本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種來自灰黃鏈霉菌(Streptomyces griseoflavus)的L-谷氨酸氧化酶基因及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

L-谷氨酸的測定在味精生產(chǎn)、食品工業(yè)及臨床檢測中都十分重要。谷氨酸檢測常用色譜法和酶法。色譜法由于受設(shè)備和前處理繁瑣的限制，推廣較難，酶法則常用谷氨酸脫氫酶和谷氨酸脫羧酶檢測，但是它們底物專一性不強(qiáng)，且需要昂貴的輔酶才能反應(yīng)。L-谷氨酸氧化酶(LGOX)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的黃素蛋白酶類，能專一地催化谷氨酸氧化成α-酮戊二酸、氨和過氧化氫，通過過氧化氫含量的變化可以方便地測定谷氨酸的含量，利用L-谷氨酸氧化酶研制出谷氨酸檢測試劑盒和生物傳感器，具有測量時間短、專一性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，可以評價食品的質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)味精發(fā)酵過程中在線檢測與控制，因此受到了極大的重視。另一方面，在臨床生化檢驗(yàn)上，L-谷氨酸氧化酶可以用于測定肝臟中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和r-谷氨?；D(zhuǎn)移酶等的活性以及肌酐等的濃度，由L-谷氨酸氧化酶制成的微型傳感器芯片還廣泛用于大腦中紋狀體、丘腦和皮層等不同部位神經(jīng)通路的研究。

1983年，Kusakabe等從一株鏈霉菌X-119-6(Streptomyces sp.X-119-6)菌株中分離出底物特異性的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸為底物的Km值僅為0.2mM，該酶耐熱性較強(qiáng)，除催化L-谷氨酸氧化外，僅對L-天冬氨酸有微弱的催化作用。2006年日本Yamasa公司構(gòu)建了鏈霉菌X-119-6基因組文庫，通過探針篩選獲得了LGOX基因，該基因長2103bp，編碼701個氨基酸，含有14個信號肽序列，成熟的蛋白也是由α、β、γ三個亞基組成，一般組成二聚體形式，分子量大約為140KDa。他們構(gòu)建大腸桿菌強(qiáng)啟動子調(diào)控LGOX基因表達(dá)的載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)了LGOX前體蛋白在大腸桿菌的高效表達(dá)，表達(dá)的前體蛋白經(jīng)過內(nèi)切蛋白酶處理后具有更高的活性(US patent 7109008)。目前該產(chǎn)品轉(zhuǎn)由Kikkoman公司生產(chǎn)并壟斷了市場。

至今發(fā)現(xiàn)的LGOX全部來源于鏈霉菌，然而，不同分離菌株中LGOX的分子大小、比活性、對谷氨酸的專一性、最適pH值等均存在很大的差異，由于目前克隆獲得的LGOX基因有限，造成這些差異的機(jī)制很不清楚。另外，由于LGOX生產(chǎn)相對滯后，至今所篩選到的 L-谷氨酸氧化酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力大多很低，即使經(jīng)過誘變，產(chǎn)酶能力也不高，因此獲得新型LGOX基因并實(shí)現(xiàn)基因工程化生產(chǎn)成為解決該酶來源的根本途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種來自灰黃鏈霉菌(Streptomyces griseoflavus)的L-谷氨酸氧化酶基因及其制備方法和應(yīng)用，利用基因合成法制備L-谷氨酸氧化酶基因，并對該基因進(jìn)行表達(dá)、純化及酶的催化活性和底物譜分析，證明該基因?qū)-谷氨酸的專一催化活性較高，可作為L-谷氨酸含量檢測用酶。

本發(fā)明從土壤中篩選獲得一株產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的灰黃鏈霉菌，培養(yǎng)、提取總DNA，以L-谷氨酸氧化酶基因的保守序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得L-谷氨酸氧化酶基因的保守區(qū)域，利用染色體步移技術(shù)(Genome Walking)獲得該基因的全長序列，得到了核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的L-谷氨酸氧化酶基因。再利用基因合成方法合成出核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的L-谷氨酸氧化酶基因，通過基因工程手段構(gòu)建該基因表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)，大大降低該L-谷氨酸氧化酶從野生菌中提取的成本，提高該L-谷氨酸氧化酶的催化活性。同時所述L-谷氨酸氧化酶底物專一性很強(qiáng)，能特異性地催化L-谷氨酸，可應(yīng)用于L-谷氨酸含量檢測。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種來自灰黃鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種來自灰黃鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的制備方法，其是通過基因合成方法合成所述L-谷氨酸氧化酶基因，其中，所用的引物如下：

