本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種核酸適配體及其篩選和應(yīng)用，尤其涉及一種可用于檢測(cè)人胰多肽的核酸適配體及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人胰多肽是由胰腺分泌的一種由36個(gè)氨基酸組成的多肽激素。人胰多肽具有如下生理作用：(1)抑制膽囊收縮素和胰酶的排放，使膽囊平滑肌松弛，可降低膽囊內(nèi)的壓力，膽總管括約肌緊張加強(qiáng)，抑制膽汁向十二指腸的排放；(2)抑制餐后胰液和膽汁分泌，抑制胰泌素和膽囊收縮素等對(duì)胰腺分泌的促進(jìn)作用；(3)在胃腸道中抑制五肽胃泌素引起的胃酸分泌；(4)抑制血漿胃動(dòng)素的分泌，增加食管下括約肌的壓力，抑制胃體部肌電活動(dòng)。核酸適配體(即aptamer)，是通過(guò)指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)篩選出的一段單鏈DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)序列。核酸適配體能自身形成特定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，與目標(biāo)高特異性、高親和力地結(jié)合。此外，核酸適配體還有分子量小、無(wú)毒、易合成和修飾的特點(diǎn)。由于核酸適配體可簡(jiǎn)便快速地合成，成本較低，尺寸較小，且用途廣泛，它們已經(jīng)成為辨別細(xì)胞內(nèi)外目標(biāo)分子的有力工具。核酸適配體可識(shí)別的目標(biāo)物的范圍很廣，近年來(lái)它已經(jīng)發(fā)展成一種新型的分子探針，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域也有一定的進(jìn)展。因此，篩選人胰多肽的aptamer對(duì)于發(fā)展新的檢測(cè)方法及研究其生理作用有一定的價(jià)值。傳統(tǒng)的核酸適配體篩選方法往往需要固定文庫(kù)或靶標(biāo)，這包括共價(jià)固定及非共價(jià)固定兩種途徑。不論是哪種固定方法，經(jīng)固定的文庫(kù)或靶標(biāo)的天然構(gòu)象在一定程度上都會(huì)受到影響。此外，用于固定的載體還會(huì)對(duì)文庫(kù)與靶標(biāo)的結(jié)合產(chǎn)生空間位阻，這些都不利于篩選得到游離態(tài)下結(jié)合能力強(qiáng)的序列，因此發(fā)展非固定的的核酸適配體篩選方法顯得尤為重要。本文利用氧化石墨烯能夠很好的吸附單鏈DNA并可經(jīng)離心去除的特點(diǎn)，將氧化石墨烯引入到篩選的過(guò)程中，降低非特異性吸附，有效地去除未結(jié)合的單鏈DNA，并且不影響aptamer與靶標(biāo)的結(jié)合。該方法大大地提高了篩選的效率，節(jié)約了勞動(dòng)力和降低了成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無(wú)免疫原性、能夠化學(xué)合成、分子量小、穩(wěn)定、易于保存和標(biāo)記的可用于檢測(cè)人胰多肽的核酸適配體；還提供了上述核酸適配體的篩選方法及在制備檢測(cè)人胰多肽的試劑盒中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供了一種人胰多肽核酸適配體，所述人胰多肽核酸適配體為以下序列1～7中的任意一種：序列1為Q10，所述Q10的序列為SEQIDNO.1所示的序列；序列2為5’-Q11-FAM-3’，所述Q11的序列為SEQIDNO.2所示的序列；序列3為5’-Q12-FAM-3’，所述Q12的序列為SEQIDNO.3所示的序列；序列4為5’-BHQ1-Q13-3’，所述Q13的序列為SEQIDNO.4所示的序列；序列5為5’-Q14-BHQ1-3’；所述Q14的序列為SEQIDNO.5所示的序列；序列6為5’-SH-Q16-3’，所述Q15的序列為SEQIDNO.6所示的序列；序列7為5’-SH-Q17-3’，所述Q15的序列為SEQIDNO.7所示的序列。具體為：序列1：5’-GGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGC-3’。序列2：5’-GGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGCT-FAM-3’。序列3：5’-CGTGCAATGTCGAATGCATGAGCAAACATGGCGAT-FAM-3’。序列4：5’-BHQ1-TGGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGC-3’。序列5：5’-GGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGCT-BHQ1-3’。序列6：5’-SH-TTTTTTTTTTGGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGC-3’。