早期治療組Ki-67的檢測。

圖11、pAdC68-△E1E3構(gòu)建示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)采用腺病毒載體、特別是E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68載體或人Hu5載體表達西妥昔單克隆抗體，可獲 得高表達，并且獲得的單克隆抗體生物活性良好，所生成的可重組表達西妥昔單克隆抗體的腺病毒能夠直接用于動物并達到有效的治療作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

現(xiàn)有技術(shù)中，西妥昔單克隆抗體的制備一般采用雜交瘤細(xì)胞表達的方法，生產(chǎn)過程復(fù)雜難以控制，產(chǎn)量有限，規(guī)模有限，抗體還易于失去活性或受到污染，采用真核表達系統(tǒng)成本高且表達困難。因此，本發(fā)明人對多種表達系統(tǒng)進行了研究，以尋找適合表達西妥昔單克隆抗體的系統(tǒng)，經(jīng)過大量研究篩選，意外地發(fā)現(xiàn)采用優(yōu)化的腺病毒表達系統(tǒng)來表達西妥昔單克隆抗體，表達效率高，表達穩(wěn)定，成本低廉，并且獲得的妥昔單克隆抗體的生物活性非常好，所生成的可重組表達西妥昔單克隆抗體的腺病毒能夠直接用于動物并達到有效的治療作用。本發(fā)明為臨床相關(guān)的腫瘤治療提供一種新方法。

腺病毒載體

由于腺病毒的基因組比較大，大約有36kb，使直接克隆重組腺病毒載體成為技術(shù)瓶頸。因此，本發(fā)明人開發(fā)了能通過酶切連接的快速方法直接構(gòu)建基于黑猩猩型腺病毒AdC68作為表達載體。此外，黑猩猩型腺病毒AdC6、AdC7和人腺病毒AdHu26、AdHu36等也是可用的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68載體或E1和E3缺失的人Hu5載體作為骨架載體。

單克隆抗體存在重鏈和輕鏈，如何高效地實現(xiàn)表達且能夠保留活性，本發(fā)明人進行了反復(fù)的設(shè)計研究，針對大量的表達元件進行篩選，最終優(yōu)化了適合的表達元件，包括啟動子、連接序列、信號肽等。因此作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的表達西妥昔單克隆抗體的元件依次(按照5’→3’順序)包括：啟動子，信號肽1編碼序列，西妥昔單克隆抗體重鏈編碼序列，連接序列，信號肽2編碼序列，西妥昔單克隆抗體輕鏈編碼序列，終止子。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用來自口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的核糖體跳躍序列(ribosomal skipping sequence 2A)實現(xiàn)抗體重鏈與抗體輕鏈的共表達。2A連接子具有自剪切效率高，上下游兩個基因表達平衡性好，結(jié)構(gòu)短小等優(yōu)點。在2A前面加入Furin蛋白酶酶切位點RAKR后，可 以除去2A自剪切后殘留在前端蛋白C端的序列，提高連接子的剪切效率，同時避免了2A殘留序列對前端蛋白表達的影響。RAKR與2A連接子構(gòu)成的序列簡稱F2A。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用CASI作為啟動子，其是由CMV、chicken-β-actin、ubiquitin C組成的，其能夠維持外源基因西妥昔單抗在肌肉中的持續(xù)表達。經(jīng)過本發(fā)明人大量的篩選，認(rèn)為CASI啟動子非常適用于進行西妥昔單抗的表達，其能夠極其有效地提高外源基因西妥昔單抗的表達量，并維持其在肌肉中的持續(xù)表達。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用HLA-A*0201作為信號肽，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，其能夠引導(dǎo)新生的多肽通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進入腔內(nèi)，最終被分泌到胞外。較佳地采用經(jīng)GC優(yōu)化的HLA-A*0201信號肽，可以提高抗體的分泌水平。

所述的表達載體通常還含有復(fù)制起點和/或標(biāo)記基因等。根據(jù)本發(fā)明的提示，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子(如CMV)上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀。

