本發(fā)明涉及功能化材料領(lǐng)域和熒光納米探針及分子識別和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種新的熒光納米銅簇合成用DNA模板及其在生物分子檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了熒光分析技術(shù)具有簡單直觀的特性，以及時間和空間分辨能力，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于體內(nèi)、外目標(biāo)分子的檢測[Wu J.,Liu W.,Ge J.,Zhang H.,Wang P.Chem.Soc.Rev.,2011,40,3483–3495]。典型的包括有機熒光染料分子[Dsouza R.N.,Pischel U.,Nau W.M.,Chem.Rev.,2011,111(12),7941-7980]、聚集誘導(dǎo)增強和淬滅的熒光染料[Wang B.,Yu C.,Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49(8):1485-1488；Hu Q.,Gao M.,Feng G.,Chen X.,Liu B.ACS Appl.Mater.Interfaces,2015,7(8),4875–4882]，以及近幾十年來發(fā)展迅速的納米熒光探針，如量子點[Bruchez M.,Moronne M.,Gin P.,Weiss S.,Science,1998,281(5385),2013-2016；Resch-Genger U.,Grabolle M.,Cavaliere-Jaricot S.,Nitschke R.,Nat.Methods,2008,5(9),763-775]、上轉(zhuǎn)換納米晶[Haase M.,Schafer H.Upconverting nanoparticles.Angew.Chem.Int.Edit,2011,50(26),5808-5829]、碳點[Baker S.N.,Baker G.A.Angew.Chem.Int.Edit,2010,49,6726-2744]，以及金屬納米簇，如金、銀和鉑等納米簇已發(fā)展成為繼有機染料、量子點之后的新型熒光納米材料，并被應(yīng)用于體內(nèi)外化學(xué)和生物分子的檢測以及影像學(xué)研究[Zhang L.,Wang E.,Metal nanoclusters:New fluorescent probes for sensors and bioimaging.Nano Today,2014,9(1),132-157；Lu Y.,Chen W.Sub-nanometre sized metal clusters:from synthetic challenges to the unique property discoveries.Chem.Soc.Rev.,2012,41(9),3594-3623]。金屬納米簇的廣泛應(yīng)用主要依據(jù)以下特點：1)發(fā)射波長可調(diào)且范圍寬，涵蓋可見-紅外區(qū)；2)Stoke’s位移 較大，背景低；3)生物相容性好，可用于細胞內(nèi)影像學(xué)研究；4)均相反應(yīng)無需洗滌分離，免標(biāo)記，方便易行；5)檢測模式的多樣化。尤其是DNA模板的發(fā)展，使其可方便地結(jié)合雜交、適配體識別以及核酸等溫擴增技術(shù)，拓寬至不同類型的目標(biāo)物檢測，如金屬離子、小分子、核酸和蛋白等。

相比于金、銀和鉑納米簇，基于DNA模板制備的熒光納米銅簇不僅具有背景低、環(huán)境友好、免標(biāo)記和均相無需分離等特點，其制備過程還具有以下突出優(yōu)勢：合成快速，一般在幾分鐘內(nèi)完成，遠低于其它納米簇形成所需的數(shù)小時甚至過夜；其次，反應(yīng)條件溫和；特定DNA模板存在下，硫酸銅由維生素C在中性pH、室溫條件下還原即可形成。

目前，熒光納米銅簇制備所用的DNA模板集中在雙鏈模板和線性多聚脫氧胸苷(poly T)模板，可應(yīng)用于核酸酶、核酸、三磷酸腺苷以及堿性磷酸酯酶等物質(zhì)的檢測。

但是，就目前而言，熒光納米銅簇的研究仍處于初級階段，發(fā)展新型的熒光納米銅簇的模板，尤其是新型的DNA模板，并改善熒光銅簇?zé)晒庑阅?，進一步拓寬熒光納米銅簇的應(yīng)用范圍是該領(lǐng)域發(fā)展的重要方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種新的熒光納米銅簇合成用DNA模板及其在生物分子檢測中的應(yīng)用。所述的DNA模板環(huán)部為多聚脫氧胸苷(poly T)的發(fā)卡式DNA模板(MB-Tn)。

本發(fā)明提供一種熒光納米銅簇的新型DNA模板，并獲得該模板的堿基組成和長度不同與形成熒光納米銅簇直接的相互關(guān)系，進一步提供其在生物分子檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，DNA模板所用DNA序列如圖1所示。