序列7：5’-SH-TTTTTTTTTTCGTGCAATGTCGAATGCATGAGCAAACATGGCGAT-3’。上述的人胰多肽核酸適配體，優(yōu)選的，所述序列1～7的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。上述的核苷酸序列被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化后性能不會(huì)改變，還可以識(shí)別人胰多肽。上述的人胰多肽核酸適配體，優(yōu)選的，所述序列1～7的核苷酸序列上結(jié)合有生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米材料或酶標(biāo)記。上述的生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、酶標(biāo)記可結(jié)合在核苷酸序列的任意位置。上述的人胰多肽核酸適配體，優(yōu)選的，所述熒光物質(zhì)包括熒光素、羅丹明、花青素。上述的人胰多肽核酸適配體，優(yōu)選的，所述納米材料為金納米顆粒。上述的人胰多肽核酸適配體，優(yōu)選的，所述酶標(biāo)記為辣根過(guò)氧化物酶。上述的人胰多肽核酸適配體，優(yōu)選的，所述人胰多肽核酸適配體還包括以下三種序列中的任意一種：(1)與所述人胰多肽核酸適配體的核苷酸序列的同源性在80％以上；(2)與所述人胰多肽核酸適配體的核苷酸序列進(jìn)行雜交的序列；(3)所述人胰多肽核酸適配體的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。上述的人胰多肽核酸適配體，優(yōu)選的，所述人胰多肽核酸適配體還包括所述人胰多肽核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者所述人胰多肽核酸適配體改造成的相應(yīng)肽核酸。作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述人胰多肽核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟：S1、合成隨機(jī)文庫(kù)和引物：隨機(jī)文庫(kù)采用RS35隨機(jī)文庫(kù)：5’-AGCGTCGGATACCACTACTA–NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-ATCATGGAGTTCGTGGTCAG-3’，5’引物：5’-FAM-AGCGTCGGATACCACTACTA-3’，3’引物：5’-Biotin-CTGACCACGAACTCCATGAT-3’；S2、GO-SELEX篩選：將人胰多肽干粉溶解于緩沖溶液中，與隨機(jī)序列進(jìn)行孵育；然后加入含有氧化石墨烯的緩沖液進(jìn)行孵育，經(jīng)離心收集上清，即為人胰多肽特異核酸適配體文庫(kù)；S3、PCR擴(kuò)增文庫(kù)：將所述人胰多肽特異核酸適配體文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；S4、制備DNA單鏈文庫(kù)：將鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球離心去上清，再將所述擴(kuò)增產(chǎn)物與瓊脂糖微球在常溫下孵育；然后加入堿液至瓊脂糖微球中，常溫下反應(yīng)、離心、收集上清液；將所述上清液過(guò)除鹽柱后收集滴下的溶液，即為DNA單鏈文庫(kù)；S5、重復(fù)篩選：將所述DNA單鏈文庫(kù)替代所述步驟S2中的隨機(jī)文庫(kù)，并重復(fù)上述步驟S2～S4的過(guò)程至少一次；S6、陰性篩選：將牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血紅蛋白干粉溶解于緩沖溶液中，然后與所述DNA單鏈文庫(kù)孵育；然后加入含有氧化石墨烯的緩沖液進(jìn)行孵育，經(jīng)離心棄去上清，再加入緩沖溶液將氧化石墨烯重新分散均勻，收集此時(shí)的氧化石墨烯溶液；S7、多輪篩選：將S6所收集的氧化石墨烯溶液替代S5的DNA單鏈文庫(kù)，繼續(xù)重復(fù)上述步驟S5～S6的操作過(guò)程；直至篩選出對(duì)人胰多肽的識(shí)別能力滿足要求的核酸適配體。上述的篩選方法，優(yōu)選的，所述步驟S2中具體為：將人胰多肽干粉溶解于緩沖溶液中，與隨機(jī)序列在37℃下孵育2h；然后加入含有氧化石墨烯的緩沖液在25℃下孵育25min，經(jīng)離心收集上清，即為人胰多肽特異核酸適配體文庫(kù)；所述隨機(jī)序列與所述氧化石墨烯的比例為1.67nmol/mg。上述的篩選方法，優(yōu)選的，所述S3步驟中，所述PCR擴(kuò)增的工藝條件為：94℃預(yù)變性10min，94℃下變性30sec，56.9℃退火30sec，72℃延伸30sec，循環(huán)10～20輪，最后于72℃下最后延伸7min；所述步驟S4中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物與瓊脂糖微球在常溫下孵育的時(shí)間為0.5h，加入堿液至瓊脂糖微球中，常溫下反應(yīng)15min。