本發(fā)明中，所述的西妥昔單克隆抗體是本領(lǐng)域已知的抗體，其重鏈編碼序列可以如SEQ ID NO:1中第1-1356位所示；輕鏈編碼序列可以如SEQ ID NO:1第1357-1998位所示。在單抗的輕鏈或重鏈上，經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、但抗原結(jié)合能力與西妥昔單克隆抗體相同或近似的單克隆抗體也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的單克隆抗體，比如，可采用為了促進其半衰期、有效性、代謝和/或蛋白的效力而加以修飾或改良而形成的單克隆抗體。也就是說，任何不影響單克隆抗體的生物活性的輕鏈和重鏈序列變化形式都可用于本發(fā)明中。

本發(fā)明的上述各元件是可操作性連接的，從而有利于單抗的有效表達。如本文所用，所述的“可操作性相連(或連接)”是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列，這些序列的可操作性相連可產(chǎn)生功能性產(chǎn)物，如蛋白或RNA分子。

腺病毒

獲得所述腺病毒表達載體后，將之轉(zhuǎn)染病毒生產(chǎn)細(xì)胞，進行病毒的繁殖。轉(zhuǎn)染后的一段時間后，可以收獲病毒。所述的病毒生產(chǎn)細(xì)胞可以是本領(lǐng)域公知的各種能夠繁殖腺病毒的細(xì)胞，例如293細(xì)胞等。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，收獲的病毒可反復(fù)感染病毒生產(chǎn)細(xì)胞，持續(xù)傳代。病毒滴度(TCID₅₀)的測定可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法進行。所獲得的重組腺病毒也包含在本發(fā)明中。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；較佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的腺病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體。

如本文所用，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。

如本文所用，術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的如本文所用。

如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。

通常，可將所述腺病毒配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。

本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備?；钚猿煞?腺病毒)的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

在用于抑制哺乳動物腫瘤時，所述的腺病毒可全身性施用，或者局部施用， 具體可視腫瘤的種類、生長部位、進展程度等因素決定。

試劑盒或藥盒

基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種用于表達全長西妥昔單克隆抗體的試劑盒/藥盒，所述的試劑盒/藥盒中包括所述的腺病毒表達載體或所述的腺病毒。所述的試劑盒/藥盒還可包括病毒生產(chǎn)細(xì)胞(如293細(xì)胞)，培養(yǎng)基等。此外，所述的試劑盒/藥盒中還可包括說明表達方法后腺病毒使用方法的使用說明書。

本發(fā)明人檢測了利用本發(fā)明的系統(tǒng)表達獲得的西妥昔單抗的生物學(xué)活性，并在細(xì)胞水平與動物模型中檢測到其具有良好的抗腫瘤效果，為腫瘤的抗體治療提供一種新策略。

本發(fā)明的重組腺病毒載體生成的重組腺病毒能高效轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞、易于擴增及純化、毒性低，其表達效率高且長久。本發(fā)明的腺病毒載體表達重組西妥昔單抗生產(chǎn)工藝簡單、價格低廉、療效持久，優(yōu)于目前市場上其它方法的表達。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

I.材料與方法

1、主要試劑、菌株及實驗動物

所有的工具酶均購自New England Biolabs；LipofectatimeTM 2000、氨卞青霉素等均購自Invitrogen；引物合成于金斯瑞生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收和純化試劑盒均購自天根生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％胰酶、二抗購自Hyclone。羊抗人lgG-Kappa購自SouthernBiotech，兔抗人lgG Fc(HRP)、lgG H&L(HRP)購自Abcom，羊抗人lgG-FITC購自Santa Cruz，抗兔lgG(HRP)、抗羊lgG(HRP) 購自Sigma。

大腸桿菌菌株Stbl 2購自Invitrogen；腺病毒包裝細(xì)胞系HEK 293細(xì)胞、人結(jié)直腸癌細(xì)胞DiFi和NCI-H508(EGFR⁺)均購自ATCC；CHO中國倉鼠卵巢細(xì)胞(EGFR^-)、人胚肺細(xì)胞MRC 5和人結(jié)腸上皮細(xì)胞HCEpi C均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。實驗小鼠6-8周齡Balb/C female裸鼠購自上海靈暢生物技術(shù)有限公司。

2、質(zhì)粒pAdC68-△E1E3和E1和E3刪除的pHu5的構(gòu)建

(i)質(zhì)粒pNEB193-KE的構(gòu)建

根據(jù)pNEB193載體(New England Biolabs)上的多克隆位點和腺病毒AdC68基因組的序列，設(shè)計擴增KE片段的引物(表1)，PCR擴增目的產(chǎn)物KE片段。EcoR I和Kpn I雙酶切PCR擴增的KE片段，瓊脂糖凝膠純化KE片段，連接至經(jīng)相同酶切的pNEB193載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，經(jīng)酶切和測序鑒定得到pNEB193-KE。