SgGOX1：ATGACTGAAGATCACGCGGTGGTGTGTTCTGAAAATGGTTTCTCCCGACGGGAGTTCGCG

SgGOX2：CGGCCAGGGCCGTCGCCACCGTGGCCGTGCCGGCCACCGCCGCGAACTCCCGTCGGGAGA

SgGOX3：GGTGGCGACGGCCCTGGCCGGCGGTACCGCCACGGCCCTGCCCGCGCCGGCCGCGCCGCT

SgGOX4：GGAGTCGGCGCCGCGACCGCCGCCGGGAAGGGCCGGGGCGAGCGGCGCGGCCGGCGCGGG

SgGOX5：GCGGTCGCGGCGCCGACTCCGACAGATGCCTCGCCGTCGCCCGTGCCCTGCTCGTCCTGG

SgGOX6：ACGCGCACGTAGCGCGGAACGAGGGGGCGGTCGTCGGAGTCCAGGACGAGCAGGGCACGG

SgGOX7：GTTCCGCGCTACGTGCGCGTCCTGAAAGACGGACTGCCGGCGCGACGGACCCGCCCCAAG

SgGOX8：TCACCAGCCCGGACGGGCCGGCGCCGATGACGAGGACGTCCTTGGGGCGGGTCCGTCGCG

SgGOX9：CGGCCCGTCCGGGCTGGTGACCGCCTGGCTGCTGAAGGAGGCGGGACACCGGGTGACGGT

SgGOX10：CTTGATGCGGCCGCCCGCCCGGTTGCCGTTGGCCTCCAGGACCGTCACCCGGTGTCCCGC

SgGOX11：GGGCGGGCGGCCGCATCAAGACCTTCCGAAAGGGCGGCCACGAAGGTGCCGGGCAGCCCT

SgGOX12：CGCATCGCGCCCGCCTCGGCGTACTGGCCGGGATCCGCGAAGGGCTGCCCGGCACCTTCG

SgGOX13：GCCGAGGCGGGCGCGATGCGTATCCCCGGCAGCCATCCGCTGGTGATGGAACTCATCGAC

SgGOX14：CGTCGACGTAGTGGAAGCGCCGCTTCTTCAGATCGAACCGGTCGATGAGTTCCATCACCA

SgGOX15：GCGCTTCCACTACGTCGACGTCGACGAGGAGGGACGTCCCGCCGCGCGCACCTGGATCCA

SgGOX16：GCGGGCGTAGTCGGCGCGCCGTACGCGGATGCCGTTGACGTGGATCCAGGTGCGCGCGGC

SgGOX17：GGCGCGCCGACTACGCCCGCTCGCCCCGGCGCGTGAACCGGTCCTTCGGTGTCCCGAAGG

SgGOX18：GCGGCACGCAGGATCGCTGCGGCGGGGGTGTCCCAGTGGGCCTTCGGGACACCGAAGGAC

SgGOX19：GCAGCGATCCTGCGTGCCGCGCTGGACCCCGTGCGCGACGAGTTCAGTCATGTCGGTCGG

SgGOX20：GCAGCCGCTCCGGCAGCGGTTTGTCGACCCGCTTGCCGTCCCGACCGACATGACTGAACT

SgGOX21：ACCGCTGCCGGAGCGGCTGCGGGGCTGGGGGCGGGTGGTGAAGCGGTTCGGCGACTGGTC

SgGOX22：GCTCGTCGAGCCCCGCGTGCTCGTGAGGAAACGGAACATCGACCAGTCGCCGAACCGCTT

SgGOX23：GCACGCGGGGCTCGACGAGCGGACCGTCGACCTCATCGGCGCCCTGGAGAACCTCACCTC

SgGOX24：AGGAGCCGATGAAGCTGTGGATGAAGGCCAGCGGGAGACGTAGGTGAGGTTCTCCAGGGC

SgGOX25：CCACAGCTTCATCGGCTCCTCCCTCATCAGCCCCGACACGCCCTTCTACGAGGACCGAGC

SgGOX26：ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCCTCGTAGAAGGG

SgGOX27：GAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAT

SgGOX28：TGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCAATAATGAATCGGCCAACGCG

