本發(fā)明涉及矮化植物的基因，還涉及含有所述矮化植物的基因的表達(dá)載體和細(xì)胞，以及一種矮化植物的方法，同時(shí)涉及含有該基因的表達(dá)載體和含有該基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在矮化植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在許多植物上，矮化是一個(gè)優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。近年來，各種矮化相關(guān)基因被鑒定和克隆，其中大部分是植物激素(如赤霉素、生長(zhǎng)素、油菜素類固醇類等)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因，其功能缺失或過量表達(dá)會(huì)造成植株矮化的表型；此外一些多胺類合成基因、細(xì)胞壁相關(guān)基因、同源異型盒基因、轉(zhuǎn)錄因子類基因以及其他一些生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因也被發(fā)現(xiàn)其功能的缺失會(huì)造成植株矮化。

水稻植株矮化一般認(rèn)為是矮稈基因的作用導(dǎo)致水稻植株形態(tài)學(xué)或細(xì)胞學(xué)的變化，如節(jié)間變短和細(xì)胞個(gè)數(shù)減少等；同時(shí)，基因的表達(dá)還受到外部環(huán)境和內(nèi)源條件的影響。而植物激素幾乎參與水稻生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過程，它們既可以獨(dú)立地發(fā)揮生理作用，也可以通過與其他激素或基因的相互作用來精確地調(diào)節(jié)植物的發(fā)育。

近年來，對(duì)植物矮化相關(guān)基因的遺傳學(xué)、矮化突變體的激素調(diào)控以及矮化相關(guān)基因的克隆和利用等方面開展了廣泛而深入的研究，尤其是利用基因工程手段控制植物株高方面取得了巨大進(jìn)步。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種矮化植物的基因及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種矮化植物的基因，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者對(duì)所述序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。

優(yōu)選地，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述植物為水稻。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的基因。

本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有權(quán)利要求1所述的基因。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為水稻轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種矮化植物的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述的基因?qū)氲剿炯?xì)胞中，得到矮化的轉(zhuǎn)基因水稻植株。

本發(fā)明還提供了矮化植物的基因、含有該基因的表達(dá)載體和含有該基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在矮化植物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述植物為水稻。

含有本發(fā)明的矮化植物的基因的水稻植株比其野生型矮小。

附圖說明

圖1是矮化植物的基因的PCR產(chǎn)物電泳圖，其中1-2泳道為426bp的該基因片段，M為2000bp的對(duì)照。

圖2是轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株中該基因的表達(dá)量(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝5)，其中星號(hào)表示轉(zhuǎn)基因株系與野生型存在顯著差異(**，P<0.01，學(xué)生氏t-檢驗(yàn))。Ov1-3為三個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系。

圖3是過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的表型變化，其中圖3A為30天時(shí)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的表型，圖3B為55天時(shí)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的表型，Ov1-3為三個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)材料

野生型日本晴(Nip，Nipponbare)種子購自日本水稻基因組資源中心。

1.2水稻培養(yǎng)條件

挑選飽滿、成熟一致的日本晴種子，用0.66％稀HNO₃破休眠處理16h，然后在37℃黑暗條件下催芽至露白并播種在尼龍網(wǎng)紗上，置于水稻營養(yǎng)液中培養(yǎng)，在營養(yǎng)液中培養(yǎng)一個(gè)月后種到土里。培養(yǎng)于培養(yǎng)箱或溫室中進(jìn)行，環(huán)境條件為：光照強(qiáng)度450μmol m^-2s^-1，濕度70％，溫度及光周期30℃/24℃，12h/12h。

1.3引物合成及測(cè)序

引物合成及測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1矮化植物的基因的克隆

從日本的Rice Genome Resource Center(http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp)上獲得了該基因的全長(zhǎng)cDNA克隆AK240906，以AK240906的質(zhì)粒為模板，用OU/L引物擴(kuò)增出基因的全長(zhǎng)。PCR引物序列如下：

OU：5’-CACCATGATCAGTGCCAGGAGA-3’

OL：5’-CAAGCAAGAAATATGCTGGTTGAC-3’

PCR條件為：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，15個(gè)循環(huán)；72℃10min。

