本發(fā)明涉及一種膝關(guān)節(jié)積液的游離DNA提取純化的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RheumatoidArthritis,RA）是一種對稱性多關(guān)節(jié)炎慢性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)：滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤、關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞，大量自身抗體產(chǎn)生（類風(fēng)濕因子、抗瓜氨酸抗體產(chǎn)生），后期會出現(xiàn)如心血管、肺部等全身系統(tǒng)性疾病。。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最先受損的是關(guān)節(jié)處關(guān)節(jié)與關(guān)節(jié)周圍組織，關(guān)節(jié)表面覆蓋的關(guān)節(jié)軟骨降低關(guān)節(jié)的摩擦?；ぴ陉P(guān)節(jié)腔周圍，產(chǎn)生關(guān)節(jié)腔積液，為關(guān)節(jié)軟骨提供營養(yǎng)，并且潤滑軟骨。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，滑膜是最先發(fā)炎部位，表現(xiàn)位滑膜細(xì)胞增生，血管增生，炎癥細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和激活的巨嗜細(xì)胞浸潤。當(dāng)滑膜增生后，最終炎癥組織與臨近的關(guān)節(jié)軟骨形成關(guān)節(jié)翳，可以看到增殖細(xì)胞入侵軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。而在發(fā)炎滑膜和相鄰軟骨下骨，會出現(xiàn)礦化骨質(zhì)損壞吸收，細(xì)胞出現(xiàn)破骨細(xì)胞形態(tài)改變：如降血鈣素受體mRNA表達(dá)，組織蛋白酶K表達(dá)，及抗酒石酸酸性磷酸酶表達(dá)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子刺激軟骨基質(zhì)破壞和骨損傷，目前，對于類風(fēng)濕的分類，還主要是根據(jù)臨床癥狀。進(jìn)行對不同疾病亞型進(jìn)行分子分類，對于類風(fēng)濕性臨床和治療有重要意義。有研究表明類風(fēng)濕性疾病與基因、環(huán)境有相互復(fù)雜作用，如人類白細(xì)胞抗原HLA-DRB1被確定和病人類風(fēng)濕性因子或者瓜氨酸抗體陽性相關(guān)，在HLA-DRB1等位基因處一個普遍存在的氨基酸基序（QKRAA）具有易感性，表明偏好性T細(xì)胞選擇和抗原呈遞或者多肽的不同親和力在自身免疫性疾病中有重要作用。同時，人們認(rèn)為免疫反應(yīng)包括獲得性免疫和天然免疫在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起重要作用。當(dāng)白細(xì)胞浸潤到滑膜時，引起炎癥。當(dāng)滑膜區(qū)的毛細(xì)血管部位內(nèi)皮細(xì)胞激活時，增加粘附分子（整合素、選擇素已及一些免疫蛋白超家族的分子表達(dá)）和趨化分子表達(dá)，白細(xì)胞進(jìn)行遷移。由于新生血管的產(chǎn)生，和淋巴血管增生不充分，限制了細(xì)胞的流出，形成滑膜炎。微環(huán)境系統(tǒng)的改變，與進(jìn)一步滑膜結(jié)構(gòu)的重組和局部纖維細(xì)胞的活化，形成了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜炎。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，由于自身抗體的存在，使獲得性免疫在其中起到重要作用。但同時，在滑膜表面存在大量的天然免疫效應(yīng)細(xì)胞，包括巨嗜細(xì)胞、肥大細(xì)胞，和自然殺傷細(xì)胞，以及存在于關(guān)節(jié)腔滑液中的中性粒細(xì)胞。巨嗜細(xì)胞是引起滑膜炎的重要因素。巨嗜細(xì)胞能夠被病原相關(guān)分子與損傷相關(guān)分子識別的Toll樣受體激活。Toll樣受體是目前被研究最透徹的分子識別受體。在人類至少有10種，鼠類大約有12種。每種Toll樣受體識別不同的模式分子。Toll樣受體被激活后，激活細(xì)胞內(nèi)通路，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子，免疫刺激細(xì)胞因子，趨化因子，共刺激因子表達(dá)，增強(qiáng)殺傷病原的能力并促進(jìn)獲得性免疫的形成。不恰當(dāng)?shù)膖oll樣受體的激活，另一方面導(dǎo)致很多疾病的產(chǎn)生如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡，濃毒血癥，炎性腸炎，牛皮廯，多發(fā)性硬皮癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，動脈粥樣硬化。組織一旦收到感染或者損傷，受損的組織會釋放各種細(xì)胞內(nèi)因子，刺激天然免疫細(xì)胞。