SgGOX29：TCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTCGCTCACTCATCA

SgGOX30：CATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTGATGAGTGAGCGAACTCAC

SgGOX31：TTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAGAACAATTTCACACAGGAA

SgGOX32：CGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTCT

SgGOX33：GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTACTACGACAAGGCGACCAAGGTG

SgGOX34：CCTCGGTGAACTCCCACCAGCGGCGGCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGTCGCCTTGTCGT

SgGOX35：CTGGTGGGAGTTCACCGAGGCGGACTGGAAACGGGAACTCGACGCCGTACGGCCGGGGCT

SgGOX36：CCCGTCGGCCGGCGCCCGGCCCGACCGGTAGTCCTCGTACAGCCCCGGCCGTACGGCGTC

SgGOX37：GCCGGGCGCCGGCCGACGGGAGCCTGCTCGGCGGGCATCCGTCCGTGCCGCCGGGGCACA

SgGOX38：CACCGGTTGGCGGCGTAGTGCACCCGCTGTCCCGCCGTGATGTGCCCCGGCGGCACGGAC

SgGOX39：CACTACGCCGCCAACCGGTGGGCCGGCCGCGACCAGCCCGAGGCGGCGCACATCGTCGGC

SgGOX40：TGATCATGAACCGGTTGGGGTTGTCGGAGACCGAGCCGCCGCCGACGATGTGCGCCGCCT

SgGOX41：CCCCAACCGGTTCATGATCAACCCGTCGCACCCGGTCGGCGGCAGCGCGGGCGGGGTCGT

SgGOX42：CCAGCGGGAGGCGTCGTCGGCCCAGCTGTACGAGGCGAGGACGACCCCGCCCGCGCTGCC

SgGOX43：CCGACGACGCCTCCCGCTGGGACTCCCTGGACGACGAGGCGCGCTACCCGCACGCCCTGC

SgGOX44：AAGACCTCGACGCGCCGGCCGTAGACCTGCTGGAGCCCGCGCAGGGCGTGCGGGTAGCGC

SgGOX45：GGCCGGCGCGTCGAGGTCTTCTACACGGGCGCGGGCCGCACCCAGAGCTGGCTGCGGGAT

SgGOX46：GACCGGGGAGCAGGACGGACGCCTCCCCGTACGCGTACGGATCCCGCAGCCAGCTCTGGG

SgGOX47：GTCCGTCCTGCTCCCCGGTCAGCACACGGAGCTGCTGAGCGCCATCCGCTCCGCCGAGGG

SgGOX48：CGGCTTGACCGAGGTGTGGTCGCCCGCGAAGAGCAGCGGGCCCTCGGCGGAGCGGATGGC

SgGOX49：ACCACACCTCGGTCAAGCCGTCGTGGATCGAGGGAGCCGTGGAGTCCGCCGTGCGTGCCG

SgGOX50：TCACGCTGTGTGGATCTCCAAGGCGGCACGCACGGCGGACTCC

本發(fā)明所述來自灰黃鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因在L-谷氨酸含量檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述來自灰黃鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的獲取方法如下：從江蘇省南京市土壤微生物中篩選產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的菌株，將篩選得到的菌落提取總DNA，根據(jù)L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列設(shè)計引物Primer A：5’-CACCTGGATCCACGTCAACG-3’和Primer B： 5’-GTGTAGAAGACCTCGACGCG-3’，以引物Primer A、Primer B為擴(kuò)增引物，以總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一段1179bp的PCR片段。以此序列為基礎(chǔ)，采用Genome Walking Kit試劑盒(大連寶生物公司)獲取其兩側(cè)的未知序列，查找完整的開放閱讀框，從而獲得該L-谷氨酸氧化酶基因的全序列即為本發(fā)明的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明所述的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示、編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID No.2所示的L-谷氨酸氧化酶基因可通過基因合成方法得到，即采用大量重疊的引物通過兩步PCR進(jìn)行全基因的合成(PTDS)。本發(fā)明在PTDS合成過程中設(shè)計長度大概為60bp左右的覆蓋整個L-谷氨酸氧化酶基因的寡核苷酸的序列50個(引物SgGOX1-SgGOX50)，其中每相鄰的兩個寡核苷酸序列有20個堿基的重復(fù)。