作為本發(fā)明的同一技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述人胰多肽核酸適配體在制備檢測(cè)人胰多肽的試劑盒中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明提供了一種人胰多肽核酸適配體，相比于蛋白抗體具有更高的親和力與特異性；能特異性且高親和力的識(shí)別人胰多肽，解離常數(shù)在納摩爾范圍以內(nèi)。(2)本發(fā)明提供了一種人胰多肽核酸適配體，無(wú)免疫原性；能夠體外化學(xué)合成，分子量小，可以對(duì)不同部位進(jìn)行修飾和取代，且序列穩(wěn)定，易于保存；便于標(biāo)記(不需要標(biāo)記的二抗)。(3)本發(fā)明提供了一種人胰多肽核酸適配體的篩選方法，采用氧化石墨烯輔助的人胰多肽核酸適配體篩選，可以大大地提高篩選的效率，從而降低成本，節(jié)約勞動(dòng)力。(4)本發(fā)明提供了一種人胰多肽核酸適配體在檢測(cè)人胰多肽中的應(yīng)用，操作更為簡(jiǎn)單、迅速，且周期短，重現(xiàn)性好。由于核酸適配體的合成成本較抗體制備成本低，所以檢測(cè)成本也相應(yīng)低。利用本發(fā)明的核酸適配體對(duì)其結(jié)合的靶分子進(jìn)行研究，還可以更好地了解它的生理功能，在胰多肽瘤的診斷方面有良好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。圖1為本發(fā)明實(shí)施例中氧化石墨烯輔助篩選的原理和主要步驟示意圖，模式一為陽(yáng)性篩選的過(guò)程，模式二為陰性和陽(yáng)性篩選組合進(jìn)行的過(guò)程。圖2為本發(fā)明實(shí)施例中利用IDTDNA軟件模擬的Q10核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例中利用IDTDNA軟件模擬的FAM-Q11核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例中利用IDTDNA軟件模擬的FAM-Q12核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例中利用IDTDNA軟件模擬的BHQ1-Q13核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例中利用IDTDNA軟件模擬的BHQ1-Q14核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。圖7為本發(fā)明實(shí)施例中利用IDTDNA軟件模擬的SH-Q16核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。圖8為本發(fā)明實(shí)施例中利用IDTDNA軟件模擬的SH-Q17核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。圖9為本發(fā)明實(shí)施例中非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳考察序列Q10對(duì)人胰多肽結(jié)合情況的檢測(cè)結(jié)果。圖10為本發(fā)明實(shí)施例中多功能酶標(biāo)儀考察Q11與人胰多肽結(jié)合情況的檢測(cè)結(jié)果。圖11為本發(fā)明實(shí)施例中多功能酶標(biāo)儀考察Q11與人胰多肽結(jié)合能力的檢測(cè)結(jié)果。圖12為本發(fā)明實(shí)施例中熒光光譜儀考察孵育時(shí)間對(duì)Q11與人胰多肽結(jié)合的影響的檢測(cè)結(jié)果。圖13為本發(fā)明實(shí)施例中熒光光譜儀考察溫度對(duì)Q11與人胰多肽結(jié)合的影響的檢測(cè)結(jié)果。圖14為多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)Q11與人胰多肽抗體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)別。圖15為多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)Q11與人胰多肽結(jié)合的選擇性。圖16為熒光光譜儀檢測(cè)Q12和Q13與人胰多肽結(jié)合的模式。圖17為熒光光譜儀檢測(cè)Q14和Q15與人胰多肽的結(jié)合部位。圖18動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)Q16和Q17對(duì)人胰多肽的檢測(cè)效果。圖19動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)Q16和Q17檢測(cè)人胰多肽的選擇性。具體實(shí)施方式以下結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。實(shí)施例1：一種可用于檢測(cè)人胰多肽的核酸適配體，包括：序列1(Q10)：5’-GGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGC-3’(SEQIDNO.1)。