本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種在大腸桿菌中高可溶性表達(dá)并純化屋塵螨主要過敏原Der p 2蛋白的方法。

背景技術(shù)：

過敏被定義為一種對環(huán)境中無害的物質(zhì)即過敏原產(chǎn)生不利的免疫過度反應(yīng)。過敏性疾?。ㄒ卜Q為“特應(yīng)性疾病”），如花粉癥，過敏性支氣管哮喘，過敏性皮炎，濕疹，蕁麻疹，血管神經(jīng)性水腫和過敏性反應(yīng)，是全球性的健康問題，影響著超過全球25％的人口。自1960年以來，全球哮喘和過敏性鼻炎的患病率有著顯著的上漲。過敏性疾病仍是最常見的慢性疾病，大大影響患者的健康和生活質(zhì)量，加重了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療費(fèi)用。室外和室內(nèi)來源的很多物質(zhì)均可能導(dǎo)致過敏。花粉是主要的室外過敏原，室內(nèi)過敏原主要由屋塵螨，動(dòng)物皮屑，蟑螂和真菌孢子組成。此外，一些常見的食品例如花生、堅(jiān)果、大豆、牛奶、魚蝦等也含有已確定的過敏原成分。

過敏原進(jìn)入機(jī)體后，誘發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，后者以其Fc段與靶細(xì)胞（肥大細(xì)胞、堿性粒細(xì)胞）表面IgE受體FcεRI結(jié)合。IgE一旦與靶細(xì)胞結(jié)合，機(jī)體即呈致敏狀態(tài)。當(dāng)相同的過敏原再次進(jìn)入體內(nèi)，與已結(jié)合在靶細(xì)胞表面的IgE發(fā)生特異性反應(yīng)，導(dǎo)致其產(chǎn)生交聯(lián)并引起FcεRI構(gòu)象改變而聚集，激活下游通路，啟動(dòng)I型超敏反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子等的合成和分泌，此過程即發(fā)敏階段。靶細(xì)胞致敏后最終會(huì)引起脫顆粒并釋放炎癥介質(zhì)的反應(yīng)，這些炎癥介質(zhì)包括組胺、白三烯、血小板活化因子以及前列腺素D2等，能夠?qū)е旅?xì)血管擴(kuò)張、通透性增加、平滑肌收縮以及腺體分泌增多，引起全身反應(yīng)、呼吸道反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)以及皮膚反應(yīng)。

盡管人們對過敏性疾病的認(rèn)識(shí)已經(jīng)有久的歷史，但現(xiàn)行的過敏性疾病診斷和治療仍存在很大的局限性。目前常用的過敏原檢測方式包過敏原皮膚試驗(yàn)、過敏原激發(fā)試驗(yàn)和血清特異性IgE抗體濃度測定等，這些方法主要使用過敏原的提取物作為抗原，把過敏原提取物用于診斷過敏性疾病準(zhǔn)確性較高，但存在明顯的問題如下：

（1）過敏原提取成分復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、糖類以及核酸等成分，難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化；

（2）由于提取物中蛋白水解酶的存在導(dǎo)致過敏原的降解，或者降解產(chǎn)生不必要的有害物質(zhì)帶來穩(wěn)定性問題；

（3）難以在總提取物中檢測少量的過敏分子；

（4）難以檢測患者是對單一物質(zhì)過敏或是對一系列的不相關(guān)的物質(zhì)過敏；

（5）由于糖抗原表位交叉反應(yīng)造成的假陽性；

世界衛(wèi)生組織（WHO） 對過敏性疾病的治療提出了包含避免接觸過敏原、對癥治療、脫敏治療、患者教育四個(gè)方面的綜合性方案，作為過敏性疾病治療的基本原則。2006 年，歐洲變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫學(xué)學(xué)會(huì)（EAACI）指出，脫敏治療是唯一可能改變疾病自然進(jìn)程的對因療法，應(yīng)該盡早使用，以防止受累器官的黏膜發(fā)生不可逆損傷。但是目前免疫治療方法中使用的過敏原提取物存在比較明顯的缺點(diǎn)：