經(jīng)檢測，本發(fā)明制備得到的L-谷氨酸氧化酶的反應(yīng)活力為36.7U/mg，所述L-谷氨酸氧化酶蛋白以L-谷氨酸為底物的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH值為7.5，該L-谷氨酸氧化酶蛋白能特異地催化L-谷氨酸。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明從土壤中篩選出產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的灰黃鏈霉菌，并從中得到核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID No.2所示的L-谷氨酸氧化酶基因。再通過基因合成方法合成出所述L-谷氨酸氧化酶基因，大大降低了該L-谷氨酸氧化酶的提取成本，提高了L-谷氨酸氧化酶的催化活性。

2.本發(fā)明得到的L-谷氨酸氧化酶底物專一性很強(qiáng)，能特異性地催化L-谷氨酸，可應(yīng)用于L-谷氨酸含量檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例5的L-谷氨酸氧化酶的SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白分子量MARKER，1代表用HisTrap HP試劑盒純化的在大腸桿菌BL21(DE3)過量表達(dá)的L-谷氨酸氧化酶蛋白。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例7的酶活力測定結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例8的酶活力測定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施方式詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方 案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。

本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書[J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學(xué)出版社]。

實(shí)施例1 菌種分離

稱取土壤樣品1g，加入0.85％(w/v)氯化鈉溶液1ml，5000轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，3000轉(zhuǎn)/分輕離心，倒掉上清，再加入0.85％(w/v)氯化鈉溶液1ml，5000轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，冰上10min靜置，吸取100μL溶液涂布于含有50ppm重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基(高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g/L，KNO₃1g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.01g/L，瓊脂20g/L，pH＝7.4)中，30℃下培養(yǎng)4天。根據(jù)菌落形態(tài)和大小挑取菌落分別對應(yīng)地接入對照與顯色兩種平皿中(平皿中均為高氏一號培養(yǎng)基)，顯色平皿中顯色液為0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)，0.07％的4-氨基安替吡啉，0.8％的L-谷氨酸，0.1％的苯酚，2000U/L的辣根過氧化物酶。30℃下培養(yǎng)3天，取顯色平皿，將顯色液浸過的濾紙置于其菌落上，標(biāo)記顯色快、紅色深的菌落在對照平皿上對應(yīng)菌落，挑取該菌落在高氏一號培養(yǎng)基上劃線分離，30℃下培養(yǎng)3天，挑取單菌落保藏備用。

實(shí)施例2 總DNA提取及菌種鑒定

將分離獲得的菌株接種于10mL液體培養(yǎng)基(酵母粉3g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉5g/L，大豆蛋白胨5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，pH＝7.0)中，30℃下培養(yǎng)3天，培養(yǎng)液以7000r/min速度離心6分鐘，得到菌體沉淀。

取0.15g新鮮菌體于研缽(-20℃預(yù)冷)中，反復(fù)液氮研磨至細(xì)粉狀，迅速裝入1.5mL離心管中，加入TE緩沖液550μL，65℃預(yù)熱的20％(w/v)SDS溶液30μL，斡旋震蕩5分鐘，接著加入濃度為20mg/mL的蛋白酶K 20μL，混勻，37℃水浴1小時，加等體積的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1，v/v)抽提，輕輕顛倒混勻，10000r/min速度離心10分鐘；吸取上清至新離心管中，加等體積的氯仿:異戊醇(24:1，v/v)抽提，10000r/min速度離心5分鐘，吸取上清與等體積異丙醇(4℃預(yù)冷)混勻，10000r/min速度離心5分鐘，棄上清。沉淀用70％(v/v)酒精沖洗，干燥，加40μL TE緩沖液溶解，所得總DNA于-20℃保存。