序列2(FAM-Q11)：5’-GGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGCT-FAM-3’(SEQIDNO.2)。序列3(FAM-Q12)：5’-CGTGCAATGTCGAATGCATGAGCAAACATGGCGAT-FAM-3’(SEQIDNO.3)。序列4(BHQ1-Q13)：5’-BHQ1-TGGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGC-3’(SEQIDNO.4)。序列5(BHQ1-Q14)：5’-GGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGCT-BHQ1-3’(SEQIDNO.5)。序列6(SH-Q16)：5’-SH-TTTTTTTTTTGGCACCGCTGTTTTAGCCTCGGCTGAGACAAGGGC-3’(SEQIDNO.6)。序列7(SH-Q17)：5’-SH-TTTTTTTTTTCGTGCAATGTCGAATGCATGAGCAAACATGGCGAT-3’(SEQIDNO.7)。陰性對(duì)照(FAM-Random)：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-FAM-3’。封閉探針(FAM-Q15)：5’-FAM-AGCCTTTGTTTCATCCGAGG-3’。輔助探針(SH-Q18)：5’-SH-TTTTTTTTTT-3’。注：N代表A、T、G、C中任一堿基。本實(shí)施例上述條序列中，七條可用于檢測(cè)人胰多肽，分別為Q10、FAM-Q11、FAM-Q12、BHQ1-Q13、BHQ1-Q14、SH-Q16、SH-Q17；FAM-Random作為陰性對(duì)照；FAM-Q15作為封閉探針；SH-Q18作為輔助探針。Q10、FAM-Q11、FAM-Q12、BHQ1-Q13、BHQ1-Q14、SH-Q16、SH-Q17主要采用以下篩選方法篩選得到，如圖1所示，具體包括以下步驟：一種本實(shí)施例的人胰多肽核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟：1、合成以下序列所示的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物：隨機(jī)文庫(kù)RS35：5’-AGCGTCGGATACCACTACTA-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N代表A，T，G，C四個(gè)堿基中的一種)-ATCATGGAGTTCGTGGTCAG-3’；5’引物：5’-FAM-AGCGTCGGATACCACTACTA-3’；3’引物：5’-Biotin-CTGACCACGAACTCCATGAT-3’。2、緩沖溶液的配制：2.11×BindingBuffer(pH＝7.35)的配制：分別稱取2.383gHEPES，3.510gNaCl，0.186gKCl，以及0.203gMgCl2·6H2O溶解于200mL滅菌水中，調(diào)節(jié)pH值至7.35，加水定容至500mL得到1×BindingBuffer，其中HEPES的濃度為20mM，NaCl的濃度為120mM，KCl的濃度為5mM，MgCl2的濃度為2mM，然后將1×BindingBuffer于4℃冰箱中保存。2.2濃度為20mM的PBS溶液(pH＝7.5)的配制：稱取0.2940gNaH2PO4·2H2O，2.8960gNa2HPO4·12H2O，4.390gNaCl加滅菌水至200mL，調(diào)pH至7.5，定容于500mL容量瓶，4℃保存。2.3濃度為200mM的NaOH溶液的配制：稱取0.800gNaOH，加少量滅菌水溶解，定容于100mL容量瓶，4℃保存。2.4抗體孵育液(20mMPBS，0.05％Tween-20，pH＝7.5)的配制：稱取0.2940gNaH2PO4·2H2O，2.8960gNa2HPO4·12H2O，4.390gNaCl加滅菌水至200mL，加入50μLTween-20，調(diào)pH至7.5，定容于500mL容量瓶，4℃保存。2.5濃度為30mM的PBS溶液(pH＝7.4)的配制：稱取0.0889gNaH2PO4·2H2O，0.8699gNa2HPO4·12H2O，1.7532gNaCl，加滅菌水至60mL，充分溶解后，定容于100mL容量瓶，4℃保存。3、GO-SELEX篩選獲得人胰多肽特異核酸適體文庫(kù)，原理如圖1所示：3.1隨機(jī)文庫(kù)預(yù)處理：將裝有5nmol隨機(jī)文庫(kù)RS35的離心管置于離心機(jī)中，在9000g下離心10min，小心取出離心管，避免晃動(dòng)，迅速加入400μL的1×BindingBuffer，將離心管置于95℃下加熱5min后，立即取出并冰浴5min，再取出置于室溫下維持5min得到預(yù)處理后的隨機(jī)文庫(kù)。3.2孵育：用50μL的1×BindingBuffer溶解200μg人胰多肽干粉得到人胰多肽溶液，將人胰多肽溶液加入到步驟3.1中預(yù)處理后的隨機(jī)文庫(kù)中，在37℃下孵育2h。