表1、PCR引物序列

(ii)質(zhì)粒pNEB193-KE-AK的構(gòu)建

Asc I和Kpn I雙酶切AdC68基因組(GenBank登錄號AC_000011)，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收AK片段，連接至經(jīng)相同酶切的pNEB193-KE載體，轉(zhuǎn)化入Stbl2感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，經(jīng)酶切鑒定得到pNEB193-KE-AK。

(iii)質(zhì)粒pNEB193-KE-AK-XA的構(gòu)建

Xba I和Asc I雙酶切AdC68基因組，由于Asc I在腺病毒AdC68存在三個酶切位點，對Asc I進行部分酶切，置于37℃酶切AdC68基因組10s，低熔點凝膠回收酶切的最大的XA片段，連接至經(jīng)相同酶切的pNEB193-KE-AK載體，酶切鑒定得到pNEB193-KE-AK-XA。

(iv)質(zhì)粒pNEB193-PX的構(gòu)建

根據(jù)pNEB193載體上的多克隆位點和腺病毒基因組的序列，設(shè)計擴增PX片段的引物(表1)，PCR擴增目的產(chǎn)物PX片段。Pme I和Xba I雙酶切PCR擴增回收的PX片段，瓊脂糖凝膠回收目的產(chǎn)物PX片段，連接至經(jīng)相同酶切的pNEB193載體，轉(zhuǎn)化入Stbl2感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，其中靠近腺病毒AdC68左端ITR的區(qū)域經(jīng)測序鑒定。Xba I酶切腺病毒AdC68基因組，低熔點瓊脂糖凝膠回收獲得AdC68中的Xba I-Xba I部分，并替換連接至經(jīng)Xba I酶切的pNEB193-PX載體中，轉(zhuǎn)化入Stbl2感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，酶切鑒定得到pNEB193-PX。

(v)刪除pNEB193-PX質(zhì)粒中AdC68基因組中E1部分

EcoR I和Mfe I雙酶切pShuttle-CMV質(zhì)粒(Clontech Laboratories，Inc)，依據(jù)同尾酶的性質(zhì)將空載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中得到pShuttle-EM的質(zhì)粒。根據(jù)pShuttle-EM質(zhì)粒的序列設(shè)計擴增Linker的引物(表1)，PCR擴增Linker產(chǎn)物。SnaB I和Nde I雙酶切PCR擴增的Linker片段，瓊脂糖凝膠回收Linker產(chǎn)物，連接至經(jīng)相同酶切的pNEB193-PX載體(通過對AdC68基因組序列分析，利用SnaB I和Nde I兩個酶切位點能將其E1部分序列刪除)，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，經(jīng)酶切鑒定得到pNEB193-PX-Linker。

Linker的序列插入在AdC68基因組第459-3011位之間，替換E1的大部份序列。Linker的序列如下(SEQ ID NO:11)：

cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagacc cataataccc ataatgccat ttcattacct 60

ctttctccgc acccgacata gatgaattgt cggtcaagcc ttgccttgtt gtagcttaaa 120

ttttgctcgc gcactactca gcgacctcca acacacaagc agggagcaga tactggctta 180

actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca taggggatcg ggagatctga 240

gctttcgcta ccttaggacc gttatagtta cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 300

gcggaac 307

(vi)pAdC68-△E1質(zhì)粒構(gòu)建

Xba I和Pme I雙酶切pNEB193-PX-Linker質(zhì)粒DNA，并利用瓊脂糖凝膠回收PX-Linker片段，連接至經(jīng)相同酶切的低熔點瓊脂糖凝膠回收的pNEB193-KE-AK-XA載體，轉(zhuǎn)化入Stbl2感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，經(jīng)酶切鑒定得到pAdC68-E1-deleted(pAdC68-△E1)。