2.2表達(dá)載體的構(gòu)建

將步驟2.1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，利用TaKaRa公司的凝膠回收試劑盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)進(jìn)行回收純化，具體操作方法參照其說明書；將純化后的片段連接到克隆載體pENTR中，24℃連接過夜后，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPO10感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)16-18h，挑取陽性單克隆菌落，提取質(zhì)粒送到上海生工測(cè)序；將序列正確的質(zhì)粒上的矮化基因的全長(zhǎng)片段通過LR反應(yīng)交換重組到過量表達(dá)載體pH7FGW2中。連接pENTR載體及LR反應(yīng)參照Invitrogen說明書(Code No.K2400-20和Code No.11791-020)。

2.3水稻成熟胚的誘導(dǎo)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因

以野生型水稻日本晴的成熟種子為試材誘導(dǎo)水稻愈傷組織，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將構(gòu)建好的超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻。轉(zhuǎn)化的水稻愈傷經(jīng)過農(nóng)桿菌共培養(yǎng)、陽性愈傷的篩選、愈傷分化出苗、小苗生根和煉苗后，移到大田繁種。具體如下：

2.3.1制備電擊感受態(tài)細(xì)胞，步驟如下：

(1)從劃線培養(yǎng)的無抗YEP平板上挑取EHA105單菌落。接種于少量的YEP液體培養(yǎng)基(已加50mg/L鏈霉素)，28℃震蕩培養(yǎng)過夜。

(2)吸取菌懸液1ml接種于100mlYEP(已加50mg/L鏈霉素)液體培養(yǎng)基中。28℃震蕩培養(yǎng)2h，從4h開始檢測(cè)，直到OD600＝0.3。(約4～5h)

(3)制備感受態(tài)細(xì)胞，步驟如下：

a).將培養(yǎng)液連同培養(yǎng)容器浸沒在冰上至少1h，并不時(shí)振蕩使所有的培養(yǎng)液能夠均勻制冷。

b).將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入同樣預(yù)冷的50ml離心管中。4℃，4000rpm離心10分鐘。

c).棄上清，用20ml預(yù)冷的HEPES(1mM，pH7.0)溶液輕輕懸浮細(xì)胞。

d).4℃，4000rpm離心10分鐘。棄上清。

e).重復(fù)步驟(3),(4)2-3次。

f).棄上清，加2ml預(yù)冷的10％甘油輕輕懸浮細(xì)胞。冰上放置幾分鐘。即成感受態(tài)細(xì)胞。

g).分裝100μl至1.5ml離心管。液氮速凍后于－70℃保存。

2.3.2農(nóng)桿菌感受態(tài)電轉(zhuǎn)法,步驟如下：

a)取2μl質(zhì)粒加到EHA 105感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘；

b)把質(zhì)粒和感受態(tài)混合液吸入電極杯，電擊轉(zhuǎn)化；

c)馬上加入l ml新鮮的SOC液體培養(yǎng)基，28℃,150rpm輕搖4-6h；

d)5000rpm離心1-2分鐘收集菌體，涂布于含有鏈霉素(50mg/L)和壯觀霉素(50mg/L)的YEP固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2-3d；

e)挑選單克隆菌落，鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌，-80℃保存。

2.3.3成熟胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織，步驟如下：

a)挑選飽滿光潔無菌斑的種子，脫殼；

b)將種子放入50ml無菌離心管中，倒入70％酒精消毒2分鐘；

c)倒去酒精，加入40ml 20-30％次氯酸鈉(NaClO)溶液，浸泡30分鐘；

d)倒去次氯酸鈉溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍，最后一遍浸泡30分鐘；

e)種子放在無菌濾紙上吸干，置入成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿12-14顆；

f)操作完畢用封口膜(Micropore^TM Surgical Tape)封好培養(yǎng)皿，在28℃光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3周；

g)在超凈工作臺(tái)上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織(淡黃色，致密呈球狀)，置入繼代培養(yǎng)基中，在28℃光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)5-10d。