3.3解離：孵育完成后加入氧化石墨烯分散液(氧化石墨烯分散液的終濃度為30μg/mL)，在25℃下吸附25min，然后在20800g下離心10min，收集上清，即為篩選所得人胰多肽的特異核酸適配體文庫(kù)。4、進(jìn)行PCR擴(kuò)增文庫(kù)：取100μL篩選所得的人胰多肽特異核酸適配體文庫(kù)進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃下預(yù)變性10min，94℃下變性30sec，56.9℃下退火30sec，72℃下延伸30sec，循環(huán)10輪，最后在72℃下最后延伸7min。第一輪篩選后需將全部所的人胰多肽特異核酸適體文庫(kù)預(yù)擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，再進(jìn)行本步驟的擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。5、制備DNA單鏈文庫(kù)：將200μL鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球2200g離心去上清，再用500μLPBS洗滌，離心去上清；重復(fù)洗滌兩次。將步驟3中PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物與瓊脂糖微球在常溫下孵育半小時(shí)，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面。然后2200g離心去上清，用PBS離心洗滌三次；再加入200mMNaOH溶液500μL至瓊脂糖微球中用于雙鏈DNA的變性處理，常溫反應(yīng)15min，2200g離心5min，收集上清；除鹽柱用10mL無(wú)菌水洗滌后，加入堿變性后收集得到的上清液，自然滴完。加入1mL無(wú)菌水，收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫(kù)。6、重復(fù)篩選：將步驟5得到的DNA單鏈文庫(kù)替代步驟3中的隨機(jī)文庫(kù)，重復(fù)上述步驟3～5所示的陽(yáng)性篩選、PCR擴(kuò)增及制取單鏈DNA文庫(kù)過(guò)程，重復(fù)4次。7、陰性篩選：在第五輪篩選及以后，以人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白為對(duì)照，將步驟5后篩選得到的DNA單鏈文庫(kù)進(jìn)行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為：將人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白干粉溶解于緩沖溶液中，然后與步驟5后篩選得到的DNA單鏈文庫(kù)孵育；然后加入含有氧化石墨烯的緩沖液進(jìn)行孵育，經(jīng)離心棄去上清，再加入緩沖溶液將氧化石墨烯重新分散均勻，收集此時(shí)的氧化石墨烯溶液。8、多輪篩選：將步驟7所收集的氧化石墨烯溶液替代步驟6中的DNA單鏈文庫(kù)，繼續(xù)重復(fù)進(jìn)行上述步驟6～7的操作過(guò)程，在第一輪篩選以后，用于孵育篩選的文庫(kù)量約為500pmol，從第三輪篩選開始，靶標(biāo)與隨機(jī)文庫(kù)的比例開始下降，比值從10下降至1；重復(fù)篩選過(guò)程中用熒光光譜儀監(jiān)測(cè)所得DNA單鏈文庫(kù)對(duì)人胰多肽識(shí)別能力的增強(qiáng)情況，直至18輪篩選后DNA單鏈文庫(kù)對(duì)人胰多肽的識(shí)別能力滿足要求，將所得產(chǎn)物經(jīng)高通量序分析。對(duì)測(cè)序結(jié)果整理分析后，最終可得到富集度高的七條序列：Q10、Q11、Q12、Q13、Q14、Q16、Q17，這七條序列即為上述本實(shí)施例的可用于檢測(cè)人胰多肽的核酸適配體?？疾?：用IDTDNA軟件對(duì)該本實(shí)施例七條序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬。用IDTDNA軟件對(duì)本實(shí)施例的七條序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬后的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2至圖8所示，模擬結(jié)果顯示七條序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)都含有莖環(huán)部分，表明其可以進(jìn)一步卷曲成三級(jí)結(jié)構(gòu)與人胰多肽結(jié)合?？疾?：非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)序列1(Q10)與人胰多肽的結(jié)合效果。具體考察方法包括以下步驟：將Q10進(jìn)行變性處理：95℃下加熱5min后，立即取出并冰浴5min，再在室溫下維持5min。