本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種用于抑制孤兒核受體Nur77的雙鏈siRNA分子、及其在抗血管再狹窄方面的應用。

背景技術：

冠狀動脈旁路移植術(Coronary artery bypass grafting，CABG)是目前治療冠狀動脈硬化等嚴重心血管疾病的重要方法，其中自體靜脈如大隱靜脈等由于解剖表淺、來源較多等因素，往往成為首選移植物。然而術后移植靜脈內膜的增生，管腔的再狹窄甚至閉塞都嚴重影響了手術的遠期療效。大量臨床和實驗表明：靜脈橋移植物1年和5年的通暢率分別為85％、78％，而10年后的通暢率僅為50％。因此，如何抑制移植血管內膜的增生，減少血管再狹窄是目前CABG急需解決的問題。

近些年的研究表明，移植靜脈橋再狹窄的機制主要是以內膜異常增厚為病理基礎的，而血管內膜的增厚往往與多種因素有關，比如：手術中對移植血管的機械損傷、牽拉；術后血管平滑肌細胞(VSMC)的異常增殖、遷移；動脈血流沖擊引起的血管張力的改變；巨噬細胞以及各類生長因子、化學因子等刺激，均會導致移植血管內膜及中膜的增厚。這些因素幾乎都會刺激血管平滑肌細胞由靜止表型轉化為活動的增殖性表型，因此平滑肌細胞對于影響自體靜脈移植遠期的效果有著舉足輕重的作用。

研究表明，細胞核受體(Nuclear receptor，NR)是在生物中廣泛分布的一類受體超家族，其主要包括類固醇激素受體、維生素D受體、甲狀腺激素、維甲酸受體以及孤兒核受體(orphan nuclear receptor，ONR)。其中，NR4A家族是近些年來發(fā)現的孤兒核受體中的一類，其屬于立刻早期基因并且尚未發(fā)現明確的配體，主要通過蛋白表達和翻譯后修飾對其活性進行調控，NR4A家族主要包括三個亞家族：Nur77(TR3、NGFI-B)，NOR-1以及Nurr-1。大量實驗結果顯示，Nur77在動脈粥樣病變、移植血管內膜和中膜的平滑肌細胞、巨噬細胞以及內皮細胞中均有較高的表達。

孤兒核受體Nur77/TR3是1988年Milbrandt等人通過神經生長因子誘導大鼠的嗜鉻細胞瘤細胞系PC12所發(fā)現的，其參與體內眾多因子的轉錄調控。Nur77可以與反應元件序列TGATATTTX6AAATTGCCA結合為二聚體，又可以與AAAGGTCA直接結合為單體。國外早些年的研究發(fā)現，Nur77可能參與了眾多細胞凋亡的過程，例如，在鼠胸腺細胞發(fā)育過程中，Nur77似乎參與了對未成熟T細胞陰性選擇的過程。同樣，在人的腫瘤細胞中亦發(fā)現，Nur77/TR3參與誘導處理后的細胞凋亡。近些年來的實驗發(fā)現，血清、LPS、TNF-α以及PDGF等均可誘導平滑肌細細胞和巨噬細胞中Nur77的表達，分別結扎野生型和過表達Nur77小鼠的頸總動脈4周，結果發(fā)現前者血管內膜增生顯著低于后者，同時在粥樣硬化的患者血管中發(fā)現高表達Nur77的巨噬細胞和平滑肌細胞，因此，部分學者認為Nur77參與了巨噬細胞的脂質沉積并且抑制了巨噬細胞向泡沫細胞的轉變。

與巨噬細胞一樣，血管平滑肌細胞亦參與了血管狹窄的病變。平滑肌細胞具有兩種表型：靜止型以及活動型。生理情況下，平滑肌細胞處于靜止狀態(tài)，而當局部炎癥或是各種化學炎癥因子或者血管損傷刺激后，平滑肌細胞表型發(fā)生轉變，傳統(tǒng)的觀點認為平滑肌細胞的增殖和遷移以及細胞外基質的合成是血管再狹窄的重要機制。