以抽提的總DNA為模板，利用細(xì)菌的16s rRNA特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的引物為P16SF：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’和P16SR：5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’。以KODPlus(Toyobo日本)為Taq DNA聚合酶，擴(kuò)增條件依次為：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 120s，擴(kuò)增30個循環(huán)。PCR結(jié)束后，1％(w/v)瓊脂糖凝膠回收，取10μL直接與T/A載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌在DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，獲得陽性克隆，測序。測得的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，得到菌株與灰黃鏈霉菌中的16s rRNA有100％的同源性，該菌株為灰黃鏈霉菌。

實(shí)施例3 灰黃鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的獲取

根據(jù)L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列設(shè)計引物：Primer A：5’-CACCTGGATCCACGTCAACG-3’和Primer B：5’-GTGTAGAAGACCTCGACGCG-3’為擴(kuò)增引物，以總DNA為模板，獲得一段1179bp的PCR片段。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，擴(kuò)增30個循環(huán)。用1％瓊脂糖膠回收片段，取10μl直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4℃連接過夜，在DH5α感受態(tài)中高效轉(zhuǎn)化，獲得陽性克隆，測序。

以獲得的1179bp的PCR片段為基礎(chǔ)，采用Genome Walking Kit試劑盒(大連寶生物公司)獲取其兩側(cè)的未知序列，查找完整的開放閱讀框，從而獲得該L-谷氨酸氧化酶基因的全序列，具體過程如下：

為擴(kuò)增5’端未知序列，設(shè)計引物：SP1：5’-ACATGACTGAACTCGTCGCGCAC-3’，SP2：5’-TCGGGACACCGAAGGACCGGTTC-3’和SP3：5’-TACGCGGATGCCGTTGACGTGG-3’。以總DNA為模板，SP1和試劑盒中的AP2Primer為引物，進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃ 1min，98℃ 1min；[94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 2min(5個循環(huán))]；94℃ 30s，25℃ 3min，72℃ 2min；[94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，44℃ 1min，72℃ 2min(15個循環(huán))]；72℃ 10min。

取第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1μL作為模板，以SP2和試劑盒中的AP2Primer為引物，進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：[94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，44℃ 1min，72℃ 2min(15個循環(huán))]；72℃ 10min。

取第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1μL作為模板，以SP3和試劑盒中的AP2Primer為引物，進(jìn)行第三輪PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：[94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，44℃ 1min，72℃ 2min(15個循環(huán))]；72℃ 10min。將第三輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1％瓊脂糖膠回收，測序，獲得5’端未知序列929bp。

用同樣的方法擴(kuò)增3’端未知序列，設(shè)計引物：

SP4：5’-GTTCATGATCAACCCGTCGCAC-3’，SP5：

5’-ACTCCCTGGACGACGAGGCGCG-3’和SP6：5’-GCGCGTCGAGGTCTTCTACAC-3’。對第三輪PCR反應(yīng)的片段進(jìn)行測序，獲得3’端未知序列762bp。

對上述三段序列(1179bp的PCR片段、5’端未知序列929bp片段、3’端未知序列762bp片段)進(jìn)行拼接和分析，尋找閱讀編碼框，其中包含了一個2004bp的閱讀框，即為本發(fā)明的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

實(shí)施例4 基因合成法合成來源于灰黃鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因

通過基因合成方法(Nucleic Acids Research,2004,32,e98)合成本發(fā)明的來源于灰黃鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，所用的引物如下：

