本發(fā)明涉及高通量測序領(lǐng)域，具體而言，涉及一種適用于16S rDNA高通量測序文庫的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

16S rDNA是編碼16S rRNA的DNA序列，存在于所有細菌基因組中，一般由9個保守區(qū)和10個可變區(qū)組成。保守區(qū)在細菌間無顯著差異，可用于構(gòu)建所有生命的統(tǒng)一進化樹?？勺儏^(qū)在不同細菌中存在一定差異，對16S rDNA可變區(qū)進行測序，可將菌群鑒定精細到分類學上屬，甚至種的級別，這對研究海洋、土壤、腸道糞便等環(huán)境中的微生物構(gòu)成具有重要指導(dǎo)意義。

目前主要采用Illumina Miseq/Hiseq測序儀對16S rDNA進行測序，但Illumina測序平臺的構(gòu)架決定其讀長較短（最長讀長為2X300bp），限制其只能對16S rDNA中某一段可變區(qū)進行測序。查閱現(xiàn)有文獻發(fā)現(xiàn)，目前對16S rDNA測序主要有三種方法：測單V區(qū)（V3/V4/V6），測雙V區(qū)（V3-V4或V4-V5），或者測三V區(qū)（V1-V3、V5-V7、V7-V9）。根據(jù)單V區(qū)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，V4區(qū)在各個水平上的物種鑒定精確度最高，目前16S rDNA V4區(qū)測序已廣泛應(yīng)用于微生物的分類鑒定。但雙V區(qū)比單V區(qū)序列讀長更長，所含信息量更大，且V3-V4區(qū)引物結(jié)合特異性好，在細菌和古菌中的覆蓋率均高，一次測序可同時檢測細菌和古菌的多樣性分布，因此，16S rDNA V3-V4區(qū)測序是微生物物種鑒定的最佳選擇。

目前，基于Illimina測序平臺的文庫構(gòu)建方法主要有兩步擴增法和一步擴增法。兩步擴增法是較早的建庫方法，其流程如下：先進行目的片段擴增，擴增產(chǎn)物切膠純化，末端修復(fù)，3’端加A，連接接頭，再進行一次PCR擴增，整個建庫過程需進行兩次PCR。一步擴增法是目前應(yīng)用較廣泛的建庫方法，其擴增引物同時包含了接頭序列、index序列、測序引物序列和目的片段擴增序列，只需經(jīng)過一步PCR擴增即可完成文庫構(gòu)建。

上述兩種文庫構(gòu)建方法中，兩步擴增法因需要進行兩次PCR，步驟繁瑣，耗時較長，且費用較高。上述一步擴增法根據(jù)其所選擇目的片段擴增引物的不同，擴增產(chǎn)物在細菌中覆蓋率不同，進而最終物種鑒定的精確度也不同，因此選擇合適的引物是一步擴增法文庫構(gòu)建的關(guān)鍵步驟。此外，一步擴增法得到的產(chǎn)物，目前多采用瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化的方法進行文庫純化，步驟繁瑣、耗時長，且膠回收效率較低，PCR產(chǎn)物損失多，可能影響后續(xù)上機測序的文庫量。