上述研究預示，抑制Nur77表達或許能夠防止血管再狹窄的發(fā)生。因此，開發(fā)出能夠抑制Nur77基因表達的藥物對于冠狀動脈旁路移植術具有重要意義。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術開辟了一個全新的治療領域，RNAi在醫(yī)藥領域有廣闊的應用前景，如抗病毒、抗腫瘤和抗炎癥等。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是1998年首次報道的一種轉錄后的基因沉默效應，是指在生物體細胞內，外源性或內源性的雙鏈RNA識別有同源序列的mRNA，對其特異性切割，從而阻斷其翻譯的過程(Nature.1998,391:806-811)。RNAi發(fā)揮基因沉默作用的機制是：長dsRNA進入細胞后，被Dicer酶結合并切割。Dicer酶的切割產物通常是長度為20-25bp，且在每個鏈的3’末端有2個核苷酸懸垂的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA雙鏈中的一條，一般是反義鏈摻入到RNA-誘導的沉默復合物中(RISC)，與互補的序列配對。RISC首先介導siRNA雙鏈解旋，與RISC耦合的單鏈的siRNA以序列特異的方式與靶mRNA結合，之后由RISC的催化組分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻譯，最終抑制轉錄該mRNA的基因的表達。與傳統(tǒng)的抑制基因表達的反義寡核苷酸技術和核酶技術相比，siRNA沉默基因表達的效果要強大數十倍至數百倍，現已被證實在多種病毒感染性疾病和腫瘤的治療中具有極大的潛力，是理想的阻斷基因表達的治療手段。目前國際上已有數十種siRNA藥物進入臨床階段。

因為孤兒核受體Nur77與血管再狹窄相關，可以以Nur77基因作為標靶，開發(fā)出相應的siRNA藥物，用于抑制或降低血管再狹窄的發(fā)生，達到治療疾病的目的。

技術實現要素：

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性靶向孤兒核受體Nur77基因的siRNA分子，其可以阻斷Nur77基因的mRNA轉錄，阻止基因的翻譯，從而根本上抑制Nur77的表達，最終達到抑制發(fā)生血管再狹窄的目的。

本發(fā)明的技術方案包括：

一種靶向孤兒核受體Nur77基因的siRNA分子，其為雙鏈分子，由如下序列的正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-GGUGAAGGAAGUUGUCCGANn-3’(SEQ ID NO:1)，

反義鏈：5’-UCGGACAACUUCCUUCACCNn-3’(SEQ ID NO:2)。

其中，正義鏈和反義鏈中的N相同或者不同，并且各自獨立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鳥嘌呤G、腺嘌呤A、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT；n代表N的個數，n是0、1或2。

對于上述雙鏈RNA分子而言，優(yōu)選所述N為dT，且優(yōu)選n為0或2。

換言之，上述雙鏈RNA分子的主干序列為：

正義鏈：5’-GGUGAAGGAAGUUGUCCGA-3’(SEQ ID NO:3)，

反義鏈：5’-UCGGACAACUUCCUUCACC-3’(SEQ ID NO:4)。

優(yōu)選上述雙鏈RNA分子由如下序列的正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-GGUGAAGGAAGUUGUCCGAdTdT-3’(SEQ ID NO:5)，

反義鏈：5’-UCGGACAACUUCCUUCACCdTdT-3’(SEQ ID NO:6)。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述雙鏈RNA分子在制備抗血管再狹窄藥物中的用途。

上述的抗血管再狹窄藥物尤其用于抑制移植血管內膜增生。

相對應地，本發(fā)明的再一目的在于提供一種抗血管再狹窄、尤其是用于移植血管內膜增生的藥物，其包含本發(fā)明的雙鏈RNA分子。

優(yōu)選地，上述藥物是適用于注射的劑型或凝膠劑。

優(yōu)選地，上述藥物還包含必要的佐劑。

體外實驗證明，本發(fā)明的雙鏈RNA分子可特異性地下調孤兒核受體Nur77基因表達，達到抑制移植血管再狹窄發(fā)生的目的。所述的移植血管再狹窄尤其是指冠狀動脈旁路移植術(CABG)或經皮冠狀動脈介入治療(PCI)后的血管再狹窄。

附圖說明

圖1是用實時定量PCR方法檢測的本發(fā)明的siRNA1、siRNA2和siRNA3抑制靶基因Nur77基因的mRNA表達水平的柱狀圖。其中，靶向Nur77的siRNA1、siRNA2和siRNA3顯著抑制了Nur77基因的mRNA表達水平，正常組和陰性對照NC siRNA組無顯著差異。其中*P<0.05。

