本發(fā)明涉及微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寡雄腐霉遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
寡雄腐霉屬于卵菌門腐霉科腐霉屬，是一種土壤習(xí)居型腐生菌，其能夠在多種重要的農(nóng)作物根圍定殖，對植物和動物都沒有毒性，對環(huán)境安全。寡雄腐霉的菌絲可以寄生于病原菌體內(nèi)，干擾寄主的代謝活動，消耗細(xì)胞內(nèi)的養(yǎng)分，造成病菌死亡，同時，還能合成色胺，色氨酸，吲哚乙酸等生長活性物質(zhì)，促進(jìn)植物生理代謝，養(yǎng)分吸收和生長發(fā)育。寡雄腐霉不僅對多數(shù)致病真菌有很強(qiáng)的寄生或拮抗作用，并且能誘導(dǎo)農(nóng)作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，是一種非常有應(yīng)用價值的生防真菌。對其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究利用，特別是從分子水平對其進(jìn)行基因功能利用、遺傳性狀改良等方面研究勢在必行。
農(nóng)桿菌是廣泛存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，其細(xì)胞中存在Ti質(zhì)粒，包含可轉(zhuǎn)移的T-DNA區(qū)域。在農(nóng)桿菌侵染受體細(xì)胞后，T-DNA可與受體材料的基因組DNA結(jié)合并穩(wěn)定遺傳。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法最先也是最廣泛地應(yīng)用于植物，近年來也多為成功的應(yīng)用于絲狀真菌。與傳統(tǒng)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法對受體材料要求簡單、能得到較多單拷貝的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子、轉(zhuǎn)化率更高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定遺傳性高，此種方法更適合于絲狀真菌的DNA插入突變、基因標(biāo)記、基因改造等方面的研究。
雖然絲狀真菌轉(zhuǎn)化的基本過程相同，但不同真菌轉(zhuǎn)化所需要的轉(zhuǎn)化參數(shù)存在差異，需要針對不同真菌的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行摸索。目前國內(nèi)外未見關(guān)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寡雄腐霉遺傳轉(zhuǎn)化研究的報道。參考其他絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法無法順利進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法中，農(nóng)桿菌與侵染對象混合后采用硝酸纖維素膜或?yàn)V紙等輔助的固體培養(yǎng)方式對轉(zhuǎn)染的細(xì)菌或真菌進(jìn)行共培養(yǎng)及選擇培養(yǎng)，需要在培養(yǎng)基平板上鋪膜，揭膜再鋪膜的一系列操作步驟，過程繁雜，易污染，容易降低轉(zhuǎn)化率，對實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果造成巨大影響，這一方法亟待改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寡雄腐霉遺傳轉(zhuǎn)化的方法，通過此方法可得到寡雄腐霉工程菌株，可用于從分子水平上進(jìn)行寡雄腐霉基因功能、基因改良等相關(guān)基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究應(yīng)用，并且簡化、優(yōu)化了轉(zhuǎn)化后抗性菌株培養(yǎng)篩選階段的程序，提高了轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明的內(nèi)容，是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寡雄腐霉遺傳轉(zhuǎn)化的方法，具體步驟如下：
（1）寡雄腐霉菌絲孢子懸浮液制備。
將寡雄腐霉菌絲接種在PDA平板上培養(yǎng)，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM沖洗平板，將平板上的寡雄腐霉孢子及部分菌絲沖洗下來，制備為寡雄腐霉孢子菌絲懸浮液。
作為優(yōu)選，菌絲孢子懸浮液的濃度為1×106～7個/mL。
作為優(yōu)選，誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM為：PDB+300uM乙酰丁香酮，pH值為5.0。
（2）包含目的基因載體的農(nóng)桿菌侵染用菌液制備。
從農(nóng)桿菌工程菌株抗性平板上挑取單克隆，于5ml LB（Rif+相應(yīng)載體抗生素）液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)活化；吸取上述菌液于新的LB（Rif+相應(yīng)載體抗生素+乙酰丁香酮）液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大10倍培養(yǎng)； 4℃，5000rmp離心10min，收集菌體，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM重懸稀釋菌體，最終獲得的農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.3～0.7。