本發(fā)明公開的熒光納米銅簇合成模板為具有poly T環(huán)部的發(fā)卡式DNA模板(MB-Tn)。

本發(fā)明的發(fā)卡式結(jié)構(gòu)DNA模板MB-Tn，其環(huán)部為不同長度的poly T，其莖部為不同長度和堿基排列的雙鏈序列(或帶粘性末端)，以此模板形成的熒光納米銅簇，具有DNA序列依賴性；該發(fā)卡式DNA模板在一定的緩沖液中，以及硫酸 銅和維生素C作用下，室溫反應(yīng)幾分鐘即可產(chǎn)生熒光信號。

本發(fā)明中，環(huán)部poly T長度范圍為5-40個寡核苷酸，即T數(shù)目可低至5，且隨著poly T數(shù)目增多，形成的熒光銅簇的熒光強度逐漸增加；如，環(huán)部T堿基數(shù)目大于40后，仍可以作為模板形成強熒光信號的銅簇，相對而言，線性poly T長度小于15時，則不能作為模板形成熒光銅簇；此外，環(huán)部換成其他類型的堿基如：poly A、poly C和poly(CT)時，均無法形成熒光銅簇，熒光信號低；

本發(fā)明公開了基于MB-Tn合成熒光納米銅簇的制備方法，進一步獲得了MB-Tn序列的莖部、環(huán)部堿基以及序列長度對于熒光納米銅簇形成的影響及規(guī)律。

本發(fā)明中，發(fā)卡式DNA模板MB-Tn的莖部雙鏈的長度對于熒光納米銅簇形成具有影響：其小于12bp，隨著莖部延長，熒光強度逐漸增強；大于12bp時，熒光納米銅簇信號趨于穩(wěn)定；

本發(fā)明中所述的發(fā)卡式DNA模板，其具有3種不同類型的莖部雙鏈序列，包括a)無形成熒光銅簇的能力(GC MB-Tn，CGC GCC GGC GCG CGC CGC tn CGC GCC GGC GCG CGC CGC)；b)形成熒光銅簇的能力較弱(RS1 MB-Tn，ACC TTC CTC CGC AAT ACT tn AGT ATT GCG GAG GAA GGT)；c)形成熒光銅簇的能力較強(RS2 MB-Tn，CTG AAG TTC TGA TGA CCA tn TGG TCA TCA GAA CTT CAG)；本發(fā)明的實驗顯示，所述的3種莖部序列可影響熒光納米銅簇的形成，3種不同類型莖部的發(fā)卡式DNA模板均可以形成熒光納米銅簇，但，莖、環(huán)部序列在形成熒光納米銅簇時，相互間的增強效應(yīng)不同，其中：RS1雙鏈與環(huán)部Tn的相互促進作用最強，GC次之，RS2最弱，僅呈相互疊加趨勢；RS2自身可以作為模板形成熒光納米銅簇，其最大發(fā)射波長約為590nm，發(fā)卡式模板RS2MB-Tn形成的熒光銅簇，呈現(xiàn)出莖部和環(huán)部信號的疊加，最大發(fā)射波長約為610nm。

本發(fā)明提供了基于發(fā)卡式DNA模板MB-Tn制備熒光納米銅簇的方法，其包括：配制一定濃度的發(fā)卡式DNA模板在MOPs緩沖液中，依次加入硫酸銅溶液和維生素C溶液，放置10分鐘即得熒光納米銅簇；形成的熒光納米銅簇的直徑為5-10nm。

上述制得的熒光納米銅簇，最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別約為345nm和635nm，相比于雙鏈模板和單鏈poly T形成的熒光納米銅簇，其發(fā)射波長紅 移約10-50nm；

上述制備方法中，發(fā)卡式DNA模板的量為12.5-400pmol時，均能作為模板產(chǎn)生熒光銅簇，隨著濃度升高，熒光信號增強；

上述制備方法中，MOPs緩沖液含有10mM MOPs，150mM NaCl，pH 7.0；硫酸銅溶液濃度為10mM(水溶液)，用量為0.25—4μL；維生素C溶液100mM(水溶液)，用量為0.5-8μL。

本發(fā)明進一步提供了基于發(fā)卡式DNA模板形成的熒光納米銅簇在生物分子檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，采用發(fā)卡式DNA模板制備的熒光納米銅簇通過下述方法檢測生物小分子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)：