圖2是用蛋白印跡(Western blot)的方法檢測本發(fā)明siRNA1、siRNA2和siRNA3抑制靶基因Nur77基因的蛋白質表達水平的凝膠電泳圖。

圖3是顯示根據圖2所示蛋白印跡圖的灰度值計算的蛋白表達量的柱狀圖。靶向Nur77的siRNA1、siRNA2和siRNA3顯著抑制了Nur77蛋白質表達水平，正常組和陰性對照NC siRNA組無顯著差異。其中*P<0.05。

圖4是用CCK8的方法檢測的細胞生長曲線。生長曲線反映了細胞的增殖情況，靶向Nur77的siRNA1、siRNA2和siRNA3顯著抑制了細胞的生長，正常組和陰性對照NC siRNA組無顯著差異。

圖5是顯示用體內實驗檢測本發(fā)明siRNA1、siRNA2和siRNA3對靶基因Nur77的抑制水平的柱狀圖。第14天及第28天，靶向Nur77的siRNA1、siRNA2和siRNA3顯著抑制了組織內Nur77基因mRNA表達，正常組和NC siRNA組無顯著差異。其中*P<0.05。

圖6是顯示體內實驗檢測本發(fā)明siRNA1、siRNA2和siRNA3處理14天后對移植靜脈內膜厚度的影響的柱狀圖。siRNA1、siRNA2和siRNA3組內膜厚度低于其它各組，正常組和陰性對照NC siRNA組無顯著差異。其中*P<0.05。

圖7是顯示體內實驗檢測本發(fā)明siRNA1、siRNA2和siRNA3處理28天后對移植靜脈內膜厚度的影響的柱狀圖。siRNA1、siRNA2和siRNA3組內膜厚度均小于其它各組，正常組和陰性對照NC siRNA組無顯著差異。其中*P<0.05。

具體實施方式

對本發(fā)明進行詳細描述。應理解，下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對本發(fā)明進行限制。

為方便起見，在下文中，術語“RNA”、“RNA序列”、“RNA分子”、“雙鏈RNA”、“雙鏈RNA分子”或“dsRNA”可以互換，它們表示的意思和范圍相同。

其中，RNA是正義鏈和反義鏈退火形成的雙鏈結構。

為了制備能夠特異性靶向孤兒核受體Nur77基因、從而抑制其表達的siRNA分子，發(fā)明人設計了從一系列siRNA序列，經過篩選和堿基修飾，得到如下三組不同的siRNA：

第一組siRNA分子，為雙鏈分子，由如下序列的正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-GGUGAAGGAAGUUGUCCGANn-3’(SEQ ID NO:1)，

反義鏈：5’-UCGGACAACUUCCUUCACCNn-3’(SEQ ID NO:2)。

其中，正義鏈和反義鏈中的N相同或者不同，并且各自獨立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鳥嘌呤G、腺嘌呤A、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT；n代表N的個數，n是0、1或2。

上述雙鏈RNA分子的主干序列為：

正義鏈：5’-GGUGAAGGAAGUUGUCCGA-3’(SEQ ID NO:3)，

反義鏈：5’-UCGGACAACUUCCUUCACC-3’(SEQ ID NO:4)。

當N為dT、n為2時，上述雙鏈RNA分子抑制Nur77基因效果突出，命名為siRNA1，即

正義鏈：5’-GGUGAAGGAAGUUGUCCGAdTdT-3’(SEQ ID NO:5)，

反義鏈：5’-UCGGACAACUUCCUUCACCdTdT-3’(SEQ ID NO:6)。

第二組siRNA分子，為雙鏈分子，由如下序列的正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-GGGUGGAGGAGCUGCAGAANn-3’(SEQ ID NO:7)，

反義鏈：5’-UUCUGCAGCUCCUCCACCCNn-3’(SEQ ID NO:8)。

其中，正義鏈和反義鏈中的N相同或者不同，并且各自獨立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鳥嘌呤G、腺嘌呤A、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT；n代表N的個數，n是0、1或2。

上述雙鏈RNA分子的主干序列為：

正義鏈：5’-GGGUGGAGGAGCUGCAGAA-3’(SEQ ID NO:9)，

反義鏈：5’-UUCUGCAGCUCCUCCACCC-3’(SEQ ID NO:10)。

當N為dT、n為2時，上述雙鏈RNA分子抑制Nur77基因效果突出，命名為siRNA2，即

正義鏈：5’-GGGUGGAGGAGCUGCAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO:11)，