作為優(yōu)選，誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM為：PDB+300uM乙酰丁香酮，pH值為5.0。
作為優(yōu)選，農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為 0.6。
（3）農(nóng)桿菌菌液侵染寡雄腐霉懸浮液。
上述獲得的含有目的基因載體的農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉懸浮液混合共培養(yǎng)，使農(nóng)桿菌侵染寡雄腐霉，將目的基因?qū)牍研鄹怪小＾r(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉懸浮液比例為：1～10 ：1。共培養(yǎng)條件為：避光，25℃， 60rmp培養(yǎng)不少于24h。
作為優(yōu)選，共培養(yǎng)時間為48-96h。
（4）恢復(fù)培養(yǎng)。
向上述農(nóng)桿菌與寡雄腐霉混合菌液中加入細(xì)菌抗生素恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26℃,120rmp培養(yǎng)24～48h。
作為優(yōu)選，加入的細(xì)菌抗生素為頭孢霉素，濃度為200 mg/L。
（5）轉(zhuǎn)化子的篩選。
經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的寡雄腐霉菌液，離心收集菌體，用PDB重懸，涂布添加有抗性選擇壓的PDA平板，于26℃培養(yǎng)，抗性選擇壓篩選寡雄腐霉轉(zhuǎn)化子。
將抗性單菌落接種于新的添加有抗性選擇壓的PDA平板，于26℃培養(yǎng)。待菌絲生長鋪滿平板，從邊緣挑取菌絲接種于無選擇壓的PDA平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)以檢測其穩(wěn)定性，將剩余寡雄腐霉抗性菌體收集提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測其目的基因插入與否。
本發(fā)明采用液體共培養(yǎng)及液體恢復(fù)培養(yǎng)的方式將含有目的基因載體的農(nóng)桿菌侵染菌液與寡雄腐霉菌絲孢子懸浮液以適當(dāng)比例混合侵染后進(jìn)行共培養(yǎng)以及恢復(fù)培養(yǎng)，直接將菌液離心收集，涂布于添加抗性選擇壓的平板上篩選寡雄腐霉抗性轉(zhuǎn)化子，將抗性轉(zhuǎn)化子單克隆菌體純化培養(yǎng)并鑒定。此發(fā)明的方法中添加了恢復(fù)培養(yǎng)階段，有利于除去農(nóng)桿菌并使被侵染后的寡雄腐霉特別是寡雄腐霉原生質(zhì)體恢復(fù)生長活力；采用液體共培養(yǎng)及液體恢復(fù)培養(yǎng)的方式，省去了共培養(yǎng)及恢復(fù)培養(yǎng)階段的平板制備及鋪膜、揭膜程序，簡化了操作流程，減少了污染機(jī)會，并且方便挑取抗性單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)與鑒定。本發(fā)明首次對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寡雄腐霉的基因遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，提供了一套簡單便行的轉(zhuǎn)化方法，為利用該生防真菌的功能基因及對其性狀進(jìn)行改造提供了研究途徑。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施實(shí)例有助于此領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
以下實(shí)驗(yàn)選用轉(zhuǎn)化載體的抗性篩選標(biāo)記為：Kan抗性基因和Bar抗性基因；載體上包含：GFP基因，gpdA啟動子，trpC終止子。
以下實(shí)例所選用農(nóng)桿菌菌株為EHA105，LBA4404，AGL1，以及使用的寡雄腐霉菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。
以下實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基配方如下：
PDA：馬鈴薯200 g/L，切塊煮爛，用紗布過濾掉馬鈴薯殘渣，加入葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L，用水定容至1L。高壓滅菌待用。
PDB：馬鈴薯200 g/L，切塊煮爛，用紗布過濾掉馬鈴薯殘渣，加入葡萄糖20g/L，用水定容至1L。高壓滅菌待用。
IM滲透培養(yǎng)基：PDB+300 uM乙酰丁香酮，pH值為5.0。
實(shí)施例一采用寡雄腐霉菌絲孢子懸液進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
（1）將寡雄腐霉菌絲接種在PDA平板培養(yǎng)基上，26℃，培養(yǎng)6d，用2～4mL 誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM沖洗平板，將平板上的寡雄腐霉孢子及部分菌絲沖洗下來，使成為濃度1×107個/mL的孢子菌絲懸浮液。