（1）無法確定粗提取物中各過敏原成分的具體量；

（2）從各來源提取的過敏原不一致而且衡量過敏原提取物能力的單位也不一致；

（3）提取物中主要過敏原量的變化導(dǎo)致過敏原成分的變化和過敏強(qiáng)度的不同；

（4）給定的提取物中批次之間也有變化；

（5）很難標(biāo)準(zhǔn)化有效的免疫治療過敏原的量，尤其是提取物中的次要過敏原；

（6）目前的免疫治療在一些患者身上產(chǎn)生局部的、系統(tǒng)的、甚至致命的反應(yīng)；

鑒于過敏原提取物在過敏性疾病診斷與治療中存在的問題，因此迫切需要發(fā)展新一代的診療方法與技術(shù)。分子克隆與基因工程技術(shù)的出現(xiàn)，使得研究人員可以更加準(zhǔn)確的鑒定、研究過敏原蛋白，并且促進(jìn)重組過敏原蛋白應(yīng)用在過敏性疾病診斷和治療方面。這些重組過敏原蛋白大部分已經(jīng)被證明在生化、生物、結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)方面具有和天然過敏原同等的效力。與傳統(tǒng)的過敏原提取物相比，經(jīng)過人工改造的重組過敏原具有無可比擬的優(yōu)勢，可以克服上述提取物的種種缺陷，并且生產(chǎn)成本更低。

塵螨過敏原是最重要的吸入性過敏原來源之一，普遍存在于室內(nèi)，戶塵螨和粉塵螨是最主要的兩種螨，同屬于塵螨屬，它們是一種普通存在的生物，肉眼一般看不見。國際上一致認(rèn)為在不同的地理位置和生活環(huán)境，優(yōu)勢螨種分布也有不同，但是在全世界范圍內(nèi)，居室內(nèi)最優(yōu)勢的螨是粉塵螨和屋塵螨。研究表明，在所有過敏患者中約有一半的人對塵螨過敏，因此國內(nèi)外多家知名公司開發(fā)并上市了以塵螨提取物為主要組分的脫敏治療產(chǎn)品。

屋塵螨過敏原是引發(fā)過敏性反應(yīng)最常見的過敏原之一。在已經(jīng)被分離到的23種屋塵螨過敏原當(dāng)中，組群1（group 1）和組群2（group 2）是極具臨床意義與價(jià)值的。屋塵螨過敏原組群2（Der p 2）作為非常重要的屋塵螨過敏原，能被超過90%的屋塵螨過敏病人的血清特異性IgE (sIgE) 識(shí)別。Der p 2的分子量約為14kDa，含有3個(gè)二硫鍵，是一種非糖基化蛋白。它與其他屋塵螨過敏原產(chǎn)生于屋塵螨的消化道內(nèi)，其以塵埃顆粒的形式飛揚(yáng)于空氣中，過敏體質(zhì)者吸入后引發(fā)Ⅰ型超敏反應(yīng)，從而引發(fā)特應(yīng)性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹等過敏性疾病。目前臨床上針對此類過敏性疾病的唯一對因治療是采用塵螨過敏原疫苗進(jìn)行脫敏治療，也稱過敏原特異性免疫治療（SIT）。SIT是基于連續(xù)、反復(fù)、梯度地給予過敏患者引發(fā)過敏反應(yīng)的特定過敏原，以達(dá)到改變患者對過敏原的免疫應(yīng)答、對較高劑量過敏原產(chǎn)生免疫耐受的目的。通過基因工程技術(shù)，獲得純度高、性質(zhì)單一的過敏原以應(yīng)用于臨床診斷及免疫治療，是當(dāng)今過敏性疾病診療的發(fā)展趨勢。自從Der p 2 cDNA被分離和鑒定出來之后，表達(dá)重組Der p 2以應(yīng)用于診斷和免疫治療就成為可能。但是，在此之前，以細(xì)菌原核表達(dá)的Der p 2都以包涵體的形式存在，因此阻礙了重組Der p 2在實(shí)際中的應(yīng)用。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)，生產(chǎn)成本低等顯著優(yōu)點(diǎn)。在基因表達(dá)技術(shù)中占有重要的地位，是分子生物學(xué)研究和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)程中的重要工具。異源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生不溶性的包涵體經(jīng)常發(fā)生，其產(chǎn)生原因也異常復(fù)雜。以包涵體形式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)因?yàn)閱适д_的空間折疊而缺乏生物活性。從包涵體中獲得有生物活性的蛋白必須經(jīng)過繁瑣復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)性過程處理，一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率極低，因此在工業(yè)中，重組蛋白的生產(chǎn)應(yīng)該盡量避免以包涵體的形式表達(dá)。