因此，現(xiàn)有的適用于16S rDNA高通量測序文庫的構(gòu)建方法仍需要進行改進和完善：簡化步驟、縮短時間、節(jié)約成本，或者選擇合適引物，改進文庫純化方法以獲得高質(zhì)量的文庫，方便后續(xù)上機測序。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有幾種建庫方法存在的缺點和不足：步驟繁瑣、耗時長、費用高，或者擴增序列覆蓋率不夠高、文庫回收效率低等。本發(fā)明結(jié)合現(xiàn)有幾種建庫方法的優(yōu)缺點，提供了一種適用于16S rDNA高通量測序文庫的構(gòu)建方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明采用一步擴增法來完成16S rDNA高通量測序的文庫構(gòu)建。本發(fā)明提供了一種適用于一步擴增法文庫構(gòu)建的引物，該引物包含一條上游引物和一條下游引物。其中，上游引物從5’端到3’ 端分別包括：P5端接頭序列、index序列、上游測序引物序列、V3-V4區(qū)擴增引物上游序列。其中，下游引物從5’端到3’端分別包括：P7端接頭序列、index序列、下游測序引物序列、V3-V4區(qū)擴增引物下游序列。其中，index序列由8個堿基序列組成。其中，上游引物1-29位堿基為P5端接頭序列，30-37位堿基為index 1序列，38-71位堿基為上游測序引物序列，72-87位堿基為16S rDNA V3-V4區(qū)上游擴增引物序列。其中，下游引物1-33位堿基為P7端接頭序列，34-41位堿基為index 2序列，42-65位堿基為下游測序引物序列，66-86位堿基為16S rDNA V3-V4區(qū)下游擴增引物序列。上下游引物共173bp。

上述一步擴增法所用引物，其中，所述引物的上游引物為下表SEQ ID NO.1-8中任意一條，下游引物為下表SEQ ID NO.9-20中任意一條。

一種16S rDNA高通量測序文庫的構(gòu)建方法，利用所述引物中任意一條上游引物和任意一條下游引物進行一步擴增，即得到16S rDNA測序文庫。

經(jīng)上述一步擴增步驟后，使用Qiagen公司的Agencourt? AMPure? XP Beads對擴增產(chǎn)物進行純化，得到純化后的測序文庫。

經(jīng)上述文庫純化步驟后，用Qubit和Agilent 2100進行文庫初步定量和質(zhì)檢。

經(jīng)上述文庫質(zhì)檢步驟后，在進行高通量測序之前，采用KAPA Library Quantification Kits進行文庫定量。

經(jīng)上述文庫定量步驟后，根據(jù)每個樣本的數(shù)據(jù)量要求，進行相應(yīng)比例的混合。采用Illumina Hiseq 2500/ Miseq測序儀進行測序。

與現(xiàn)有16S rDNA高通量測序建庫方法相比較，本發(fā)明有以下進步和優(yōu)勢：

1.本發(fā)明提供的引物同時包含接頭序列、index序列、測序引物序列和目的片段擴增序列，使得整個建庫過程只需一步PCR即可完成，與兩步擴增法相比，明顯縮短建庫時間。

2.本發(fā)明所提供的引物中所包含的目的片段擴增引物上下游分別是343F和806R，該引物能夠擴增出16S rDNA的V3-V4區(qū)，與僅擴增V4區(qū)相比，擴增片段覆蓋率更高，所含信息量更大，并且引物特異性好，靈敏度高。

本發(fā)明中，文庫純化所采用的是Qiagen公司的Agencourt? AMPure? XP Beads，只需25分鐘即可完成文庫純化步驟，與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳切膠純化（制膠、點樣、電泳、純化至少1.5小時）相比較，簡化了操作步驟，節(jié)約了文庫純化時間。且本發(fā)明對常規(guī)的beads純化法進行了改進，提供了能夠使文庫純化達到最佳效果的beads用量及洗脫方法，明顯提高了文庫回收效率。

附圖說明

圖1示出了本發(fā)明所提供的引物結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2示出了本發(fā)明具體實施例中10個樣本一步擴增法建庫完成后電泳檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1

（1）收集10例人肺泡灌洗液樣本，每例樣本約2ml，室溫離心，14000rpm，30min，離心后棄上清，保留沉淀。采用Qiagen公司的QIAamp? UCP Pathogen Mini kit，按照protocol提取基因組DNA。

（2）采用nanodrop 2000檢測DNA濃度和質(zhì)量，選擇濃度大于10 ng/ul，OD260/280=1.8-2.0的DNA進行后續(xù)文庫構(gòu)建操作，共10個DNA樣本。