SgGOX1：ATGACTGAAGATCACGCGGTGGTGTGTTCTGAAAATGGTTTCTCCCGACGGGAGTTCGCG

SgGOX2：CGGCCAGGGCCGTCGCCACCGTGGCCGTGCCGGCCACCGCCGCGAACTCCCGTCGGGAGA

SgGOX3：GGTGGCGACGGCCCTGGCCGGCGGTACCGCCACGGCCCTGCCCGCGCCGGCCGCGCCGCT

SgGOX4：GGAGTCGGCGCCGCGACCGCCGCCGGGAAGGGCCGGGGCGAGCGGCGCGGCCGGCGCGGG

SgGOX5：GCGGTCGCGGCGCCGACTCCGACAGATGCCTCGCCGTCGCCCGTGCCCTGCTCGTCCTGG

SgGOX6：ACGCGCACGTAGCGCGGAACGAGGGGGCGGTCGTCGGAGTCCAGGACGAGCAGGGCACGG

SgGOX7：GTTCCGCGCTACGTGCGCGTCCTGAAAGACGGACTGCCGGCGCGACGGACCCGCCCCAAG

SgGOX8：TCACCAGCCCGGACGGGCCGGCGCCGATGACGAGGACGTCCTTGGGGCGGGTCCGTCGCG

SgGOX9：CGGCCCGTCCGGGCTGGTGACCGCCTGGCTGCTGAAGGAGGCGGGACACCGGGTGACGGT

SgGOX10：CTTGATGCGGCCGCCCGCCCGGTTGCCGTTGGCCTCCAGGACCGTCACCCGGTGTCCCGC

SgGOX11：GGGCGGGCGGCCGCATCAAGACCTTCCGAAAGGGCGGCCACGAAGGTGCCGGGCAGCCCT

SgGOX12：CGCATCGCGCCCGCCTCGGCGTACTGGCCGGGATCCGCGAAGGGCTGCCCGGCACCTTCG

SgGOX13：GCCGAGGCGGGCGCGATGCGTATCCCCGGCAGCCATCCGCTGGTGATGGAACTCATCGAC

SgGOX14：CGTCGACGTAGTGGAAGCGCCGCTTCTTCAGATCGAACCGGTCGATGAGTTCCATCACCA

SgGOX15：GCGCTTCCACTACGTCGACGTCGACGAGGAGGGACGTCCCGCCGCGCGCACCTGGATCCA

SgGOX16：GCGGGCGTAGTCGGCGCGCCGTACGCGGATGCCGTTGACGTGGATCCAGGTGCGCGCGGC

SgGOX17：GGCGCGCCGACTACGCCCGCTCGCCCCGGCGCGTGAACCGGTCCTTCGGTGTCCCGAAGG

SgGOX18：GCGGCACGCAGGATCGCTGCGGCGGGGGTGTCCCAGTGGGCCTTCGGGACACCGAAGGAC

SgGOX19：GCAGCGATCCTGCGTGCCGCGCTGGACCCCGTGCGCGACGAGTTCAGTCATGTCGGTCGG

SgGOX20：GCAGCCGCTCCGGCAGCGGTTTGTCGACCCGCTTGCCGTCCCGACCGACATGACTGAACT

SgGOX21：ACCGCTGCCGGAGCGGCTGCGGGGCTGGGGGCGGGTGGTGAAGCGGTTCGGCGACTGGTC

SgGOX22：GCTCGTCGAGCCCCGCGTGCTCGTGAGGAAACGGAACATCGACCAGTCGCCGAACCGCTT

SgGOX23：GCACGCGGGGCTCGACGAGCGGACCGTCGACCTCATCGGCGCCCTGGAGAACCTCACCTC

SgGOX24：AGGAGCCGATGAAGCTGTGGATGAAGGCCAGCGGGAGACGTAGGTGAGGTTCTCCAGGGC

SgGOX25：CCACAGCTTCATCGGCTCCTCCCTCATCAGCCCCGACACGCCCTTCTACGAGGACCGAGC

SgGOX26：ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCCTCGTAGAAGGG

SgGOX27：GAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAT

SgGOX28：TGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCAATAATGAATCGGCCAACGCG

SgGOX29：TCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTCGCTCACTCATCA

SgGOX30：CATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTGATGAGTGAGCGAACTCAC

SgGOX31：TTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAGAACAATTTCACACAGGAA

SgGOX32：CGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTCT

SgGOX33：GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTACTACGACAAGGCGACCAAGGTG