首先設(shè)計一段莖部帶缺口的啞鈴型探針I(yè)，其兩個環(huán)部均為poly T，該探針I(yè)在一定量的NAD⁺參與下，可由大腸桿菌(E.coli)連接酶作用下，連接呈閉合的啞鈴型探針，保留MB-Tn結(jié)構(gòu)，隨后在硫酸銅和維生素C作用下生成強熒光信號的納米銅簇，用于NAD⁺的定量，無NAD⁺存在時，無NAD⁺存在時，啞鈴型探針無法閉合，從而被外切酶I和III的剪切，無法形成熒光銅簇；

所述的的啞鈴型探針的兩環(huán)部為長度大于5的poly T序列；

進一步，本發(fā)明的基于發(fā)卡式DNA模板制備的熒光納米銅簇可用于檢測疾病相關(guān)miRNA；通過下述方法：

設(shè)計一段帶有粘性末端的發(fā)卡式DNA探針(II)，其環(huán)部序列為多聚脫氧腺苷(poly A)，探針I(yè)I的兩末端序列分別與目標(biāo)miRNA互補雜交，可在目標(biāo)miRNA存在下，探針I(yè)I兩末端靠近，由連接酶連接成環(huán)，引發(fā)滾環(huán)擴增，獲得一段長DNA序列(帶有多個重復(fù)單元的熒光納米銅簇的發(fā)卡DNA模板)，所述的多個重復(fù)單元為：具有poly T環(huán)部的發(fā)卡式DNA模板(MB-Tn)，在硫酸銅和維生素C作用下生成強熒光信號的銅簇，可用于miRNA快速、靈敏的檢測。

本發(fā)明中，帶有粘性末端的發(fā)卡式DNA探針的環(huán)部為poly A，其長度優(yōu)選大于20堿基。

本發(fā)明所述的發(fā)卡式DNA模板的熒光納米銅簇的形成模板，不僅具有形成條件溫和、反應(yīng)迅速的特點，且具有更高的熒光強度，易于設(shè)計為無需標(biāo)記、無需分離的生物分子檢測技術(shù)。

本發(fā)明具有的優(yōu)點有：

本發(fā)明的發(fā)卡式DNA模板與線性poly T相比，形成熒光納米銅簇的熒光強度更強，所述模板與熒光納米銅簇形成間相關(guān)性包括：1)環(huán)部堿基類型對于熒光銅簇的形成具有重要意義，只有poly T才能作為模板形成熒光銅簇，其他堿基的環(huán)部如多聚脫氧腺苷(poly A)、多聚脫氧胞苷(poly C)或poly(CT)的發(fā)卡DNA均不能作為模板，形成熒光納米銅簇；2)發(fā)卡式DNA模板形成的熒光納米銅簇，其熒光強度具有poly T長度和序列濃度依賴性，隨著poly T長度延長，熒光信號增強；在一定濃度范圍內(nèi)，熒光納米銅簇的熒光強度隨濃度增加而增強；3)發(fā)卡式DNA模板的穩(wěn)定性將影響熒光納米銅簇的形成，莖部雙鏈長度在12堿基對(bp)以下時，熒光信號隨長度增長而熒光增強；當(dāng)大于等于12bp時，熒光信號趨于穩(wěn)定；4)發(fā)卡式DNA模板形成的熒光納米銅簇，具有莖部序列類型依賴性，其中RS1對于熒光納米銅簇的促進能力最強，GC組次之，而RS2作為莖部的發(fā)卡結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出莖部和環(huán)部的疊加效應(yīng)。