(vii)pAdC68-△E1E3構(gòu)建

以質(zhì)粒pAdC68-△E1為模板，根據(jù)上游引物F：tctcctagggaggaacaacaagca(SEQ ID NO:12)和下游引物R：tggcctaggatttaaataGTCGTTGTCGCAGTGGTTG(SEQ ID NO:13)，PCR得到片段AA，同時，用Avr Ⅱ酶切質(zhì)粒pAdC68-△E1和片段AA產(chǎn)生相同的粘性末端，用低熔點連接的方法得到重組腺病毒質(zhì)粒pAdC68-△E1E3，示意圖如圖11。

E3區(qū)被域刪除的部分是24679-28414位序列。

(viii)E1和E3刪除的pHu5(pHu5-△E1/E3)構(gòu)建

E1和E3刪除的pHu5的構(gòu)建方法與pAdC68相同。

3、重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建

全長Cetuximab(重、輕鏈序列參見GenBank登錄號GM685459.1和GM685461.1。重、輕鏈前端各攜帶一HLA-A*0201信號肽(其序列為atggccgtgatggcgccgcggaccctggtcctcctgctgagcggcgccctcgccctgacgcagacctgggccggg(SEQ ID NO:14))，并由F2A連接，其編碼序列其插入PU57質(zhì)粒中，成為PUC57-CTB質(zhì)粒，其全長序列如SEQ ID NO:2。

將合成載體PUC57-CTB質(zhì)粒經(jīng)Avr Ⅱ和Cla Ⅰ雙酶切，同時將PUC-Promoter(啟動子CASI序列見GenBank登錄號JB974538.1，SV40ployA序列見JB974550.1，將其插入PU57質(zhì)粒中，成為PUC-Promoter)經(jīng)Avr Ⅱ和Cla Ⅰ雙酶切得到具有相同粘性末端、線性化的載體，使用T4DNA連接酶對上述兩產(chǎn)物的粘端進行連接。按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，在含卡那抗性的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。采用PCR、酶切等方法進行鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒，命名為pShuttle-CTB。

4、重組腺病毒質(zhì)粒的制備

將pShuttle-CTB質(zhì)粒經(jīng)PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切，同時將腺病毒載體pAdC68-△E1/E3經(jīng)PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切得到具有相同粘性末端、線性化的載體。利用瓊脂糖凝膠分離并回收目的片段，同時，利用低熔點瓊脂糖凝膠分離腺病毒載體，將含腺病毒載體的凝膠65℃孵育5分鐘，待完全溶解后用T4DNA連接酶對上述兩產(chǎn)物進行粘端連接。在感受態(tài)菌Stbl 2中按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，隨后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂至含氨芐抗性的瓊脂糖平板上，于30℃培養(yǎng)24h，挑選克隆于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中30℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用1％瓊脂糖凝膠進行電泳遷移率分析，并進行Bgl Ⅱ、Xho I、Mfe I酶切圖譜分析。將所得的陽性重組腺病毒質(zhì)粒菌液擴大培養(yǎng)(1：1000)獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，命名為pAdC68-CTB，其全長序列如SEQ ID NO:3。

克隆重組腺病毒pHu5-CTB方法同上，即將pShuttle-CTB質(zhì)粒經(jīng)PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切，同時將腺病毒載體pHu5-△E1/E3經(jīng)PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切、連接獲得，并進行Bgl Ⅱ、HindⅢ、Kpn Ⅰ酶切圖譜分析。pHu5-CTB的全長序列如SEQ ID NO:4。

5、重組腺病毒的制備

用限制性內(nèi)切酶Pac I線性化重組腺病毒質(zhì)粒pAdC68-CTB，按LipofectatimeTM 2000說明書上的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，37℃、5％CO₂培養(yǎng)8-12天，出現(xiàn)明顯噬斑。待細(xì)胞變圓、懸浮后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融三次后取病毒上清感染HEK 293細(xì)胞(25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶)。然后重復(fù)以上步驟，收毒后1：3擴增病毒(感染一個75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶)，之后收毒后按1：6擴增病毒(感染三個150cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶)，最后收毒后按約1：9擴增病毒(約25-30個150cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶)，利用氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒[16]，測OD值，加入終濃度為10％的甘油存于-80℃。重組腺病毒Hu5-CTB制備方法同上。

提取病毒基因組AdC68-CTB，并進行Bgl Ⅱ、Xho I、Mfe I酶切圖譜分析。提取病毒基因組Hu5-CTB，并進行Bgl Ⅱ、HindⅢ、Kpn Ⅰ酶切圖譜分析。