2.3.4侵染和抗性愈傷組織的選擇

a)挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保藏的農(nóng)桿菌菌液50μl于5ml YEP(含50mg/L鏈霉素和50mg/L壯觀霉素)培養(yǎng)液中，28℃，250rpm振蕩培養(yǎng)12-24h至菌液OD₆₀₀為0.8-1.0；

b)取菌液500μl于1.5ml離心管中，4℃，4000rmp，離心2min，棄上清，用含200μmol/L AS(乙酰丁香酮)的30ml AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD₆₀₀的終濃度為0.01；

c)將長(zhǎng)到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5分鐘；

d)將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上瀝干30-40分鐘；

e)將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)2.5d；

f)將愈傷組織取出，用無菌水清洗5-6次，其間需不停的振蕩。再用250mg/L羧芐青霉素鈉carb(或500mg/L頭孢拉定cef)的無菌水清洗1～2遍。最后置于無菌濾紙上瀝干1-2h；

g)將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含300mg/L羧芐青霉素鈉carb(或500mg/L頭孢拉定cef)和50mg/L潮霉素hyg的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇，每皿25顆(一顆初始愈傷作為一個(gè)株系)，28℃，光照培養(yǎng)14d；

h)將長(zhǎng)大的初始愈傷轉(zhuǎn)到含300mg/L羧芐青霉素鈉carb(或500mg/L頭孢拉定cef)和80mg/L潮霉素hyg選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇，每皿12顆，28℃，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長(zhǎng)出。

2.3.5抗性愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根

a)挑取從同一愈傷來的顏色鮮黃的抗性愈傷3-7顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的分化罐中(1罐1個(gè)株系為佳)，放入25℃恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗(20-50d)；

b)待苗長(zhǎng)至頂?shù)椒只奚w子時(shí)，將再生的植株用無菌的剪刀去掉根(小心不要傷了根莖結(jié)合部)，放入生根培養(yǎng)基中生根壯苗；

c)7d之后，將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑出(苗長(zhǎng)至試管頂部，就要及時(shí)開蓋)，打開封口膜，加入適量蒸餾水或無菌水(防止培養(yǎng)長(zhǎng)菌)，煉苗3d左右至苗挺立，然后洗去瓊脂，溶液培養(yǎng)1-2周，檢測(cè)。

2.4轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

提取轉(zhuǎn)基因植株的葉片總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA。RNA的提取采用天根公司的RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(Code No.DP432)，逆轉(zhuǎn)錄及cDNA的制備采用TaKaRa公司的1st-Strand cDNA合成試劑盒(Code No.D2639A)，按其說明書進(jìn)行。定量RT-PCR使用TakaRa公司的Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)定量試劑盒進(jìn)行。引物序列如下：

qRTF：ATGATCAGTGCCAGGAGACTTG

qRTR：AAGACTGCAGTGCCGAGGTAC

反應(yīng)體系如下：

分析用羅氏公司的80System Real Time PCR擴(kuò)增儀，PCR反應(yīng)條件如下：95℃10min；95℃10s,60℃15s,72℃10s,40個(gè)循環(huán)；95℃5s,65℃1min；40℃30s。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1矮化植物的基因的克隆

根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物序列，使用PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)連接到克隆載體pENTR，菌液PCR進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖1所示，并將菌液送到上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)了克隆獲得了本發(fā)明的矮化植物的基因。

3.2熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)基因株系中該基因表達(dá)倍數(shù)

將構(gòu)建的含有該矮化植物的基因編碼區(qū)的超表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化野生型(NIP)成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，并通過鑒定、篩選，共得到10個(gè)純合的T2代轉(zhuǎn)基因超表達(dá)株系。用熒光定量PCR方法在RNA水平對(duì)這些株系中該基因表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行了分析(見圖2)，結(jié)果顯示這10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中該基因的表達(dá)倍數(shù)都有不同程度的提高。從這些株系中隨機(jī)選取三個(gè)株系進(jìn)行表型觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，圖2示三個(gè)株系中該基因的表達(dá)倍數(shù)提高了6～10倍。

3.3過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的表型變化。

對(duì)3.2中經(jīng)過鑒定、篩選的轉(zhuǎn)基因株系，選取三個(gè)進(jìn)行表型觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果見表1和圖3。

表1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻株系與野生型株高比較

表1是過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系在30天和55天苗齡時(shí)的株高統(tǒng)計(jì)，Ov1-3為三個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系。表1和圖3結(jié)果表明：在30天和55天苗齡時(shí)的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻株系明顯矮于野生型。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。