為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進一步說明。

附圖說明

圖1本發(fā)明所用DNA序列。

圖2基于雙鏈模板、線性poly T模板和MB-Tn模板形成熒光納米銅簇的示意圖。

圖3線性poly T模板與含poly T環(huán)的發(fā)卡式模板形成熒光納米銅簇的光譜圖與強度。

圖4T20和MB-T20形成的熒光納米銅簇透射電鏡圖。

圖5不同環(huán)部堿基的MB-Tn形成的熒光納米銅簇的光譜圖。

圖6不同莖部長度的MB-Tn形成的熒光納米銅簇的光譜圖。

圖7不同莖部堿基排布的MB-Tn形成的熒光納米銅簇光譜圖。

圖8基于發(fā)卡式DNA模板制備的熒光納米銅簇構(gòu)建NAD⁺檢測技術(shù)。

圖9核酸外切酶I和III的剪切反應(yīng)電泳驗證圖。

圖10NAD⁺濃度與熒光信號的對數(shù)相關(guān)相關(guān)曲線圖。

圖11基于發(fā)卡式DNA模板制備的熒光納米銅簇構(gòu)建miRNA檢測技術(shù)。

圖12目標(biāo)miRNA序列引發(fā)滾環(huán)擴增電泳驗證圖。

圖13目標(biāo)miRNA濃度與熒光信號對數(shù)相關(guān)曲線圖。

具體實施方式

實施例1：發(fā)卡式DNA模板形成熒光納米銅簇，并與線性DNA模板比較實驗

所用DNA序列為：環(huán)部T數(shù)目分別為6、10、15、20、30和40的發(fā)卡DNA模板(如圖1—DNA 1-5)，莖部均采用形成熒光銅簇能力較弱的RS1雙鏈，此外，還采用單鏈線性poly T作為對照，包括T6、T10、T20、T30和T40(如圖1—DNA 6-10)；

基于線性雙鏈模板、poly T模板和MB-Tn模板形成熒光銅簇的示意圖如圖2所示；

分別取100pmol的DNA 1-10，置1.5mL EP管中，加入MOPs緩沖液(10mM MOPs，150mM NaCl，pH 7.0)至194μL，隨后，加入10mM的硫酸銅溶液2μL，100mM的維生素C溶液4μL，于搖床中室溫反應(yīng)10分鐘；

熒光測定，激發(fā)波長為345nm，發(fā)射波長掃描范圍為500nm-650nm；

以上模板形成的熒光納米銅簇的熒光光譜與強度如圖3所示，相比于線性模板，發(fā)卡式模板形成的熒光銅簇?zé)晒鈴姸雀撸绕湓赥數(shù)目較短時(T6,T10)，線性模板無明顯信號，發(fā)卡式模板可產(chǎn)生明顯的熒光信號，表明形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)有利于熒光納米銅簇的合成，此外，兩種類型的模板形成熒光納米銅簇均時具有T長度依賴性，長度延長，熒光信號增強；圖4顯示了T20和MB-T20形成的熒光納米銅簇透射電鏡圖。

實施例2：發(fā)卡式DNA模板的環(huán)部堿基對于熒光納米銅簇形成的影響實驗

所用DNA序列為：環(huán)部分別為T20、A20、C20以及(CT)10的發(fā)卡式DNA，莖 部采用RS1雙鏈(如圖1—DNA 3，11-13)；

分別取100pmol的以上發(fā)卡式序列置1.5mL EP管中，用MOPs緩沖液稀釋至194μL，加入10mM的硫酸銅溶液2μL，100mM的維生素C溶液4μL，在搖床中室溫反應(yīng)10分鐘后；

熒光測定，激發(fā)波長為345nm，發(fā)射波長掃描范圍為500nm-650nm；

結(jié)果顯示，發(fā)卡式模板形成的熒光納米銅簇其熒光光譜如附圖5所示，只有T堿基作為環(huán)部時，才能形成強熒光信號。

實施例3：莖部序列長度對于熒光銅簇形成的影響實驗

所用DNA序列為：環(huán)部均為T20，莖部為不同長度的GC雙鏈序列，長度分別為6、8、10、12、14、16、18bp的發(fā)卡式DNA模板(如圖1—DNA 14-20)，

分別取100pmol的以上發(fā)卡式序列置1.5mL EP管中，用MOPs緩沖液稀釋至194μL，加入10mM的硫酸銅溶液2μL，100mM的維生素C溶液4μL，在搖床中室溫反應(yīng)10分鐘后，

熒光測定，激發(fā)波長為345nm，發(fā)射波長掃描范圍為500nm-650nm，

制得的發(fā)卡式模板形成的熒光納米銅簇的熒光光譜如圖6所示，莖部序列堿基對為6-12之間時，隨著莖部長度延長，熒光強度增強；而當(dāng)莖部堿基對大于12，在12-18之間時，熒光強度基本保持不變。