6、Western blot檢測重組腺病毒表達Cetuximab單抗

將重組腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB稀釋至濃度10¹¹vp/ml，然后用100ul重組腺病毒感染六孔板HEK 293細(xì)胞，即每孔10¹⁰vp腺病毒，以每孔10¹⁰vp AdC68-empty(空質(zhì)粒對照)、Hu5-empty(空質(zhì)粒對照)為陰性對照，24h后收獲細(xì)胞上清，通過非還原型Western blot方法檢測Cetuximab目的蛋白全長的表達，通過還原型Western blot方法檢測Cetuximab重鏈、輕鏈的表達。其中，檢測抗體為HRP標(biāo)記鼠抗人IgG1(H+L)二抗。

7、檢測Cetuximab體內(nèi)外表達量

將處于對數(shù)生長期的MRC 5、HEK 293細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，37℃、5％CO₂培育24h，待細(xì)胞密度長至80％時，分別以10¹⁰vp、10⁹vp/孔重組腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染MRC 5，以10⁸vp、10⁷vp/孔重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞，分別在3天、5天收取細(xì)胞上清。以10¹⁰vp、10⁹vp、10⁸vp、10⁷vp/孔空載腺病毒AdC68-empty、Hu5-empty為陰性對照。

采用5-6周齡的Balb/c裸鼠，將小鼠隨機分為4組：AdC68-CTB、Hu5-CTB、AdC68-empty和Hu5-empty，每組6只小鼠。每組以5×10¹⁰vp/100ul重組腺病毒單次肌肉注射，定期采血檢測體內(nèi)抗體表達。

間接ELISA檢測蛋白的表達量：用50ng羊抗人lgG Kappa 50ul/孔，4℃過夜包ELISA板，50ul/孔5％脫脂牛奶37℃封閉2h，將細(xì)胞上清稀釋10倍，血清稀釋400倍，以50ul/孔，4℃孵育2h。HRP標(biāo)記的鼠抗人lgG Fc二抗1：10000稀釋50ul/孔，37℃孵育1h。其中，以商業(yè)化的Cetuximab以每孔10ng為起始量，2倍梯度稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8、檢測重組腺病毒所表達Cetuximab結(jié)合特異性

HCEpi C、NCI-H 508(EGFR⁺)和CHO(EGFR^-)細(xì)胞鋪于24孔板內(nèi)，37℃、5％CO₂培育24h后，將細(xì)胞用PBS清洗3次后，用4％多聚甲醛固定5分鐘。細(xì)胞先經(jīng)5％脫脂奶粉37℃封閉2h，然后分別用經(jīng)重組腺病毒免疫的小鼠血清和商業(yè)化Cetuximab 4℃孵育2h，然后用FITC標(biāo)記的羊抗人lgG二抗37℃孵育1h，TBST洗三次后，DAPI染色5min，最后在熒光顯微鏡下觀察。

9、檢測重組腺病毒所表達Cetuximab的親和力

用60ng EGFR 50ul/孔包ELISA板4℃過夜，5％脫脂牛奶封閉2h后，將重組腺病毒表達單抗和商業(yè)化Cetuximab以每孔80ng為起始量，2倍梯度稀釋11個梯度，即每孔稀釋至0.078125ng，50ul/孔，4℃孵育2h。將HRP標(biāo)記的鼠抗人二抗1：10000稀釋，50ul/孔，37℃孵育1h后，每孔加入TMB顯色液50μl，避光顯色5min，注意顏色變化，避免顯色過度，及時加入50μl終止液。酶標(biāo)儀檢測OD450數(shù)值。

10、檢測重組腺病毒對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖的影響

用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)檢測細(xì)胞的增殖能力：收集對數(shù)生長期的DiFi和NCI-H508細(xì)胞，按1×10⁴/孔，鋪于96孔板中，每組6個復(fù)孔，24h后感染10⁹、10⁸、10⁷vp/孔的重組腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB，以相同劑量的AdC68-empty、Hu5-empty做陰性對照，37℃、5％CO₂培育72h后加入20ul、孔的MTT，常規(guī)培養(yǎng)4h后棄上清，每孔加入150ul DMSO，振搖10min，酶標(biāo)儀檢測OD490數(shù)值，以時間為橫坐標(biāo)，OD490值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖柱狀圖。