分子伴侶蛋白廣泛存在于細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物中，能夠參與到多種細(xì)胞生理過程中，例如幫助蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊；參與蛋白復(fù)合體的組裝；參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌等過程。不同分子伴侶之間的相互協(xié)調(diào)共同作用，可以保證細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)處于穩(wěn)定平衡的狀態(tài)。 觸發(fā)因子(Trigger Factor，TF)是原核分子伴侶網(wǎng)絡(luò)中的重要成員。TF具有分子伴侶活性的同時(shí)又有折疊酶活性，還能夠調(diào)節(jié)蛋白折疊速度，協(xié)助蛋白質(zhì)翻譯之后的組裝。諸多的研究表明，在TF的作用下，絕大部分蛋白質(zhì)能夠快速高效地完成正確的折疊，這使得TF在協(xié)助新生肽鏈折疊方面具有重要的作用和應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對目前塵螨主要過敏原Der p 2在大腸桿菌中以包涵體表達(dá)的技術(shù)不足，提供一種以TF作為標(biāo)簽融合可溶性表達(dá)Der p 2以及其純化制備的方法。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

合成Der p 2成熟體基因序列（GenBank登錄號(hào)FM177223.1，如SEQ ID NO:1所示），克隆到pCold-TFM大腸桿菌表達(dá)載體（在Der p 2 氨基端融合TF標(biāo)簽）。將重組質(zhì)粒pCold-TFM-Der p 2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，挑選單克隆菌落，16℃ IPTG誘導(dǎo)胞內(nèi)表達(dá)，融合蛋白呈可溶性。收集菌體經(jīng)超聲破碎后采用Ni柱親和層析，凝膠過濾層析，HRV-3C蛋白酶消化，和離子交換層析的方法進(jìn)行純化，最終得到與天然產(chǎn)物相近的高純度Der p 2蛋白。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比較，本發(fā)明的優(yōu)良效果主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1. 本發(fā)明所使用大腸桿菌融合表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了塵螨主要過敏原Der p 2的可溶性表達(dá)，具有表達(dá)量高，易于純化，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)；

2. 本發(fā)明應(yīng)用的Der p 2純化工藝簡單且重復(fù)性好，生產(chǎn)成本低，終產(chǎn)物純度高；

3. 本發(fā)明方法制備的重組Der p 2具有與天然Der p 2相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)；

4. 本發(fā)明方法制備的重組Der p 2具有與天然Der p 2相同的血清特異性IgE結(jié)合能力。

附圖說明

圖１為本發(fā)明實(shí)施條例提供的TF-Der p 2表達(dá)與Ni親和層析SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，圖最左邊的為蛋白Marker條帶，第１條帶樣品為菌體裂解物，第２條帶樣品為菌體裂解物上清，第２條帶樣品為菌體裂解物上清經(jīng)過Ni親和層析介質(zhì)的穿過組分，第４條帶樣品為高濃度咪唑洗脫下來的TF-Der p 2融合蛋白。