反義鏈：5’-UUCUGCAGCUCCUCCACCCdTdT-3’(SEQ ID NO:12)。

第三組siRNA分子，為雙鏈分子，由如下序列的正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-GCUCAGGCCUGGUGCUACANn-3’(SEQ ID NO:13)，

反義鏈：5’-UGUAGCACCAGGCCUGAGCNn-3’(SEQ ID NO:14)。

其中，正義鏈和反義鏈中的N相同或者不同，并且各自獨立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鳥嘌呤G、腺嘌呤A、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT；n代表N的個數，n是0、1或2。

上述雙鏈RNA分子的主干序列為：

正義鏈：5’-GCUCAGGCCUGGUGCUACA-3’(SEQ ID NO:15)，

反義鏈：5’-UGUAGCACCAGGCCUGAGC-3’(SEQ ID NO:16)。

當N為dT、n為2時，上述雙鏈RNA分子抑制Nur77基因效果突出，命名為siRNA3，即

正義鏈：5’-GCUCAGGCCUGGUGCUACAdTdT-3’(SEQ ID NO:17)，

反義鏈：5’-UGUAGCACCAGGCCUGAGCdTdT-3’(SEQ ID NO:18)。

RNA的制備可采用多種方法，比如：化學合成法、體外轉錄、酶切長鏈dsRNA、載體表達RNA、PCR合成RNA表達元件等，這些方法的出現為研究者提供了可選擇的空間，可以更好地獲得基因沉默效率。

本發(fā)明的RNA分子可以作為用于抑制血管再狹窄的藥物的有效成分，尤其是作為抗移植血管再狹窄藥物的有效成分。

出于應用目的，可將RNA分子作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如移植血管處。

本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應疾病的給藥、并且恰當地保持RNA分子的活性。比如，對于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。該藥物也可以是凝膠劑。

任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學上可接受的載體及佐劑，只要其適合于相應的給藥體系、并且恰當地保持RNA分子的活性。

為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實施例，并配合附圖作詳細說明如下。

下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對本發(fā)明進行限制。

實施例

本文中的siRNA和PCR引物由百奧邁科生物技術有限公司合成。

實施例1

1.細胞培養(yǎng)

人主動脈平滑肌細胞HA-VSMC(南通大學附屬醫(yī)院保藏)在含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)中，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)中培養(yǎng)。

2.siRNA設計與合成

設計并合成靶向Nur77基因的siRNA序列，分別為：siRNA1，具有正義鏈SEQ ID NO:5和反義鏈SEQ ID NO:6；siRNA2，具有正義鏈SEQ ID NO:11和反義鏈SEQ ID NO:12；siRNA3，具有正義鏈SEQ ID NO:17和反義鏈SEQ ID NO:18。分別將正義鏈和對應的反義鏈退火成siRNA雙鏈，轉染前配置成濃度為20μM。

另外，設計并合成了與人基因不同源的siRNA作為陰性對照的NC siRNA(Negetive control siRNA)，其序列為：

正義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:19)；

反義鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO:20)。

3.siRNA轉染細胞

細胞鋪板并轉染：將步驟1所得細胞按1×10⁵/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，在無抗生素、含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用細胞轉染試劑2000(美國Thermo Fisher Scientific公司)，按其說明書進行siRNA轉染。

4.細胞RNA的提取

細胞轉染48h后，收集細胞，用RNA提取試劑Trizol(美國Thermo Fisher Scientific公司)提取RNA，按其說明書進行RNA提取，所得RNA沉淀用50μL無RNase水溶解，并取2μL進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，提純的細胞總RNA的純度和完整性較好，符合實驗要求。

5.實時定量PCR

用基因特異性引物檢測樣本中Nur77基因mRNA的表達水平，同時擴增看家基因β-actin作為內參對照。每個樣本同時擴增Nur77基因和內參基因β-actin，每個反應做3個平行。用2×Master Mix(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行定量反應，建立如下反應體系：2μL RNA模板，12.5μL的2×Master Mix，上游引物(10μM)和下游引物(10μM)各0.5μL，0.5μL的50×SYBR Green Solution，用無RNase的水補足體系至25μL?；旌暇鶆蚝?，置實時定量PCR檢測系統(tǒng)反應。

