亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

一種基于高通量測(cè)序構(gòu)建鼠TCRA文庫的多重PCR引物及方法與流程

文檔序號(hào):12346381閱讀:491來源:國知局

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體的說,涉及一種利用多重PCR方法擴(kuò)增鼠T淋巴細(xì)胞TCRA基因CDR3區(qū)域的引物組,構(gòu)建TCRA擴(kuò)增子文庫的方法及確定TCRA免疫組庫特征的生物信息學(xué)方法。



背景技術(shù):

得益于下一代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,DNA和RNA測(cè)序平臺(tái)在基因組學(xué)的各個(gè)方面發(fā)揮著突出的推動(dòng)作用。同時(shí),這一新興的技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)被應(yīng)用于T細(xì)胞和B細(xì)胞受體的免疫組庫測(cè)序。在獲得性免疫中,T細(xì)胞和B細(xì)胞通過表面的T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體特異性的識(shí)別抗原肽-主要組織相容性復(fù)合物(pMHC)進(jìn)而啟動(dòng)免疫系統(tǒng)活化。通過測(cè)序淋巴細(xì)胞受體的CDR3免疫組庫,確定T、B淋巴細(xì)胞中受體分子的組成,可以用以評(píng)價(jià)免疫組庫的多樣性等特征參數(shù),并進(jìn)一步研究獲得性免疫系統(tǒng)的應(yīng)答發(fā)生過程及其發(fā)生機(jī)制。T細(xì)胞受體(TCR)由alpha和beta兩條肽鏈組成,分別由TCRA和TCRB基因編碼,TCRA基因的胚系基因由多個(gè)開放閱讀框依次排列組成,可劃分為TRAV,TRAJ,TRAC三組片段,其中,TRAV區(qū)域含有約98種片段,TRAJ區(qū)域含有60種片段,TRAC區(qū)域則僅有1種片段。在T淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中,三組片段通過體細(xì)胞重排實(shí)現(xiàn)不同片段間的隨機(jī)重組,產(chǎn)生成熟的TCRA分子,這一過程伴隨著TRAV和TRAJ區(qū)域間非模板堿基插入或缺失,從而為TCR的多樣性提供了分子遺傳基礎(chǔ)。在TCR與抗原肽-主要組織相容性復(fù)合物(pMHC)識(shí)別的過程中,CDR1和CDR2主要與多樣性相對(duì)較低的MHC片段結(jié)合,而TCRA的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)則主要與不同的抗原肽結(jié)合,其多樣性最為豐富。TCRA基因CDR3區(qū)域覆蓋了TRBV-Junction-TRBJ這一多樣性來源區(qū)域,對(duì)其序列組成進(jìn)行測(cè)序分析可以很好的反映TCR免疫組庫的組成及應(yīng)答狀況。

目前對(duì)于T淋巴細(xì)胞TCRA基因CDR3區(qū)域的研究方法仍有待改進(jìn)和簡(jiǎn)化。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

為解決以上技術(shù)問題,本發(fā)明的目的之一在于提供基于高通量測(cè)序構(gòu)建鼠TCRA文庫的多重PCR引物。

本發(fā)明目的之二在于提供一種利用所述多重PCR引物構(gòu)建TCRA文庫的方法。

一種基于高通量測(cè)序構(gòu)建鼠TCRA文庫的多重PCR引物,其特征在于:所述多重PCR引物為SED ID NO.1-SED ID NO.79。

一種多重PCR引物構(gòu)建鼠TCRA文庫的方法,按如下步驟進(jìn)行:

先提取正常胃黏膜組織、胃癌組織或外周血總RNA,然后反轉(zhuǎn)合成cDNA,以SEQ ID NO.72所示序列為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA,再以合成的cDNA為模板,SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.72所示序列為引物進(jìn)行多重PCR,回收PCR產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行微乳滴PCR,然后進(jìn)行PGM測(cè)序,得到鼠TCRA文庫。

上述多重PCR的擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性10min,95℃變性30s,59℃退火90s,72℃延伸90s,循環(huán)35次;最后72℃延伸10min。

有益效果:

本發(fā)明公開了構(gòu)建鼠TCRA文庫的多重PCR引物,該引物能夠擴(kuò)增TCRA基因CDR3區(qū)域多樣性,構(gòu)建鼠TCRA文庫,本發(fā)明還構(gòu)建了鼠TCRA基因CDR3區(qū)測(cè)序文庫的方法,實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞受體免疫組庫的穩(wěn)定檢測(cè),對(duì)進(jìn)一步了解免疫組庫變化規(guī)律、揭示疾病發(fā)病機(jī)制有重要意義。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例:

下面將結(jié)合所示序列,對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版,J.薩姆布魯克等著)中所述的條件,或按照制造商廠商所建議的條件。