實(shí)驗(yàn)組：取5μL濃度為5μM變性好的DNA序列與5μL濃度為100μM的人胰多肽于一200μLPCR管中混合；對(duì)照組：取5μL濃度為5μM變性好的DNA序列和5μL的1×BindingBuffer于另一200μLPCR管中混合，兩個(gè)PCR管都分別在25℃下孵育2h。孵育結(jié)束后，向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組的10μL樣品中均加入3μL上樣緩沖溶液(上樣緩沖液含0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF、30％甘油)、2μLSYBRGOLD染料得到混合液，將混合液混合好后，取10μL點(diǎn)入18％非變性聚丙烯酰胺凝膠的點(diǎn)樣孔中，以恒流模式10mA于1×TBE緩沖液中進(jìn)行電泳，電泳槽應(yīng)避光。待紫色溴酚藍(lán)條帶跑至離凝膠底部約1cm時(shí)停止電泳，取出拍照。非變性聚丙烯酰胺凝膠配制方法(10mL體系)：30％丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺6mL，5×TBE緩沖液2mL，超純水1.93mL，10％過(guò)硫酸銨70μL，TEMED7μL。電泳緩沖液(TBE，5×/500mL)的配制方法：Tris-base27g，Na2EDTA·2H2O1.86g，硼酸13.75g，加入400mL超純水，調(diào)至pH＝8.3，并將溶液定容于500mL容量瓶。檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，泳道1為對(duì)照組，泳道2為實(shí)驗(yàn)組，泳道2相對(duì)于泳道1存在一定位移，是人胰多肽與Q10結(jié)合后影響Q10的二級(jí)結(jié)構(gòu)從而影響其電泳速度，說(shuō)明本實(shí)施例的Q10核酸適配體對(duì)人胰多肽有識(shí)別能力?？疾?：用多功能酶標(biāo)儀、氧化石墨烯檢測(cè)序列2(FAM-Q11)與人胰多肽的結(jié)合效果。按照考察2的方法將FAM-Q11進(jìn)行變性處理。將變性好的FAM-Q11與終濃度為1μM的人胰多肽于EP管中混合，F(xiàn)AM-Q11的終濃度分別為10、25、50、75、100、150、200、300nM。混合好置于25℃恒溫箱中孵育2h，后加入氧化石墨烯并控制其與FAM-Q11的比例為2nmol/mg，再孵育25min。以20800g離心15min后收集上清液，利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)上清液的熒光。以熒光變化值為縱坐標(biāo)，DNA的濃度為橫坐標(biāo)，由Y＝Bmax×X/(Kd+X)方程模擬曲線，得到本實(shí)施例FAM-Q11的解離常數(shù)繪制曲線如圖10，由此可得到解離常數(shù)Kd如下表1所示。表1：解離常數(shù)結(jié)果序列名稱解離常數(shù)(納摩爾)Q1124.72±13.40由圖10可知，F(xiàn)AM-Q11與人胰多肽的結(jié)合符合米氏方程，是典型的蛋白與配體結(jié)合模式；解離常數(shù)Kd處于納摩爾級(jí)別，表明FAM-Q11與人胰多肽的結(jié)合具有較強(qiáng)的親和力?？疾?：多功能酶標(biāo)儀、氧化石墨烯檢測(cè)核酸適配體FAM-Q11與人胰多肽的結(jié)合效果及特異性。按照考察2的方法分別將FAM-Q11和陰性對(duì)照(FAM-Random)進(jìn)行變性處理。將變性好的FAM-Q11、FAM-Random與不同濃度的人胰多肽于黑色酶標(biāo)板中混合FAM-Q11、FAM-Random終濃度均為50nM，人胰多肽的終濃度分別為0、0、100、250、500、1000、1250、1500nM?；旌虾煤髮⒚笜?biāo)板置于25℃恒溫箱中孵育2h，后加入氧化石墨烯并使其終濃度為18μg/mL，再于25℃恒溫箱中孵育25min(第一組0nM人胰多肽作為熒光初始值，孵育后不加氧化石墨烯)。孵育結(jié)束后利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)FAM的熒光。結(jié)果如圖11所示：相對(duì)于隨機(jī)序列FAM-Random，F(xiàn)AM-Q11與人胰多肽結(jié)合的信號(hào)更強(qiáng)，說(shuō)明本實(shí)施例的FAM-Q11對(duì)人胰多肽有強(qiáng)的特異性識(shí)別能力?？疾?：熒光光譜儀、氧化石墨烯檢測(cè)孵育時(shí)間對(duì)核酸適配體FAM-Q11與人胰多肽的結(jié)合效果的影響。按照考察2的方法將FAM-Q11進(jìn)行變性處理。將變性好的FAM-Q11與終濃度為1500nM的人胰多肽混合，在25℃下分別孵育15min、30min、45min、60min、90min后加入終濃度為18μg/mL的氧化石墨烯，再孵育25min，此時(shí)FAM-Q11的終濃度均為50nM。最后用熒光光譜儀檢測(cè)FAM的熒光，并計(jì)算不同孵育時(shí)間下的熒光恢復(fù)率。結(jié)果如圖12所示，在45min以后熒光恢復(fù)率基本達(dá)到平臺(tái)，說(shuō)明本實(shí)施例的FAM-Q11與人胰多肽的結(jié)合較快。