實施例4：發(fā)卡式模板的莖部雙鏈序列對于熒光納米銅簇形成的影響實驗

所用DNA序列為：環(huán)部均為T20，莖部有GC雙鏈(不能形成熒光銅簇)；RS1雙鏈(形成熒光銅簇能力較弱)和RS2雙鏈(形成熒光銅簇能力較強)，如圖1—DNA21-31所示，其中，RS1-1和RS1-2互補雜交呈雙鏈RS1，RS1-1 T20和RS1-2互補雜交呈帶有T20粘性末端的雙鏈RS1-T20；RS2-1和RS2-2互補雜交呈雙鏈RS2，RS2-1 T20和RS2-2互補雜交呈帶有T20粘性末端的雙鏈RS2-T20；GC-1和GC-2互補雜交成雙鏈GC，GC-1 T20和GC-2互補雜交呈帶有T20粘性末端的雙鏈GC-T20；

3組序列：GC組——GC MB-T20\GC-T20\T20，RS1組——RS1 MB-T20\RS1-T20\T20，RS2組——RS2 MB-T20\RS2-T20\T20，分別取100pmol 置1.5mL EP管中，用MOPs緩沖液稀釋至194 μL。加入10mM的硫酸銅溶液2μL，100mM的維生素C溶液4μL，于搖床中室溫反應(yīng)10分鐘；

熒光測定，激發(fā)波長為345nm，發(fā)射波長掃描范圍為500nm-650nm；

制得的發(fā)卡式模板形成的熒光納米銅簇的光譜圖如圖7所示，RS1 MB-T20產(chǎn)生的熒光納米銅簇信號明顯高于RS1-T20、T20以及兩者加合，最大發(fā)射波長約在635nm；GC組有相同的效應(yīng)，但是GC對于環(huán)部poly T的增強效應(yīng)不及RS1。RS2組中，RS2MB-T20產(chǎn)生的熒光納米銅簇信號相當(dāng)于RS2-T20和T20的加合，且最大發(fā)射波長在兩者信號之間，約為610nm；

結(jié)果表明：GC組和RS1組的莖部雙鏈對于環(huán)部poly T形成熒光納米銅簇具有較強的促進作用，RS1組最強；若莖部雙鏈序列形成熒光銅簇較強時，如RS2組，表現(xiàn)為莖部和發(fā)卡式環(huán)部的相互疊加效果。

實施例5：基于發(fā)卡式DNA的熒光銅簇構(gòu)建NAD⁺檢測方法

如圖8所示：1)合成一段莖部帶缺口的啞鈴型探針(5’-P-TGATGACCA t30 TGGTCATCAGAACTTCAG t30 CTGAAGTTC-3’，探針I(yè))，兩個環(huán)部均為T30，該探針可作為模板形成熒光銅簇；2)探針I(yè)在NAD⁺存在條件下，由E.coli連接酶連接呈環(huán)狀，無NAD⁺，探針將在切口處被核酸外切酶I和III(Exo I和Exo III)剪切，熒光銅簇模板破壞；3)依次加入硫酸銅和維生素C，10分鐘后進行熒光測定；4)酶連接與酶剪切過程采用電泳驗證。具體步驟如下：

1)連接反應(yīng)：在10μL的E.coli連接酶反應(yīng)液(Buffer I：Tris-HCl 30 mM,Mg(Cl)₂4mM,NH₄Cl 20mM,pH＝8.0)中，含有25pmol的探針I(yè)(終濃度：2.5μM)，95℃高溫變形3min，緩慢降至室溫，與不同濃度的NAD⁺混合。隨后在體系中加入1U的E.coli DNA連接酶(終濃度：0.1U/μL)，恒溫25℃反應(yīng)1h；

剪切反應(yīng)：向上述溶液中，加入10μL含有Exo I和Exo III(終濃度：2U/μL)的混合溶液，恒溫37℃反應(yīng)1h；

電泳驗證試驗：配制8％丙烯酰胺凝膠，量取2.76mL 29％丙烯酰胺加1％N,N-亞甲雙丙烯酰胺儲備液，5.24mL DEPC處理去離子水，2mL 5×TBE，70μL 10％過硫酸銨溶液，5μL TEMED，混勻，靜置30min即得；

取上述的反應(yīng)溶液10μL加入2μL 6×上樣緩沖液，混勻，取10μL上樣，在恒壓200V，電流不高于150mA的電泳條件下分離，時間約為30min，GelRed染色30min，在Alpha Innotech Fluorchem^TM SP采集熒光圖像(如圖9所示)；

熒光納米銅簇的合成：在所述的反應(yīng)體系中加入175μL MOPS緩沖液稀釋，震蕩混勻，隨后加入2μL10mM的硫酸銅、3μL 100mM的維生素C，立即震蕩，15℃反應(yīng)20min；