11、裸鼠腫瘤模型評估重組腺病毒對結(jié)腸癌的抑制作用

取對數(shù)生長期的DiFi、NCI-H508細(xì)胞，用Martixgel重懸，計數(shù)后按1×10⁷個細(xì)胞/100ul注射于裸鼠后肢右側(cè)皮下，恒溫、通風(fēng)、無菌條件下飼養(yǎng)。當(dāng)移植瘤長到一定大小時(NCI-H508細(xì)胞腫瘤模型的早期治療組大小達到150cm³，晚期治療組達到600cm³；DiFi細(xì)胞腫瘤模型的早期治療組大小達到80cm³，晚期治療組達到300cm³)，將小鼠隨機分為5組：AdC68-CTB、Hu5-CTB、Erbitux(商業(yè)化產(chǎn)品，購自Merck)、AdC68-empty、Hu5-empty，其中，陰性對照組每組6只小鼠，剩余每組10只小鼠。每組以5×10¹⁰vp/100ul重組腺病毒單次肌肉注射，Erbitux組以每只20mg/kg的Erbitux一周兩次腹腔注射。開始治療后，每3天測量一次腫瘤大小和體重，以“最大徑×最小徑²×0.5”公式計算腫瘤體積。

觀察至21天，安樂死小鼠，取瘤體標(biāo)本，以4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，免疫組化檢測Ki-67、p-EGFR的表達。

II.實施例

實施例1、重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

Cetuximab是一個人鼠嵌合抗EGFR抗體，用于治療結(jié)直腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等癌癥的單克隆抗體。本發(fā)明構(gòu)建AdC68-△E1/E3、Hu5-△E1/E3表達全長Cetuximab基因，以結(jié)直腸癌動物模型為例，考核重組腺病毒表達Cetuximab單抗治療腫瘤的效果。

如圖1所示，攜帶信號肽(HLA-A*0201信號肽)的重、輕鏈間用F2A連接，全長單抗經(jīng)Avr Ⅱ和Cla Ⅰ雙酶切后，連接到攜帶CASI啟動子和SV40polyA的穿梭載體pUC57上，構(gòu)建獲得穿梭質(zhì)粒pUC57-CASI-CTB。pUC57-CASI-CTB、pAdC68-△E1/E3或pHu5-△E1/E3經(jīng)PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切以及連接后，得到pAdC68-CTB或pHu5-CTB。

得到的重組腺病毒質(zhì)粒pAdC68-CTB用Bgl Ⅱ、Xho I、Mfe I酶切鑒定分析，pHu5-CTB用Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ酶切鑒定分析，見圖2，與酶切圖譜片段大小分析相同，證明重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建正確。

實施例2、重組腺病毒的獲得及鑒定

重組腺病毒質(zhì)粒pAdC68-CTB、pHu5-CTB經(jīng)Pac I線性化后，用LipofectatimeTM 2000轉(zhuǎn)入HEK 293細(xì)胞中，待培養(yǎng)8-12天，出現(xiàn)噬斑，待細(xì)胞變圓、懸浮后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融三次后取病毒上清感染HEK 293細(xì)胞(25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶)。重復(fù)以上步驟至收集適量病毒(約27-30個150cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶)，利用氯化銫密度梯度離心法純化腺病毒AdC68-CTB，重組腺病毒Hu5-CTB制備方法同上。最終，本發(fā)明人獲得重組腺病毒AdC68-CTB濃度為8.5×10¹²vp/ml，Hu5-CTB濃度為4.2×10¹²vp/ml。

提取腺病毒基因組AdC68-CTB，并進行Bgl Ⅱ、Xho I、Mfe I酶切圖譜分析，見圖3A。提取病毒基因組Hu5-CTB，并進行Bgl Ⅱ、HindⅢ、Kpn Ⅰ酶切圖譜分析，見圖3B，與圖譜比較顯示酶切片段正確。

實施例3、Western blot檢測重組腺病毒表達Cetuximab單抗

10¹⁰vp/孔重組腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染HEK 293細(xì)胞，以 10¹⁰vp/孔AdC68-empty、Hu5-empty為陰性對照，24h后收取細(xì)胞上清。通過非還原型Western blot方法檢測Cetuximab目的蛋白全長的表達，以商業(yè)化的Erbitux為陽性對照，見圖4A，可以看到AdC68-CTB、Hu5-CTB和Erbitux在170kb與130kd之間有一條特異性條帶，即152kd的目的蛋白，而陰性對照組則無。