考察6：熒光光譜儀、氧化石墨烯檢測(cè)溫度對(duì)核酸適配體FAM-Q11與人胰多肽的結(jié)合效果的影響。按照考察2的方法將FAM-Q11進(jìn)行變性處理。將變性好的FAM-Q11與終濃度分別為0nM及1500nM的人胰多肽混合，在4℃、15℃、25℃、37℃四個(gè)不同溫度下孵育，DNA序列的終濃度均為50nM。孵育2h后，加入氧化石墨烯并使其終濃度為18μg/mL，再孵育25min。最后用熒光光譜儀檢測(cè)FAM的熒光，并計(jì)算不同溫度下的熒光恢復(fù)率。結(jié)果如圖13所示，四個(gè)溫度下的熒光恢復(fù)率差別不大，說(shuō)明溫度對(duì)本實(shí)施例的FAM-Q11與人胰多肽的結(jié)合影響不明顯?？疾?：多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)核酸適配體FAM-Q11與人胰多肽抗體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)別。人胰多肽抗體在磁珠上的固定：取50μL蛋白A包被的磁珠，經(jīng)磁場(chǎng)分離棄去上清液。加入200μL抗體孵育液(抗體孵育液配置方法見實(shí)施例1的2.4部分)進(jìn)行洗滌，經(jīng)磁場(chǎng)分離棄去上清液，反復(fù)洗滌磁珠三次；洗滌后加入5μg人胰多肽抗體，在37℃下孵育30min；孵育結(jié)束后經(jīng)磁場(chǎng)分離棄去上清液，并用200μL抗體孵育液洗滌磁珠三次，最終將磁珠分散在500μL抗體孵育液中。按照考察2的方法將FAM-Q11進(jìn)行變性處理。變性好的FAM-Q11與終濃度分別為0、100、200nM的人胰多肽混合，F(xiàn)AM-Q11的終濃度均為20nM，25℃下孵育1.5h。隨后加入20μL固定好人胰多肽抗體的磁珠，再孵育30min。孵育結(jié)束后經(jīng)磁場(chǎng)分離取上清液，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)上清液中FAM的熒光。結(jié)果如圖14所示：FAM-Q11與不同濃度人胰多肽孵育后加入固定有人胰多肽抗體的磁珠，孵育后上清液中熒光下降，說(shuō)明人胰多肽與FAM-Q11結(jié)合后還能被抗體捕獲，表明FAM-Q11和人胰多肽結(jié)合的位點(diǎn)與抗體和人胰多肽結(jié)合的位點(diǎn)不同。考察8：多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)核酸適配體FAM-Q11與人胰多肽結(jié)合的選擇性。按照考察7的方法將人胰多肽抗體固定到磁珠上。按照考察2的方法將FAM-Q11進(jìn)行變性處理。變性好的FAM-Q11分別與人胰多肽、胰島素、胰高血糖素、蛋白激酶A底物肽、谷胱甘肽混合，F(xiàn)AM-Q11的終濃度均為20nM，人胰多肽的終濃度分別為0、200nM、胰島素的終濃度分別為0、200nM、胰高血糖素的終濃度分別為0、200nM、蛋白激酶A底物肽的終濃度分別為0、200nM、谷胱甘肽的終濃度分別為0、200nM，25℃下孵育1.5h。隨后加入20μL固定好人胰多肽抗體的磁珠，再孵育30min。孵育結(jié)束后經(jīng)磁場(chǎng)分離取上清液，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)上清液中FAM的熒光，并計(jì)算熒光變化率。結(jié)果如圖15所示，F(xiàn)AM-Q11與不同物質(zhì)孵育后加入固定有人胰多肽抗體的磁珠，只有人胰多肽組的上清液熒光下降，說(shuō)明只有人胰多肽在與FAM-Q11結(jié)合后還能抗體捕獲，具有特異性。考察9：熒光光譜儀檢測(cè)本實(shí)施例兩條核酸適配體FAM-Q12(序列3)、BHQ1-Q13(序列4)與人胰多肽的結(jié)合模式。按照考察2的方法，將FAM-Q12及BHQ1-Q13混合后進(jìn)行變性處理。將變性好的FAM-Q12及BHQ1-Q13分別與終濃度為0、10、20、50、100nM的人胰多肽混合，在25℃下孵育4h，F(xiàn)AM-Q12及BHQ1-Q13的終濃度均為100nM。孵育結(jié)束后利用熒光光譜儀檢測(cè)溶液中FAM的熒光。結(jié)果如圖16所示：隨著人胰多肽濃度的增加，溶液的熒光強(qiáng)度下降，說(shuō)明熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離被拉近，熒光被淬滅，這表明FAM-Q12及BHQ1-Q13可以同時(shí)與人胰多肽結(jié)合，形成三明治夾心結(jié)構(gòu)。并且，本實(shí)施例中SH-Q16和SH-Q17也可以同時(shí)與胰多肽結(jié)合，形成三明治夾心結(jié)構(gòu)?？疾?0：熒光光譜儀檢測(cè)核酸適配體BHQ1-Q14(序列5)、FAM-Q15(封閉探針)與人胰多肽的結(jié)合部位。BHQ1-Q14和FAM-Q15進(jìn)行退火處理：將BHQ1-Q14和FAM-Q15混合好后置于95℃中加熱5min，后置于室溫使其自然冷卻2h。