檢測Nur77基因的實時定量PCR引物：

上游引物為：5’-TGGACGGCTACACAGGAGAG-3’(SEQ ID NO:21)；

下游引物為：5’-CGAGGAGGAGGCTGAGGAG-3’(SEQ ID NO:22)。

檢測看家基因β-actin的實時定量PCR引物：

上游引物為：5’-TTGCCGACAGGATGCAGAAGGA-3’(SEQ ID NO:23)；

下游引物為：5’-AGGTGGACAGCGAGGCCAGGAT-3’(SEQ ID NO:24)。

反應條件：42℃反轉錄30min，95℃預變性5min，95℃變性20sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循環(huán)45次。并做溶解曲線反應：95℃/5min，58℃/5min，以0.5℃/5sec升溫至95℃。

用2^-ΔΔCt法分析實驗結果，并作柱狀圖，如圖1所示，靶向Nur77的siRNA1、siRNA2、siRNA3均顯著抑制了其mRNA表達水平，正常組和NC siRNA組無顯著差異。

實施例2

蛋白印跡檢測基因蛋白表達水平

按實施例1的方法進行細胞培養(yǎng)和siRNA轉染。

將細胞按1×10⁶個/孔鋪到6孔板中，24h后生長至70-80％的匯合度，細胞分成5組，分別為siRNA1處理組、siRNA2處理組、siRNA3處理組、陰性對照組、正常組。

處理48h后，用預冷的1×SDS buffer(50mM Tris-HCl,pH7.6；1％SDS；150mM NaCl；0.5％Triton-X 100；5mM EDTA；5％β-mercaptoethanol(BME)；1mM PMSF)蛋白裂解液裂解細胞，置于4℃中，10,000rpm離心20min，取上清稀釋后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉膜到聚偏氟乙烯(polyvinylidinedifluoride filter，PVDF)膜上(美國Millipore公司)，并用5％脫脂牛奶室溫進行封閉2h，然后用兔抗人Nur77單克隆抗體(美國Abcam公司，1:500稀釋)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Abcam公司，1:500稀釋)作為內參。TBST洗滌后，再用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯的二抗孵育(Nur77用羊抗兔IgG-HRP，1:1000稀釋；β-actin用羊抗鼠IgG-HRP，1:2000稀釋)，用TBST洗滌3次(5min/次)。用BeyoECL Plus試劑盒(碧云天公司)檢測。

如圖2和圖3所示，靶向Nur77的siRNA1、siRNA2、siRNA3均顯著抑制了Nur77蛋白質表達水平(P<0.05)，正常組和NC siRNA組無顯著差異。

實施例3

細胞增殖檢測

按實施例1的方法進行細胞培養(yǎng)和siRNA轉染。

轉染前待細胞匯合度達到60-80％時，將對數生長期的細胞鋪到96孔細胞培養(yǎng)板中，重復3個孔，作為未轉染的樣本(即轉染0h的樣本)。

分別取轉染24h、48h、72h和96h后的各實驗組的細胞進行CCK8細胞增殖測定，所述測定方法為：將混合的100μL DMEM(美國Gibco公司)和10μL CCK8(Cell Counting Kit-8，日本Dojingo公司)加入到每個孔中，培養(yǎng)箱孵育4h，在波長490nm處用酶標儀(Bio-Rad公司)測定OD值，制作生長曲線。

如圖4所示，靶向Nur77的siRNA1、siRNA2、siRNA3均顯著抑制了細胞生長，正常組和NC siRNA組無顯著差異。

實施例4

體內實驗驗證：大鼠頸外靜脈-頸總動脈移植模型

1.動物模型建立

1)SD大鼠用10％水合氯醛按0.3mL/100g體重腹腔注射麻醉，固定，腹腔注射青霉素1.6萬單位(Unit，U)。

2)平頸部剪去表面毛發(fā)，碘伏、酒精擦拭兩遍消毒。

3)取左側頸部胸鎖乳突肌前切口，長約4cm，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離頜下腺以及胸鎖乳突肌、胸骨舌骨肌，并游離出內外靜脈及頸內靜脈。