核酸來自于宿主細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)微生物，能夠被識別核酸的toll樣受體識別。在病人中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)休克、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中血清中的游離核酸與致病性相關(guān)。游離核酸是指無細(xì)胞狀態(tài)的、游離于細(xì)胞外的部分降解了的機(jī)體內(nèi)源性核酸，主要由單鏈或者雙鏈DNA，及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，片段大小不一。目前，對于游離核酸在疾病的早期診斷、預(yù)后、監(jiān)測等方面的研究，已經(jīng)引起極大關(guān)注。但已有的游離DNA提取方法只是針對血液中的游離核酸提取，對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病而言，積液中的游離核酸所包含的信息對于關(guān)節(jié)炎類疾病的診斷和治療具有非常重要的意義。但是，關(guān)節(jié)積液中含有透明質(zhì)酸，蛋白聚糖，糖胺聚糖等物質(zhì)，粘性較大。而且，關(guān)節(jié)腔積液中的游離核酸從量上，到大小分布上，與血液中的游離核酸極有可能完全不同，使用現(xiàn)有的游離DNA提取方法很難操作，提取的游離DNA收率極低，影響后續(xù)的科學(xué)研究。本專利通過本實(shí)驗(yàn)室的探索與實(shí)踐，提供一個有效的從積液中提取核酸的方法，該方法提取的游離核酸能夠以最高效率的將關(guān)節(jié)積液中全部的游離DNA提取出來，并保證其完整性，確保后續(xù)研究的順利進(jìn)行。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明擬提供一種膝關(guān)節(jié)積液的游離DNA提取純化的方法，可以有效分離得到膝關(guān)節(jié)積液中游離DNA，為研究游離DNA在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用提供保障。本發(fā)明擬采取的具體步驟如下：1)得到關(guān)節(jié)積液，離心，2至5℃，2800至3500轉(zhuǎn)每分鐘，10至20分鐘；2)棄掉沉淀，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，離心，2至5℃，10000至15000轉(zhuǎn)每分鐘，20至30分鐘；3)棄掉沉淀，上清液0.22微米過濾至新的離心管中；4)室溫平衡5至10分鐘；5)加入透明質(zhì)酸酶和RNA酶,37℃孵育2至4小時；6)加入蛋白酶K，60℃孵育30至45分鐘；7)加入1/5體積的CTAB緩沖液，65℃，孵育10至15分鐘；8)加入等體積的氯仿，充分混合，20至25℃離心，10000至15000轉(zhuǎn)每分鐘，10至20分鐘；9)取水相層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，使用試劑盒提取DNA，得到關(guān)節(jié)積液游離DNA。本發(fā)明中，使用的透明質(zhì)酸酶的最終濃度范圍是300至1000酶活單位每毫升。本發(fā)明中，使用的RNA酶的最終濃度范圍是10至20微克每毫升。本發(fā)明中，使用的蛋白酶K的最終濃度范圍是50至100微克每毫升。本發(fā)明中，使用的CTAB緩沖液，配制方法為，將十六烷基三甲基溴化銨（HexadecyltrimethylammoniumBromide，CTAB）溶于0.7摩爾每升的氯化鈉緩沖液中，濃度為10%（w/v），56℃水浴攪拌，完全溶解。本發(fā)明中，使用的游離DNA提取試劑盒是QIAGEN公司的試劑盒QIAampCirculatingNucleicAcidKit。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首先通過兩步離心法分別去除積液中的細(xì)胞和碎片等雜質(zhì)，第一步低速離心可以防止高速離心引起細(xì)胞破裂導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA外溢污染樣品；通過透明質(zhì)酸酶水解積液中的透明質(zhì)酸，降低積液的粘度；RNA酶水解積液中RNA雜質(zhì)；蛋白酶K水解積液中的蛋白質(zhì)，釋放DNA。通過本發(fā)明的處理可以有效降低積液的粘度，并去除RNA等雜質(zhì)，釋放積液中的游離DNA，配合使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒，可以得到高收率的積液游離DNA。以此方法制備的游離DNA為模版，利用PCR，可以得到目的片段，即通過本發(fā)明處理積液，得到的游離DNA可以作為后續(xù)研究中的模版，為研究游離DNA在關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病的致病機(jī)理提供保障。附圖說明圖1，三種方法提取得到游離DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，其中，Ａ泳道為第一種方法提取的游離DNA，B泳道為第二種方法提取的游離DNA，C泳道為第三種方法提取得到的游離DNA。