SgGOX34：CCTCGGTGAACTCCCACCAGCGGCGGCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGTCGCCTTGTCGT

SgGOX35：CTGGTGGGAGTTCACCGAGGCGGACTGGAAACGGGAACTCGACGCCGTACGGCCGGGGCT

SgGOX36：CCCGTCGGCCGGCGCCCGGCCCGACCGGTAGTCCTCGTACAGCCCCGGCCGTACGGCGTC

SgGOX37：GCCGGGCGCCGGCCGACGGGAGCCTGCTCGGCGGGCATCCGTCCGTGCCGCCGGGGCACA

SgGOX38：CACCGGTTGGCGGCGTAGTGCACCCGCTGTCCCGCCGTGATGTGCCCCGGCGGCACGGAC

SgGOX39：CACTACGCCGCCAACCGGTGGGCCGGCCGCGACCAGCCCGAGGCGGCGCACATCGTCGGC

SgGOX40：TGATCATGAACCGGTTGGGGTTGTCGGAGACCGAGCCGCCGCCGACGATGTGCGCCGCCT

SgGOX41：CCCCAACCGGTTCATGATCAACCCGTCGCACCCGGTCGGCGGCAGCGCGGGCGGGGTCGT

SgGOX42：CCAGCGGGAGGCGTCGTCGGCCCAGCTGTACGAGGCGAGGACGACCCCGCCCGCGCTGCC

SgGOX43：CCGACGACGCCTCCCGCTGGGACTCCCTGGACGACGAGGCGCGCTACCCGCACGCCCTGC

SgGOX44：AAGACCTCGACGCGCCGGCCGTAGACCTGCTGGAGCCCGCGCAGGGCGTGCGGGTAGCGC

SgGOX45：GGCCGGCGCGTCGAGGTCTTCTACACGGGCGCGGGCCGCACCCAGAGCTGGCTGCGGGAT

SgGOX46：GACCGGGGAGCAGGACGGACGCCTCCCCGTACGCGTACGGATCCCGCAGCCAGCTCTGGG

SgGOX47：GTCCGTCCTGCTCCCCGGTCAGCACACGGAGCTGCTGAGCGCCATCCGCTCCGCCGAGGG

SgGOX48：CGGCTTGACCGAGGTGTGGTCGCCCGCGAAGAGCAGCGGGCCCTCGGCGGAGCGGATGGC

SgGOX49：ACCACACCTCGGTCAAGCCGTCGTGGATCGAGGGAGCCGTGGAGTCCGCCGTGCGTGCCG

SgGOX50：TCACGCTGTGTGGATCTCCAAGGCGGCACGCACGGCGGACTCC

以SgGOX1-SgGOX12；SgGOX13-SgGOX24；SgGOX25-SgGOX36；SgGOX37-SgGOX50為引物，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增SgGOX1、SgGOX2、SgGOX3、SgGOX4片段，在50μl反應(yīng)體系中，其中內(nèi)側(cè)引物SgGOX2-SgGOX11、SgGOX14-SgGOX23、SgGOX26-SgGOX35、SgGOX38-SgGOX49引物的添加量為2ng，外側(cè)引物SgGOX1、SgGOX12、SgGOX13、SgGOX24、SgGOX25、SgGOX36、SgGOX37、SgGOX50引物添加量為30ng，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，1min。共25個循環(huán)。擴(kuò)增片斷通過瓊脂糖凝膠回收，然后作為模版進(jìn)行拼接，擴(kuò)增小片段SGGOX1、SLG2、SgGOX3、SgGOX4各1μg，以SgGOX1和SgGOX50為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，3min。共25個循環(huán)。

轉(zhuǎn)化：PCR結(jié)束后，用1％瓊脂糖膠回收片段，取10μl直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4℃連接過夜，在DH5α感受態(tài)中高效轉(zhuǎn)化，獲得長度為2004bp的如SEQ ID No.1所示序列的陽性克隆，即為本發(fā)明的L-谷氨酸氧化酶基因，經(jīng)序列測定，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID No.2。

實(shí)施例5 L-谷氨酸氧化酶基因的大腸桿菌表達(dá)