通過還原型Western blot方法檢測Cetuximab重鏈、輕鏈的表達，以商業(yè)化的Erbitux為陽性對照，見圖4B，可以看到在55kd附近和25kd附近各有一特異條帶，即目的蛋白的重鏈和輕鏈，證明本發(fā)明人成功獲得了正確的目的蛋白。

實施例4、ELISA檢測Cetuximab在體內(nèi)外的表達

以10¹⁰vp、10⁹vp/孔重組腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染MRC 5，以10⁸vp、10⁷vp/孔重組腺病毒感染HEK 293細(xì)胞，分別在3天、5天收取細(xì)胞上清。以10¹⁰vp、10⁹vp、10⁸vp、10⁷vp/孔空載腺病毒AdC68-empty、Hu5-empty為陰性對照。

通過間接ELISA檢測各細(xì)胞系中單抗的表達量，以商業(yè)化Erbitux繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。體外表達見圖5。如圖5上圖，在非復(fù)制型細(xì)胞系MRC 5中，第3天時，低劑量AdC68-CTB表達量達到368.8ng/ml，高劑量為598.9ng/ml；低劑量Hu5-CTB幾乎不表達，高劑量為648.1ng/ml；在第5天時，AdC68-CTB高劑量組與低劑量組表達量幾乎相當(dāng)，分別為792.9ng/ml、784.5ng/ml，Hu5-CTB高劑量與低劑量組分別為382.4ng/ml、760.1ng/ml。

如圖5下圖，在復(fù)制型細(xì)胞系HEK 293中，第3天時，低劑量AdC68-CTB表達量達到945.3ng/ml，高劑量為1803.9ng/ml；低劑量Hu5-CTB為121.58，高劑量為1925.2ng/ml；在第5天時，AdC68-CTB高劑量組與低劑量組表達量幾乎相當(dāng)，分別為2448.5ng/ml、2378.3ng/ml，Hu5-CTB高劑量與低劑量組分別為2334.1ng/ml、2715.4ng/ml。

實施例5、間接免疫熒光檢測重組腺病毒所表達Cetuximab結(jié)合特異性

AdC68-CTB、Hu5-CTB表達的Cetuximab是一種抗EGFR的單抗，能夠特異性識別細(xì)胞表面表達的EGFR。

如圖6所示，在EGFR⁺的HCEpi C、NCI-H 508細(xì)胞表面可以看到很強的FITC熒光信號，這說明表達的抗體可以與細(xì)胞表面的EGFR結(jié)合。EGFR^-的CHO細(xì)胞表面沒有觀察到熒光信號，這說明由于缺少EGFR的表達，Cetuximab不能與CHO細(xì)胞結(jié)合。而商業(yè)化的Erbitux在EGFR⁺的細(xì)胞表面具有相同的FITC熒光信號強度，這說明，重組腺病毒表達的單抗與商業(yè)化的單抗具有相同的活性。

實施例6、間接ELISA檢測重組腺病毒所表達Cetuximab的親和力

通過Binding ELISA計算重組腺病毒與商業(yè)化Erbitux的EC₅₀值，從而比較其親和力。

如圖7所示，AdC68-CTB、Hu5-CTB表達的單抗EC50值分別為0.250和0.272，而商業(yè)化Erbitux的EC₅₀值為0.264，并沒有顯著性差異，顯示重組腺病毒表達的單抗與商業(yè)化單抗的結(jié)合EGFR的親和性并沒有差異。

實施例7、MTT檢測重組腺病毒對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖的影響

為了評估重組腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB能否抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，本發(fā)明人通過MTT實驗評估了其對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。

結(jié)果顯示，10⁹、10⁸、10⁷的AdC68-CTB、Hu5-CTB都能顯著性抑制DiFi、NCI-H 508細(xì)胞的增殖，見圖8，證明重組腺病毒表達單抗在體外對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。

