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一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寡雄腐霉遺傳轉(zhuǎn)化方法與流程

文檔序號:12346441閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寡雄腐霉遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于包括如下步驟:

(1) 寡雄腐霉懸浮液制備:用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM沖洗平板上的寡雄腐霉孢子及部分菌絲,使懸浮液的濃度均為1×106~7個/mL;

(2) 包含目的基因載體的農(nóng)桿菌菌液制備:挑取農(nóng)桿菌單克隆活化擴(kuò)大培養(yǎng)后,收集菌體用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM重懸稀釋菌體至濃度OD600為0.3~0.7;

(3) 農(nóng)桿菌菌液侵染寡雄腐霉懸浮液:將上述農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉懸浮液混合共培養(yǎng),農(nóng)桿菌菌液與寡雄腐霉懸浮液比例為:1~10 :1,培養(yǎng)條件為避光,25℃, 60rmp,培養(yǎng)時間不少于24h;

(4) 恢復(fù)培養(yǎng):向共培養(yǎng)后的菌液中加入細(xì)菌抗生素, 26℃,120rmp,培養(yǎng)24~48h;

(5) 轉(zhuǎn)化子篩選:離心收集恢復(fù)培養(yǎng)后的菌體,用PDB重懸,涂布添加有抗性選擇壓的PDA平板,26℃培養(yǎng);挑取抗性單菌落接種于抗性選擇壓PDA平板26℃培養(yǎng)至菌絲生長鋪滿平板,收集菌體用于陽性檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于步驟(1)和(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM為:PDB+300 uM乙酰丁香酮,pH值為5.0。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于步驟(2)所述的農(nóng)桿菌濃度OD600為0.6。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于步驟(3)所述的培養(yǎng)時間為48-96h。

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