將退火好的BHQ1-Q14和FAM-Q15與終濃度分別為0nM和50nM的人胰多肽混合，在25℃下孵育2h，其中BHQ1-Q14的終濃度為20nM，F(xiàn)AM-Q15的終濃度為25nM。另設(shè)一對(duì)照組為終濃度20nM的BHQ1-Q14，也在25℃下孵育2h。孵育結(jié)束后用熒光光譜儀檢測(cè)FAM的熒光。結(jié)果如圖17所示：標(biāo)記了淬滅基團(tuán)的Q14為識(shí)別序列，標(biāo)記了熒光基團(tuán)的Q15為封閉序列，Q14和Q15退火后的熒光比對(duì)照組單獨(dú)的Q14的熒光降低許多，說(shuō)明經(jīng)退火處理的Q11和Q15可以很好的雜交在一起，拉近了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)間的距離，熒光被淬滅。而經(jīng)退火處理的Q14和Q15在加入人胰多肽后，相比Q14和Q15復(fù)合物，熒光上升，說(shuō)明人胰多肽能與Q14結(jié)合，破壞了Q14和Q15的雜交結(jié)構(gòu)，使得淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)的距離變遠(yuǎn)。且由于Q15封閉的是Q14的3’端，說(shuō)明人胰多肽可能與Q14的3’端結(jié)合?？疾?1：動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)本實(shí)施例SH-Q16(序列6)、SH-Q17(序列7)、SH-Q18(輔助探針)對(duì)人胰多肽的檢測(cè)效果。金納米顆粒的合成：將100mL0.01％的氯金酸煮沸后，加入3mL1％檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱維持沸騰狀態(tài)，溶液變成酒紅色，再煮沸15到20min，即可停止加熱。待溶液冷卻后定容至100mL。SH-Q16、SH-Q17和SH-Q18在金納米顆粒表面的修飾：將10μL濃度為100μMSH-Q16、10μL濃度為100μMSH-Q18及10μL濃度為100μMSH-Q17、10μL濃度為100μMSH-Q18分別加入到體積都為1mL金納米顆粒中(做兩管平行樣)，在4℃下孵育16h。然后加入500μL30mMPBS，再在4℃下孵育40h。孵育結(jié)束后以20800g的轉(zhuǎn)速在4℃下離心30min除去上清，將沉淀在1mL的1×BindingBuffer中分散均勻，再以20800g的轉(zhuǎn)速在4℃下離心30min除去上清，重復(fù)分散、離心去上清步驟兩次。得到SH-Q16、SH-Q18共修飾的金顆粒及SH-Q17、SH-Q18共修飾的金顆粒(SH-16和SH-17作為檢測(cè)探針，有識(shí)別作用，SH-Q18沒有識(shí)別作用，只是用于調(diào)節(jié)檢測(cè)探針在金顆粒表面的修飾密度，SH-Q18和SH-Q16共同修飾在一金顆粒表面，SH-Q18和SH-Q17又共同修飾在另一金顆粒表面)。取20μL修飾好的SH-Q16的金顆粒及20μL修飾好的SH-Q17金顆?；旌?，加入人胰多肽，人胰多肽的終濃度分別為0、1、2、5、10、15nM，混合后在25℃下孵育2h。孵育結(jié)束后利用動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)樣品的金顆粒的粒徑。結(jié)果如圖18所示：隨著人胰多肽濃度的升高，金顆粒的粒徑增大，說(shuō)明人胰多肽能同時(shí)與金顆粒上的SH-Q16及SH-Q17結(jié)合，拉進(jìn)金顆粒間的距離，使粒徑變大。且金顆粒的粒徑變化與人胰多肽的濃度呈線性關(guān)系，線性方程為y＝0.138+1.229x，相關(guān)系數(shù)為0.9936，檢測(cè)限為37pM。說(shuō)明利用SH-Q16、SH-Q17及動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)人胰多肽具有較好的效果，檢測(cè)限較低?？疾?2：動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)本實(shí)施例兩條核酸適配體檢測(cè)人胰多肽的選擇性。金納米顆粒的合成及SH-Q16、SH-Q17和SH-Q18在金顆粒上的修飾參考考察11。取20μL修飾好SH-Q16的金顆粒及20μL修飾好SH-Q17金顆粒混合，分別加入人胰多肽、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、免疫球蛋白G、胰島素、胰高血糖素，六種物質(zhì)的終濃度都為15nM，混合后在25℃下孵育2h。孵育結(jié)束后利用動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)樣品的金顆粒的粒徑。結(jié)果如圖19所示：修飾好SH-Q16的金顆粒及修飾好SH-Q17金顆粒只有與人胰多肽孵育后粒徑變化較明顯，與其它物質(zhì)孵育后粒徑變化不大，說(shuō)明SH-Q16和SH-Q17與人胰多肽的結(jié)合具有一定特異性。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3