實施例8、裸鼠腫瘤模型評估重組腺病毒對結(jié)腸癌的抑制作用

重組腺病毒在細(xì)胞水平對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用得到驗證，本發(fā)明人通過裸鼠腫瘤模型進行腫瘤的早期和晚期治療，進一步探討重組腺病毒在體內(nèi)對結(jié)直腸癌的抑制作用。在早期治療組中，DiFi腫瘤模型和NCI-H508腫瘤模型中AdC68-CTB、Hu5-CTB和Erbitux組都能顯著性抑制腫瘤的生長，見圖9A。

其中，在DiFi腫瘤模型中，AdC68-CTB組經(jīng)治療后15天，10只小鼠中已有6只腫瘤完全消失；Hu5-CTB組經(jīng)9天治療后，10只小鼠中已有5只腫瘤完全消失。在NCI-H508腫瘤模型晚期治療組中，治療21天后，AdC68-CTB、 Hu5-CTB和Erbitux組都能顯著性抑制腫瘤的生長，見圖9B。同時，小鼠體重并無顯著性下降，小鼠體征正常，說明腺病毒和Cetuximab單抗并不會對小鼠產(chǎn)生不良影響。對比早期治療組和晚期治療組，早期治療組的效果明顯優(yōu)于晚期治療組，所以早治療容易獲得較好的療效。

取腫瘤組織做免疫組化，檢測增殖特異性蛋白Ki-67的表達，如圖10所示，治療組AdC68-CTB、Hu5-CTB和Erbitux與對照組相比，Ki-67蛋白表達都有顯著降低。

討論

Cetuximab作為第一個在全球多個國家獲準(zhǔn)上市，廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等癌癥的單抗，已經(jīng)被證明有很好的療效。本發(fā)明人進一步成功證明了用重組腺病毒表達全長Cetuximab通過單次肌肉注射給藥后，在裸鼠的結(jié)直腸癌模型中具有良好抑癌效果。

一般認(rèn)為通過基因工程的方法表達生物大分子時，很難保證其生物活性，因而產(chǎn)生一個問題：本發(fā)明人應(yīng)用腺病毒載體表達單克隆抗體用于基因治療是否有效。本發(fā)明人的研究結(jié)果表明，腺病毒表達抗體的基因治療方法完全可行。首先，通過間接免疫熒光實驗本發(fā)明人證明了腺病毒表達的單抗與商業(yè)化單抗相似，都與細(xì)胞表面的EGFR有特異性的親和作用；然后，本發(fā)明人進一步通過Binding ELISA發(fā)現(xiàn)腺病毒表達的單抗與商業(yè)化單抗具有相似的EC₅₀值，證明其與商業(yè)化單抗對EGFR具有相同的親和力。同時，體外對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制實驗和體內(nèi)對裸鼠腫瘤的抑制實驗都表明，體內(nèi)外腺病毒表達的全長單抗都具有生物活性。以上各種實驗證明重組腺病毒載體表達Cetuximab單抗具有高表達效能，表達的單抗具有高度的生物活性，在腫瘤動物模型中，重組腺病毒可明顯抑制腫瘤生長，甚至達到治愈效果。

目前在臨床上，Cetuximab單抗的使用劑量為一星期輸注一次，起始劑量是400mg每平方米體表面積，之后每周的劑量為250mg每平方米體表面積，使用劑量大且頻繁[17]。同時，單克隆抗體的制備、純化過程繁瑣，要求嚴(yán)格，導(dǎo)致單抗的價格昂貴，使受益于該單抗的病人在接受治療時受到極大限制。由于腺病毒制備、純化簡單、產(chǎn)量高、安全性好、外源表達時間長等特點，因此本發(fā)明人研發(fā)的腺病毒表達Cetuximab單抗成本低，療效好，可充分滿足 臨床病人的需求。另外，本發(fā)明人克隆于腺病毒載體的Cetuximab單抗是一種可分泌的蛋白，因此，本發(fā)明人除了可以將重組腺病毒直接用于注射治療外，還能將重組腺病毒感染適宜細(xì)胞后收獲高濃度的Cetuximab的單抗，然后以純化的單抗應(yīng)用于腫瘤治療或其它臨床與科研。綜上，本發(fā)明人研發(fā)的重組腺病毒載體表達Cetuximab單抗為臨床相關(guān)腫瘤的治療與研究提供了一種有效的新手段，并具有巨大的市場發(fā)展前景。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。