圖２為本發(fā)明實(shí)施條例提供的TF-Der p 2融合蛋白經(jīng) HiLoad? 16/600 Superdex? 75凝膠過濾層析柱純化后的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，圖最左邊的為蛋白Marker條帶，第１條帶樣品為圖１所示的Ni親和層析柱上面洗脫下來的TF-Der p 2融合蛋白，第２條帶樣品為經(jīng)過HiLoad? 16/600 Superdex? 75凝膠過濾層析柱純化后的TF-Der p 2融合蛋白。

圖3為本發(fā)明實(shí)施條例提供的HRV-3C蛋白酶切后的TF-Der p 2融合蛋白經(jīng)Mono S^TM 5/50 GL離子交換層析柱純化結(jié)果，隨著鹽濃度的梯度增加，從層析柱上面洗脫出來兩個(gè)主要的吸收峰。

圖4為本發(fā)明實(shí)施條例提供的TF-Der p 2融合蛋白經(jīng)HRV-3C蛋白酶切后再經(jīng)過陽離子交換層析柱純化后的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，圖最左邊的為蛋白Marker條帶，第１條帶樣品為圖２所示的凝膠過濾層析柱純化后的TF-Der p 2融合蛋白，第２條帶樣品為經(jīng)HRV-3C蛋白酶切消化后的TF-Der p 2融合蛋白，第３條帶樣品為HRV-3C蛋白酶切后的TF-Der p 2融合蛋白經(jīng)Mono S^TM 5/50 GL離子交換層析柱純化收集到的第一個(gè)主峰，為含有Der p 2蛋白的峰，第４條帶樣品為Mono S^TM 5/50 GL離子交換層析柱純化收集到的第二個(gè)主峰，為含有TF標(biāo)簽的峰。

圖5為本發(fā)明實(shí)施條例提供的圖４中收集的Der p 2蛋白經(jīng)過最后的Superdex^TM 200 Increase 10/300 GL凝膠過濾層析柱純化結(jié)果。

圖６為本發(fā)明實(shí)施條例提供的圖5中收集的最終純化Der p 2蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，圖最左邊的為蛋白Marker條帶，第１條帶樣品為天然Der p 2蛋白，第２條帶樣品為最終純化得到的重組Der p 2蛋白。

圖７為本發(fā)明實(shí)施條例提供的純化重組Der p 2蛋白與天然Der p 2蛋白通過圓二色譜對其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較的結(jié)果。

圖８為本發(fā)明實(shí)施條例提供的純化重組Der p 2蛋白與天然Der p 2蛋白屋在塵螨過敏病人血清中特異性IgE結(jié)合活性方面比較的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。

1. 所用材料

1.1 主要試劑 DNA限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，Phusion超保真DNA聚合酶以及T4 DNA連接酶均為NEB公司產(chǎn)品；HRV-3C蛋白酶為本研究組表達(dá)純化；質(zhì)粒小量抽提試劑盒及膠回收試劑盒：大連寶生物公司產(chǎn)品；鎳瓊脂糖凝膠（Ni Sepharose^TM 6 Fast Flow）: 美國通用電氣公司產(chǎn)品；天然Der p 2：英國Indoor Biotech公司產(chǎn)品；生物素標(biāo)記的抗人IgE Fc 段單克隆抗體：美國Abcam公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的鏈霉親和素：美國Southern Biotech公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）：Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜：美國頗爾公司產(chǎn)品；其他均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純試劑

1.2 主要儀器

HiLoad? 16/600 Superdex? 75 層析柱，Mono S^TM 5/50 GL層析柱，Superdex^TM 200 Increase 10/300 GL柱，?KTA蛋白純化儀：美國通用電氣公司產(chǎn)品；圓二色譜儀：英國Applied Photophysics 公司產(chǎn)品；冷凍高速離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品。