將實(shí)施例4合成的L-谷氨酸氧化酶基因用BamH I和Sac I酶切后，通過T4 DNA連接酶將該基因與載體pET-28a(NEB公司)22℃連接2小時，得到一種表達(dá)載體pET-SgGOX，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司)，將轉(zhuǎn)化子涂布于LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16h。挑取單菌落接種于50mL含氨芐(終濃度100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)5h，OD₆₀₀約為0.6時，加入終濃度為0.4mM的IPTG，25℃誘導(dǎo)12h。將所得發(fā)酵培養(yǎng)液8000rpm離心去上清，收集濕細(xì)胞。取濕細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩次，再懸浮于pH6.5、100mM的磷酸-磷酸鈉緩沖液中(1g濕細(xì)胞/10ml緩沖液)得懸浮液，用超聲波處理懸浮液(功率為400W，超聲4s，間歇6s，重復(fù)99輪)，8000rpm離心取上清，即得粗酶液。用凝膠-蛋白純化試劑盒HisTrap HP(Amersham Biosciences公司)對其進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，獲得L-谷氨酸氧化酶蛋白。

經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，該L-谷氨酸氧化酶蛋白大小約73kDa，與預(yù)測值相符，具體電泳檢測結(jié)果參見圖1。

實(shí)施例6 L-谷氨酸氧化酶基因的酶活測定

L-谷氨酸氧化酶活力測定：反應(yīng)體系為1ml，包含pH 6.5、100mM磷酸鈉緩沖液，1mM的4-氨基安替安替吡啉，10mM的L-谷氨酸，10mM的苯酚，2000U/L的辣根過氧化物酶。在30℃下反應(yīng)，使用分光光度計測定505nm處吸光值。酶活定義為，每分鐘反應(yīng)生成1μmol過氧化氫所需的酶量為一個酶活單位U。蛋白含量采用Brandford法測定。

采用上述方法測定實(shí)施例5所得L-谷氨酸氧化酶活力，結(jié)果為：L-谷氨酸氧化酶的反應(yīng)活力為36.7U/mg。

實(shí)施例7 L-谷氨酸氧化酶基因的最適反應(yīng)溫度

采用實(shí)施例6所述L-谷氨酸氧化酶活力測定體系，設(shè)定反應(yīng)溫度分別為20-80℃。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，該L-谷氨酸氧化酶蛋白以L-谷氨酸為底物的最適反應(yīng)溫度為40℃，具體測定結(jié)果參見圖2。

實(shí)施例8 L-谷氨酸氧化酶基因的最適pH值

采用實(shí)施例6所述L-谷氨酸氧化酶活力測定體系，利用醋酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液以及甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液分別配制pH3-6、pH6-8.5、pH8.5-10.5反應(yīng)液，檢測酶的相對活性。檢測結(jié)果表明：該L-谷氨酸氧化酶的最適反應(yīng)pH值為7.5，具體測定結(jié)果參見 圖3。

實(shí)施例9 L-谷氨酸氧化酶的底物譜

反應(yīng)體系為1ml：取實(shí)施例5制得的L-谷氨酸氧化酶10μL，加入包含pH 6.5、100mM磷酸鈉緩沖液，1mM的4-氨基安替安替吡啉，10mM的苯酚，2000U/L的辣根過氧化物酶的反應(yīng)液中，分別加入各種底物(10mM)，30℃下反應(yīng)2min，使用分光光度計測定505nm處吸光值。

所述各種底物為L-谷氨酸(L-Glu)，D-谷氨酸(D-Glu)，L-谷氨酰胺(L-Gln)，L-天冬氨酸(L-Asp)，L-天冬酰胺(L-Asn)，L-甘氨酸(L-Gly)，L-精氨酸(L-Arg)，L-脯氨酸(L-Pro)，L-組氨酸(L-His)，L-酪氨酸(L-Tyr)，L-半胱氨酸(L-Cys)，結(jié)果如表1所示。

表1

由表1可知：本發(fā)明的L-谷氨酸氧化酶能特異性地催化L-谷氨酸，對D-谷氨酸和L-谷氨酰胺具有極低的催化活性，對其他被測氨基酸不具有催化活性。本發(fā)明的L-谷氨酸氧化酶底物專一性很強(qiáng)，可適用于L-谷氨酸含量檢測。