（2）從含有目的基因載體的農(nóng)桿菌工程菌株抗性平板上挑取單克隆，于5ml LB（50mg/L 利福平Rif + 50mg/L 卡那霉素Kan）液體培養(yǎng)基中，28℃，200rmp振蕩培養(yǎng)20h；吸取上述菌液2mL于20mL LB（50mg/L Rif + 50mg/L Kan + 300 uM乙酰丁香酮）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28℃，240rmp培養(yǎng)至OD600為2.5；4℃，5000rmp離心10min，收集菌體，用IM滲透培養(yǎng)基（PDB+300 uM乙酰丁香酮，pH值為5.0）重懸稀釋菌體，使菌液OD600為0.6。
（3）將上述侵染用農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉孢子菌絲懸浮液等體積混合。
（4）上述混合菌液于25℃，60rmp避光振蕩培養(yǎng)72h。
（5）向上述共培養(yǎng)的混合菌液中加入200mg/L頭孢霉素（Cef），于26℃，120rmp恢復(fù)培養(yǎng)24h。
（6）將恢復(fù)培養(yǎng)后的寡雄腐霉菌體離心收集，用PDB重懸并涂布抗性選擇平板（PDA + 200mg/L Basta + 200mg/L Cef），于26℃培養(yǎng)。
（7）從上述平板上挑取抗性單克隆菌落，接種于新的抗性選擇平板（PDA + 200mg/L Basta + 200mg/L Cef），待菌絲生長鋪滿平板，從邊緣挑取菌絲接種于無選擇壓的PDA平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)以檢測其穩(wěn)定性，將剩余寡雄腐霉抗性菌體收集提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：恢復(fù)培養(yǎng)后的菌體涂布抗性選擇平板，2天后抗性選擇平板上布滿菌落，隨機(jī)挑取100個抗性菌落分別接種在新的抗性選擇平板上3天后菌絲鋪滿平板。分別提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，100個寡雄腐霉轉(zhuǎn)化子均為陽性，傳5代后置于抗性選擇平板上依舊具有Basta抗性。
實(shí)施例二 不同共培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響實(shí)驗(yàn)。
參照實(shí)施例一中所述方法，將農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉菌絲孢子懸浮液共同培養(yǎng)不同時間，依據(jù)PCR檢測結(jié)果確定最佳的共培養(yǎng)時間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉菌絲、孢子懸浮液共同培養(yǎng)時間在48～96h時，可以獲得很好的轉(zhuǎn)化效果。
實(shí)施例三 恢復(fù)培養(yǎng)對遺傳轉(zhuǎn)化的影響實(shí)驗(yàn)。
參照實(shí)施例一中所述方法，農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉菌絲、孢子懸浮液共同培養(yǎng)后是否經(jīng)歷恢復(fù)培養(yǎng)及恢復(fù)培養(yǎng)時間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，恢復(fù)培養(yǎng)階段可以很好的促進(jìn)被侵染后的寡雄腐霉菌體恢復(fù)生長活力增加轉(zhuǎn)化效果，恢復(fù)培養(yǎng)24～48h均可。
實(shí)施例四 農(nóng)桿菌菌液濃度對遺傳轉(zhuǎn)化的影響實(shí)驗(yàn)。
參照實(shí)施例一中所述方法，采用不同濃度農(nóng)桿菌菌液侵染寡雄腐霉菌絲、孢子，依據(jù)PCR檢測結(jié)果確定最佳的菌液濃度，試驗(yàn)結(jié)果如下表所示：
通過實(shí)驗(yàn)可見，農(nóng)桿菌侵染寡雄腐霉的適宜侵染濃度OD600在0.3～0.7，OD600為0.6時轉(zhuǎn)化率最高。
實(shí)施例五 農(nóng)桿菌菌液侵染寡雄腐霉時二者的體積比測試實(shí)驗(yàn)。
參照實(shí)施例一中所述方法，采用不同體積比例的農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉菌絲、孢子懸浮液進(jìn)行侵染，依據(jù)PCR檢測結(jié)果確定最佳的侵染比例，試驗(yàn)結(jié)果如下表所示：
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉菌絲、孢子懸浮液的比例在1～10 ： 1時，可以獲得很好的轉(zhuǎn)化效果。
實(shí)施例六 寡雄腐霉懸浮液濃度對轉(zhuǎn)化的影響。
參照實(shí)施例一中所述方法，采用不同濃度的寡雄腐霉懸浮液進(jìn)行侵染，依據(jù)PCR檢測結(jié)果確定最佳的懸浮液濃度，試驗(yàn)結(jié)果如下表所示：
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)寡雄腐霉菌絲、孢子懸浮液的濃度在1×106～7個/mL時，可以獲得很好的轉(zhuǎn)化效果。
以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)例方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。