4)結扎頸外靜脈小分支，上下兩端結扎后取1cm靜脈，浸泡于20U/ml濃度肝素鈉溶液中備用。

5)拉鉤牽開左側胸鎖乳突肌，顯露頸動脈鞘，游離同側頸總動脈約2cm。

6)無創(chuàng)血管夾夾閉頸總動脈近段和遠端，切除與頸外靜脈相應長度血管。

7)采用11-0血管縫合線以顯微外科技術，將切取得到的頸外靜脈倒置，端端吻合于頸總動脈近心端和遠心端。

8)移植物不能扭曲。注意吻合血管壁全層，全程間斷縫合，每個吻合口各六針，若吻合口出血可輕壓止血，效果不佳時可在出血出酌情補針，每個吻合口最多八針。

9)松開血管夾，觀察移植靜脈充盈以及隨動脈血流搏動情況，動脈遠心端搏動良好證明吻合口通暢。

10)關閉縫合頸部切口，結束手術。

2.實驗分組

25只SD大鼠按每組5只隨機分為5組：

1)正常組：僅靜脈移植，移植成功后不做其它處理。

2)陰性對照siRNA(NC siRNA)處理組：移植靜脈外膜涂抹包含50μg NC siRNA的凝膠200μL。

3)Nur77 siRNA1處理組：移植靜脈外膜涂抹溶解50μg Nur77 siRNA1的凝膠200μL。

4)Nur77 siRNA2處理組：移植靜脈外膜涂抹溶解50μg Nur77 siRNA2的凝膠200μL。

5)Nur77 siRNA3處理組：移植靜脈外膜涂抹溶解50μg Nur77 siRNA3的凝膠200μL。

上述凝膠均為25％的Pluronic F-127凝膠(美國Sigma公司)，凝膠在4℃條件下用0.9％NaCl溶液溶解。

3.實驗取材

1)術后分別于第二周、第四周切取標本，第14天為早期移植靜脈、第28天為晚期移植靜脈。

2)同模型建立時，SD大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，切開皮膚。

3)分離頸總動脈，游離出移植靜脈，各組在切斷取材前確認通暢，心臟放血后處死，切取標本。

4)取部分標本，放入生理鹽水中剝離干凈后，用10％的中性福爾馬林固定液固定。

5)取部分標本，PBS沖洗后置于EP管中，-70℃冰凍保存，即刻Western blot檢測組織中Nur77蛋白的表達情況。

6)取部分標本，提取RNA后用實時定量PCR檢測血管組織中Nur77mRNA的表達情況(方法同實施例1)。

檢測大鼠模型中Nur77基因的實時定量PCR引物：

上游引物為：5’-TGCCCCGCTTTGGAAAG-3’(SEQ ID NO:25)；

下游引物為：5’-CCAGAGAGCAAGTCATAAAATTGC-3’(SEQ ID NO:26)。

檢測看家基因β-actin的實時定量PCR引物：

上游引物為：5’-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3’(SEQ ID NO:27)；

下游引物為：5’-GCGGCAGTGGCCATCTC-3’(SEQ ID NO:28)。

反應條件：42℃反轉錄30min，95℃預變性5min，95℃變性20sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循環(huán)45次。并做溶解曲線反應：95℃/5min，58℃/5min，以0.5℃/5sec升溫至95℃。

用2^-ΔΔCt法分析實驗結果，并作柱狀圖，如圖5所示，第14天及第28天，靶向Nur77的siRNA1、siRNA2、siRNA3均顯著抑制了組織內Nur77基因mRNA表達(P<0.05)，正常組和NC siRNA組無顯著差異。

實施例5

Nur77siRNA對移植靜脈內膜厚度的影響

對于實施例4中所取的靜脈移植物，將其進行甲醛固定，石蠟包埋后切片(4μm厚)，進行標準流程的HE染色：石蠟切片經二甲苯脫去切片中的石蠟，再經由高濃度到低濃度乙醇，最后入蒸餾水。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數分鐘。鹽酸及氨水中分色，各數秒鐘。流水沖洗1h后入蒸餾水片刻。入70％和90％乙醇中脫水各10min。入乙醇伊紅染色液染色2-3min。染色后的切片經純乙醇脫水，再經二甲苯使切片透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察染色結果，測量各組內膜/中膜膜厚度。

如圖6和圖7顯示，第14天及第28天，Nur77siRNA組內膜厚度均低于其它各組(P<0.05)，正常組和NC siRNA組無顯著差異。