2. 實(shí)施方法

2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

檢索已知的Der p 2基因序列（GenBank登錄號(hào)FM177223.1）并通過人工合成的途徑獲得，設(shè)計(jì)上游引物（如SEQ ID NO:2所示），引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)下游引物（如SEQ ID NO:3所示），引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。 以50ul的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，接著94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，切膠回收純化后進(jìn)行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，連接到pCold-TFM(專利申請人基于Takara公司的pCold-TF改造，將pCold-TF載體上的凝血酶以及Xa因子蛋白酶切位點(diǎn)刪除，在HRV-3C蛋白酶切位點(diǎn)后加上BamHⅠ、EcoR酶切位點(diǎn))表達(dá)載體，構(gòu)建pCold-TFM-Der p2表達(dá)質(zhì)粒，重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR鑒定后測序驗(yàn)證。

2.2 重組融合蛋白TF-Der p 2的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pCold-TFM-Der p 2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)。挑單菌落接種于含100ug/ml 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，次日按照1%的接種量接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床中以220轉(zhuǎn)/分鐘搖菌至OD600為0.6到0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.2 mM/L，16℃誘導(dǎo)表達(dá)約20小時(shí)。4℃離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘）收集菌體。細(xì)菌沉淀用30ml重懸緩沖液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4500mM NaCl，5mM 咪唑 ，PH 8.0）重懸后凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 融合蛋白TF-Der p 2的純化

細(xì)菌沉淀重懸液于冰上解凍后經(jīng)超聲破碎、離心（20000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘），收集上清。將上清液上樣于已用重懸緩沖液平衡好的鎳瓊脂糖凝膠柱（Ni Sepharose^TM 6 Fast Flow），在4℃環(huán)境下結(jié)合15分鐘，再用洗滌緩沖液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4500mM NaCl，20mM 咪唑，PH 8.0）洗滌3個(gè)柱體積，去除非特異性結(jié)合的雜蛋白，最后用洗脫緩沖液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4500mM NaCl，5mM 咪唑 ，PH 8.0）競爭洗脫下與鎳離子結(jié)合的融合蛋白TF-Der p 2。經(jīng)過鎳柱初步純化后的融合蛋白溶液上樣于凝膠過濾層析色譜柱（HiLoad? 16/600 Superdex? 75 column）進(jìn)一步純化，去除分子量偏小的微量雜蛋白。

2.4 融合標(biāo)簽TF的去除及Der p 2 蛋白的純化

經(jīng)過鎳柱、凝膠過濾層析純化后的TF-Der p 2融合蛋白進(jìn)行HRV-3C蛋白酶酶切，酶切后的蛋白液置換緩沖液為離子柱上樣緩沖液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4，20mM NaCl，1mM EDTA，PH 6.4），然后上樣于陽離子交換柱（Mono S^TM 5/50 GL column），采用離子柱洗脫緩沖液（20mM NaH2PO4/Na2HPO4，1M NaCl，1mM EDTA，PH 6.4）進(jìn)行線性梯度（在20個(gè)洗脫柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液的比例由0增加到50%）洗脫。洗脫下來的Der p 2蛋白純度進(jìn)行SDS-PAGE分析。該步驟獲得的Der p 2蛋白經(jīng)過Superdex^TM 200 Increase 10/300 GL柱進(jìn)一步純化，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析純度。

2.5 重組Der p 2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

將純化好的重組Der p 2蛋白置換緩沖液為1×PBS，與購買的天然Der p 2(溶于PBS當(dāng)中)同時(shí)稀釋至終濃度為20 uM，進(jìn)行圓二色譜分析。光譜分析在購于應(yīng)用光物理公司（英國）的圓二色分析儀上進(jìn)行，以PBS為空白對照，設(shè)定分辨率為1nm/min，光徑為10mm，以100nm/min的掃描速度，記錄200nm到280nm段的圓二色光譜，比較重組Der p 2、天然Der p 2在二級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異。