圖2，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者積液游離DNA的PCR電泳圖。圖3，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者積液游離DNA的Agilent2100生物分析儀結(jié)果圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本實(shí)施例設(shè)計(jì)三種不同方法，對比提取積液游離DNA的產(chǎn)量，確定最佳方法，其中方法二為本發(fā)明提出的方法。取類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)積液10毫升，離心，4℃，3000轉(zhuǎn)每分鐘，10分鐘；棄掉沉淀，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，離心，4℃，10000轉(zhuǎn)每分鐘，20分鐘；棄掉沉淀，上清液0.22微米過濾；室溫平衡5分鐘。分別采用三種不同方法步驟提取積液DNA：方法一：取濾后上清液3毫升，加入100微升透明質(zhì)酸酶，終濃度500酶活單位每毫升；10微升RNA酶，終濃度10微克每毫升，37℃孵育2小時。加入100微升蛋白酶K，終濃度50微克每毫升，渦旋30秒，60℃孵育30分鐘。室溫靜置10分鐘，待下一步提取。方法二：取濾后上清液3毫升，加入100微升透明質(zhì)酸酶，終濃度500酶活單位每毫升；10微升RNA酶，終濃度10微克每毫升，37℃孵育2小時。加入100微升蛋白酶K，終濃度50微克每毫升，渦旋30秒，60℃孵育30分鐘。加入600微升CTAB緩沖液(10%,w/v)，65℃孵育10分鐘。加入3.6毫升氯仿，渦旋30秒，10000轉(zhuǎn)每分種，室溫離心10分鐘。取水層溶液，待下一步提取。方法三：取濾后上清液3毫升，加入3毫升N-乙酰半胱氨酸，終濃度2.5毫克每毫升，10微升RNA酶，終濃度10微克每毫升，37℃孵育2小時；加入100微升蛋白酶K，渦旋30秒，60℃孵育30分鐘。室溫靜置10分鐘,待下一步提取。使用GIAGEN公司的試劑盒QIAampCirculatingNucleicAcidKit提取游離DNA。主要步驟如下：向上清液中加入ACL緩沖液2.4毫升,渦旋30秒，60℃孵育30分鐘。加入5.4毫升ACB緩沖液，渦旋15秒。過結(jié)合柱后，依次加入600微升ACW1緩沖液、750微升ACW2緩沖液、750微升無水乙醇，14000轉(zhuǎn)每分鐘，離心3分鐘。56℃孵育10分鐘，加入50微升AVE緩沖液,室溫靜置3分鐘；14000轉(zhuǎn)每分鐘，離心1分鐘,獲得游離DNA。應(yīng)用PicoGreen熒光染料進(jìn)行DNA精確定量。對比三種提取積液游離DNA的方法，結(jié)果顯示見表1，方法二提取得到的游離DNA收率最高（約4.8微克）。取5微升游離DNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果如圖1所示，方法二提取的游離DNA（B泳道）含量最高，與熒光染料定量結(jié)果一致。圖2為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者積液游離DNA的PCR電泳圖。本發(fā)明采取方法二的技術(shù)路線分離純化膝關(guān)節(jié)積液的游離DNA。表1積液游離DNA測定結(jié)果　方法一方法二方法三游離DNA(微克)3.0984.8390.198以上所述，僅為本發(fā)明在關(guān)節(jié)腔積液中較佳實(shí)施而已，故不能依次限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容在其它組織液中的提取，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。實(shí)施例2本實(shí)施例應(yīng)用PCR法驗(yàn)證本發(fā)明方法得到的游離DNA，參考基因選擇通用的內(nèi)參基因GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶），反應(yīng)體系如表2所示，PCR程序如表3所示，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示4例積液的游離DNA均有目標(biāo)產(chǎn)物條帶，目標(biāo)條帶唯一且產(chǎn)物分子量與預(yù)期一致。表2PCR反應(yīng)體系（50微升）使用量終濃度模板DNA（積液游離DNA）5納克Primer-F10皮摩爾0.2微摩爾每升Primer-R10皮摩爾0.2微摩爾每升PrimerSTARMaxPremix(2X)25微升1XGAPDH引物設(shè)計(jì)序列為Primer-F：ACAACTTTGGTATCGTGGAAGGPrimer-R：GCCATCACGCCACAGTTTC表3PCR反應(yīng)程序應(yīng)用Agilent2100生物分析儀分析提取得到的關(guān)節(jié)腔積液游離DNA，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，積液的游離DNA分子量分布范圍很寬，從150bp左右到10000bp均有分布。當(dāng)前第1頁1 2 3