熒光信號檢測：取200μL的反應(yīng)液，加入微量檢測池中，置于熒光光譜分析儀中，激發(fā)波長345nm，發(fā)射波長掃描范圍500nm-650nm；

考察了硫酸銅濃度范圍為25-250μM，最佳濃度為是100μM；

考察了維生素C濃度為0.5-3.0mM，最佳濃度為1.5mM；

考察了E.coli DNA連接酶量的范圍為0.25-8U，最佳量為1U；

考察了實驗用Exo I和Exo III濃度范圍0.25-4U/μL，兩者的最佳濃度為2U/μL；

考察了實驗用探針量的范圍，200μL溶液中含有探針為10-100pmol，最佳量為25pmol；

在最優(yōu)條件下檢測結(jié)果如圖10所示，在5-500nM的濃度范圍內(nèi)，熒光強度與NAD⁺濃度呈對數(shù)線性相關(guān)，最低檢測限達5nM。

實施例6：基于發(fā)卡式DNA模板制備的熒光納米銅簇構(gòu)建miRNA檢測方法

實驗設(shè)計如圖11所示：1)合成一段帶有粘性末端的發(fā)卡式DNA探針(I,5’-P-CTACTA CCTCA a5 ACCTTC CTCCGC AATACT a20 AGTATT GCGGAG GAAGGT a5 AACTATACAAC-3’，探針I(yè)I)，5’磷酸化。環(huán)部為20個脫氧腺苷(A20)，探針I(yè)I兩端分別與目標(biāo)序列l(wèi)et 7a互補；2)探針I(yè)I只有與目標(biāo)序列l(wèi)et 7a雜交后，兩末端才能靠近，隨后由連接酶連接呈閉合環(huán)狀探針；3)再以let 7a為引物，環(huán)狀探針I(yè)I為模板，進行滾環(huán)擴增，獲得一段長DNA序列，該序列帶有多個poly T環(huán)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)；4)依次加入硫酸銅和維生素C，10分鐘后進行熒光測定；4)擴增結(jié)果采用電泳驗證；具體步驟如下：

1)雜交和連接反應(yīng)：1pmol的DNA探針I(yè)I溶解于10μL的Buffer I(Tris-HCl 30mM,Mg(Cl)₂4mM,NH₄Cl 20mM,pH＝8.0)中，95℃高溫變形3 min，緩慢降至室溫。加入不同濃度let 7a，隨后加入4U的E.coli DNA連接酶(終濃度：0.5U/μL)和2μL 1mM的NAD⁺溶液，加入Buffer I至總體積20μL，恒溫25℃反應(yīng)1h；

2)擴增反應(yīng)：向上述溶液中，加入5μL的擴增反應(yīng)液，含有phi 29擴增酶1U，dNTP 3.2mM，恒溫37℃反應(yīng)1h；

電泳驗證試驗：配制8％丙烯酰胺凝膠，量取2.76mL 29％丙烯酰胺加1％N,N-亞甲雙丙烯酰胺儲備液，5.24mL DEPC處理去離子水，2mL 5×TBE，70μL 10％過硫酸銨溶液，5μL TEMED，混勻，靜置30min即得；

將按上述步驟制備的3個樣品：探針I(yè)I、探針+let 7a+E.coli連接酶、探針+E.coli連接酶溶液，各取10μL加入2μL 6×上樣緩沖液，混勻，再取10μL上樣，在恒壓200V，電流不高于150mA的電泳條件下分離，時間約為30min，GelRed染色30min，在Alpha Innotech Fluorchem^TM SP采集熒光光譜(如圖12所示)；

熒光納米銅簇的合成：在上述反應(yīng)體系中加入168μL MOPs緩沖液稀釋，震蕩混勻，隨后加入3μL10mM的硫酸銅、4μL 100mM的維生素C，立即震蕩，15℃反應(yīng)10min；

熒光信號檢測：取200μL的反應(yīng)液，加入微量檢測池中，置于熒光光譜分析儀中，激發(fā)波長345nm，發(fā)射波長掃描范圍為500nm-650nm；

采用的硫酸銅、維生素C的濃度分別是10mM和100mM；探針I(yè)I、E.coli DNA連接酶和phi 29聚合酶的量分別1pmol、4U和1U；

在以上條件下，可測定的let 7a濃度范圍為1fmol-10pmol，測定曲線如圖13所示。