2.6 重組蛋白重組Der p 2與屋塵螨過敏病人血清中特異性結(jié)合活性分析

含有0.2ug的等體積（2 ul）重組Der p 2、天然Der p 2蛋白點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，同時(shí)以BSA作為陰性對照。待樣品干燥后，以5%BSA-TBST室溫下封閉1小時(shí)，接著以1：10稀釋的塵螨過敏病人的血清室溫下孵育30分鐘，同時(shí)以非過敏健康者1：10稀釋血清及5%BSA-TBST為陰性對照，按照等同條件孵育。孵育完成后，以1%TBST洗膜，每次10分鐘，連續(xù)3次。接著以1：3000稀釋好的生物素標(biāo)記的抗人IgE Fc段單克隆抗體室溫下孵育30分鐘，孵育完成后洗膜（同上）。最后以1：5000稀釋的HRP標(biāo)記鏈霉親和素室溫下孵育30分鐘，洗膜，加底物顯色曝光成像。

3 結(jié)果與分析

3.1 重組pCold-TFM-Der p 2表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定及菌落PCR鑒定，均能在400bp左右的位置見到條帶，大小與理論值相符；表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過測序驗(yàn)證，序列與已知Der p 2序列（GenBank登錄號(hào)FM177223.1）一致。

3.2 重組融合蛋白TF-Der p 2的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

含有表達(dá)質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株誘導(dǎo)20小時(shí)后超聲破碎提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示，全部的融合蛋白以可溶性的形式存在于離心后上清液中。經(jīng)過鎳柱親和層析后能捕獲大部分的融合蛋白，將與鎳離子結(jié)合的融合蛋白用250mmol/L的咪唑溶液洗脫下來，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色分析，結(jié)果顯示大部分雜蛋白被去除（如圖1所示）。經(jīng)過鎳柱純化后的融合蛋白再經(jīng)分子篩純化（HiLoad? 16/600 Superdex? 75 column），結(jié)果顯示融合蛋白的純度進(jìn)一步提高（如圖2所示）。

3.3 融合標(biāo)簽的去除及Der p 2蛋白的純化

在由步驟2.2得到的TF-Der p 2蛋白溶液中加入適量HRV-3C蛋白酶進(jìn)行酶切，酶切后SDS-PAGE結(jié)果顯示，在分子量14000左右的位置處有蛋白條帶出現(xiàn)，與Der p 2分子量的理論值相符。酶切后蛋白液經(jīng)過陽離子柱線性洗脫后，出現(xiàn)兩個(gè)蛋白主峰，將兩個(gè)主峰樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，顯示第一個(gè)主峰（如圖3所示箭頭所指）就是重組Der p 2，考馬斯亮藍(lán)染色分析顯示純化后的重組Der p 2純度在90%以上（如圖4所示）。該步驟獲得的Der p 2蛋白經(jīng)過Superdex^TM 200 Increase 10/300 GL柱進(jìn)一步純化（如圖5所示），經(jīng)SDS-PAGE電泳分析純度大于98%（如圖6所示）。

3.4 重組Der p 2的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圓二色譜分析顯示，重組Der p 2與天然Der p 2的圖譜幾乎完全重合，證明大腸桿菌重組表達(dá)的可溶性重組Der p 2能夠正確折疊，其二級(jí)結(jié)構(gòu)與天然Der p 2無明顯差異（如圖7所示）。

3.5 重組蛋白重組Der p 2的免疫活性測定

Dot-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組Der p 2與11例屋塵螨過敏病人血清中特異性IgE結(jié)合活性同天然Der p 2無明顯差異（如圖8所示），且具有一致的趨勢，信號(hào)的強(qiáng)弱與血清特異性IgE的含量變化一致，證明大腸桿菌重組表達(dá)的可溶性重組Der p 2具備完好的免疫活性。