1、提取鼠組織中總RNA

鼠組織中總RNA的提取方法,包括如下步驟:

a.取鼠胰腺組織和外周血加入Trizol后吹打,室溫靜置5min,直接提取RNA或放入-80℃冰箱凍存;

b.按每毫升Trizol加入200ul氯仿,顛倒混勻,室溫放置3Min,然后于4℃、12000g離心15Min。

c.吸取上層水相,按每毫升Trizol加入0.5ml異丙醇,顛倒混勻,室溫放置10Min。于4℃、12000g離心10Min。

d.沉淀按每毫升Trizol加入1ml 75%乙醇,溫和震蕩,懸浮沉淀,然后于4℃、8000g離心5Min。吸去上清。

e.室溫晾干5-10Min,用合適體積的無RNA酶水溶解RNA。

將所提取的RNA利用Biotek EPOCH測(cè)定濃度和質(zhì)量。檢測(cè)結(jié)果顯示,OD260/280在1.8-2.0左右。

將所提取的RNA利用瓊脂糖凝膠膠電泳檢測(cè)條帶完整性。檢測(cè)結(jié)果顯示,28S和18S條帶明顯,5S條帶不明顯,28S/18S在2.0左右。

上述檢測(cè)結(jié)果表明步驟1所提取的RNA質(zhì)量滿足建庫要求,能夠用于后續(xù)建庫。

2、逆轉(zhuǎn)錄和多重PCR

將步驟1獲得的總RNA樣本分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄使用ReverAid First Strand cDNA Synthesis kit,具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行,反應(yīng)體系為:總RNA 0.1-5ug,濃度為20pmol反轉(zhuǎn)錄引物(SEQ ID NO.72)1ul,加入DEPC水定容至12ul,然后將混合液在PCR儀中65℃反應(yīng)5min,反應(yīng)結(jié)束后迅速放入冰上冰浴5min,再加入5x reaction buffer 4ul,RibolockTM抑制劑1ul,1mM dNTP Mix 2ul,revertaidTMM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶200u/ul 1ul,混勻后離心,然后在42℃反應(yīng)1h,得到第一鏈cDNA.

根據(jù)T淋巴細(xì)胞受體Alpha鏈(TCRA基因)體細(xì)胞重排、非模板隨機(jī)插入缺失的規(guī)律,設(shè)計(jì)多重PCR引物,為方便測(cè)序反應(yīng),在正向引物和反向引物的上游添加測(cè)序接頭序列,具體引物如序列表所示:

然后以獲得的第一鏈cDNA為模板,以SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.71所示序列為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下:multiplex-PCR預(yù)混液25ul,正向引物5ul,反向引物5ul,cDNA 5ul,水10ul,共計(jì)50ul;PCR擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性10min,95℃變性30s,59℃退火90s,72℃延伸90s,循環(huán)35次;最后72℃延伸10min。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的瓊脂糖凝膠(低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠),在50V電壓下電泳3h,電泳后再紫外下將含有目的條帶的凝膠切下,放入1.5ml EP管中,然后加入1ml QG Stablization buffer,在45℃條件下水浴5-10min直至膠塊完全溶解,水浴1-1min;離心后倒掉收集管中廢液,將吸附柱放在收集管中,向吸附柱加入300ul QG Stablization buffer,18000g離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放在收集管中,18000g離心2min,再將吸附柱放在新的1.5ml EP管中,用吹風(fēng)機(jī)將吸附柱上殘留的酒精徹底吹干,向吸附柱中加入60℃預(yù)熱的超純水,靜置2min,最后18000g離心2min,收集該洗脫液,得到建庫樣本。

為了確定建庫樣本質(zhì)量符合要求,對(duì)建庫樣本在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖凝膠、100V電壓下電泳30min,然后通過凝膠成像檢測(cè)目的條帶。上述檢測(cè)結(jié)果表明獲得的建庫樣本滿足建庫需求,能夠用于下一步測(cè)序。

3、em-PCR(微乳滴PCR)以及PGM測(cè)序

利用Qubit測(cè)定獲得的不同樣本的建庫樣本濃度,然后按相同量混合。樣本稀釋的方法為,假設(shè)Qubit測(cè)得的濃度為N ng/ul,文庫擴(kuò)增子長(zhǎng)度為M kb,則文庫的稀釋倍數(shù)為N*1.515*1000/26*M。

然后以稀釋后的文庫為模板,進(jìn)行emPCR,emPCR使用Ion OneTouchTM測(cè)序系統(tǒng)提供試劑,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行,然后進(jìn)行PGM測(cè)序,測(cè)序結(jié)果即為鼠的TCRA文庫。然后將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明,利用本發(fā)明的方法構(gòu)建的鼠TCRA文庫能夠覆蓋TCRA基因的多樣性信息。

最后說明的是,以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本方明的技術(shù)方案而非限制,盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述,但本領(lǐng)域技術(shù)鼠員應(yīng)當(dāng)理解,可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變,而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。

當(dāng)前第1頁1 2 3 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1