（3）10例樣本PCR擴增所用引物為前述8條上游引物和12條下游引物隨機自由組合，具體如下表所示：

（4）采用Takara Premix Ex Taq^TM Hot Start Version進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系如下：

Premix Ex Taq^TM Hot Start Version 25μl

Forward primer(10μM) 1μl

Reverse primer(10μM) 1μl

Template 100 ng

ddH₂O 補充至50μl

（5）設(shè)定如下反應(yīng)程序：

98℃ 3 min

98℃ 15 sec

54℃ 30 sec 35cycles

72℃ 45 sec

72℃ 10min

4℃ hold

反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管放置于4℃。

（6）每例樣本分別取5μl PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，跑膠結(jié)果如圖2所示，其中根據(jù)本發(fā)明所用引物擴增出V3-V4區(qū)長度約為425bp，再加上上下游引物173bp，擴增產(chǎn)物總長約為600bp。從結(jié)果圖2中可看出，10例樣本擴增產(chǎn)物電泳目的條帶大小均在600bp左右，與預(yù)期大小相符，且目的條帶清晰明亮，無雜帶，無拖尾現(xiàn)象，說明本發(fā)明所提供引物特異性好，靈敏度高。此外，該10對引物為隨機選取的上下游引物自由組合，因此，利用本發(fā)明所提供的引物能夠有效地對16S rDNA進行一步擴增法建庫。

（7）采用Qiagen公司的Agencourt? AMPure? XP Beads進行文庫純化。提前30min將AMPure XP Beads放置于室溫，使用之前上下顛倒混合均勻。

（8）向PCR產(chǎn)物中加入9ul AMPure XP Beads，室溫靜置5min。

（9）將PCR管靜置于磁力架上5min，取上清于一新的離心管中，丟棄beads。

（10）向上清中加入6ul AMPure XP Beads，室溫靜置5min。

（11）將離心管靜置于磁力架上5min，棄上清，保留beads。

（12）用80%現(xiàn)配乙醇洗滌兩次，空氣中干燥5min。

（13）加入25 μl 0.1X TE緩沖液洗脫beads，所得洗脫產(chǎn)物即為純化好的文庫。

（14）將上述步驟得到的純化好的文庫，用Qubit進行初步定量，所有樣本濃度均達到后續(xù)上機測序要求，且10個樣本濃度分別如下表所示：

（15）根據(jù)Qubit檢測所得文庫濃度，將樣本稀釋10倍，分別取出1μl用Agilent 2100檢測文庫片段大小，所有樣本的文庫片段都集中在600bp左右，說明本發(fā)明所采用的純化方式能夠有效地純化出目的片段，去除非特異片段。

（16）經(jīng)上述文庫質(zhì)檢步驟后，在進行高通量測序之前，采用KAPA Library Quantification Kits進行文庫定量。

（17）經(jīng)上述文庫定量步驟后，根據(jù)每個樣本的數(shù)據(jù)量要求，進行相應(yīng)比例的混合。采用Illumina Hiseq 2500/ Miseq測序儀進行測序。

（18）對測序所得數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。如下表所示，各樣本測序數(shù)據(jù) GC 含量均在 50%-56%之間，clean tags 長度在 420bp左右；平均 reads 數(shù)為 8 萬；數(shù)據(jù)質(zhì)控合格率都在 90%以上。該結(jié)果進一步說明利用本發(fā)明所提供的引物能夠有效地對16S rDNA的V3-V4區(qū)進行一步擴增法建庫，且本發(fā)明采用beads法進行文庫純化，根據(jù)本發(fā)明所提供的beads用量及洗脫方式能夠高效地純化出目的片段，去除雜質(zhì)及非特異片段，為后續(xù)上機測序提供足量合并且格的文庫。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 廈門基源醫(yī)療科技有限公司

<120> 一種16S rDNA高通量測序文庫的構(gòu)建方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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