本發(fā)明涉及基因擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴(kuò)增方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，在長期協(xié)同進(jìn)化過程中其與植物形成了相互依存的關(guān)系。植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生活性物質(zhì)作為生物紡織資源、外源基因的載體和新藥的來源，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。雖然經(jīng)過多年的研究，但目前植物內(nèi)生細(xì)菌的研究還是處于初級(jí)階段，對(duì)于植物內(nèi)生細(xì)菌在植物中的分布及豐度調(diào)查還依賴于傳統(tǒng)的分離純化后使用通量較低的DGGE等方法，即使采用高通量測序進(jìn)行的相關(guān)研究也因?yàn)橹参锼拗鞅旧淼馁|(zhì)體和線粒體的干擾，造成植物內(nèi)生細(xì)菌的研究始終處在基礎(chǔ)研究的水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服植物內(nèi)生細(xì)菌傳統(tǒng)研究方法中需培養(yǎng)分離和植物宿主基因干擾等技術(shù)局限，提供一種植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴(kuò)增方法及應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴(kuò)增方法，具體步驟如下：

(1)植物預(yù)處理：取植物樣本0.5-1g，經(jīng)超聲清洗后在超凈臺(tái)中使用有效率濃度2％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒4-6min，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，隨后使用無菌水沖洗3-5遍徹底去除樣本表面消毒劑；

(2)植物樣本總DNA提?。和ㄟ^表面消毒的樣本經(jīng)液氮研磨均勻后轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，通過CTAB法純化樣本總DNA；

(3)樣本16S rRNA基因的擴(kuò)增：包括16S rRNA基因全長的乳液PCR擴(kuò)增和16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴(kuò)增子擴(kuò)增；

31)16S rRNA基因全長的乳液PCR擴(kuò)增

①設(shè)計(jì)三對(duì)引物AP1429(F/R)，MTR(F/R)和CHP(F/R)均以原核生物和植物16S rRNA基因?yàn)槟０?，其中MTR(F/R)和CHP(F/R)引物3’末端以C3spacer或C5spacer修飾，紅色標(biāo)記堿基為鎖核酸修飾基團(tuán)，用于抑制植物宿主來源的污染，AP1429(F/R)引物對(duì)用于植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增；

②配置植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，該混合液由乳液發(fā)生劑和PCR擴(kuò)增緩沖液構(gòu)成；

③將步驟②用于擴(kuò)增植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mL PCR管中并置于帶有熱蓋功能的PCR儀中，在PCR以上運(yùn)行以下反應(yīng)循環(huán)：95℃1min，1個(gè)循環(huán)；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25個(gè)循環(huán)；68-72℃5min，1個(gè)循環(huán)；25℃恒溫；

④向步驟③每個(gè)PCR管的反應(yīng)產(chǎn)物中添加10％體積的2-丁醇，震蕩混勻后以13200×g離心4-6min，離心完成后取下層水相溶液為模板進(jìn)行16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴(kuò)增子擴(kuò)增，結(jié)果檢測通過吸取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物對(duì)的PCR產(chǎn)物作為陽性對(duì)照，回收目的條帶；

32)16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴(kuò)增子擴(kuò)增：以31)中的④步驟水相反應(yīng)產(chǎn)物為模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR擴(kuò)增緩沖液中，在95℃1min，1個(gè)循環(huán)；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20個(gè)循環(huán)；68-72℃5min，1個(gè)循環(huán)；25℃恒溫的PCR循環(huán)條件下完成，結(jié)果通過吸取該步驟反應(yīng)產(chǎn)物5μL在瓊脂糖凝膠電泳中檢測；

(4)基于Illumina平臺(tái)的高通量測序及生物信息分析：包括植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子純化回收、擴(kuò)增子測序文庫構(gòu)建、Illumina HiSeq測序和測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析；

41)植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子純化回收

將步驟32)的反應(yīng)產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒切膠回收片段大小在280-300bp之間的目標(biāo)條帶，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段；使用2％瓊脂糖電泳檢測，檢測條件5V/cm，20min；

42)擴(kuò)增子測序文庫構(gòu)建

文庫構(gòu)建使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit；

43)Illumina HiSeq測序

測序平臺(tái)為Illumina HiSeq 2500，測序模式為V2SBS快速250PE模式；

44)測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

測序得到的PE reads用FLASH軟件進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列操作過程后完成數(shù)據(jù)過濾，得到供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列，后續(xù)生物信息學(xué)操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，統(tǒng)計(jì)和作圖使用R完成，操作步驟如下：

a、根據(jù)Barcode區(qū)分樣品；

b、使用Uchime去除嵌合體；

c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法進(jìn)行OTU的聚類；

d、挑選出OTU的代表性序列；

e、使用Greengene或Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類信息的劃分。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟31)的步驟②中，所述乳液發(fā)生劑由含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.9％礦物油、4.5％Span 80、0.5％吐溫80、0.1％Triton X-100構(gòu)成，所述PCR擴(kuò)增緩沖液由0.4μM引物、2.5mM氯化鎂、0.2mM dNTPs、1U Taq DNA聚合酶以及DNA模板組成。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟32)中的PCR擴(kuò)增緩沖液由40mM Tris-HCl pH8.0、40mM KCl、3mM MgCl₂、5％甘油、1％吐溫20、1mM dNTPs、1個(gè)單位的KOD DNA聚合酶、10μM U515F、10μM E806R和1μL的31)步驟④水相反應(yīng)產(chǎn)物構(gòu)成。

一種所述的植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴(kuò)增方法的應(yīng)用，該基因擴(kuò)增方法用于高通量測序的植物病害檢測及植食性動(dòng)物腸道微生物檢測。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行植物內(nèi)生細(xì)菌的測序分析，相較于傳統(tǒng)的DGGE等方法數(shù)據(jù)量更大，檢測結(jié)果更完整；

2、本發(fā)明采用的植物內(nèi)生菌測序技術(shù)最大程度降低了植物宿主的污染，對(duì)于植物內(nèi)生細(xì)菌的研究帶來了其他常規(guī)方法不能達(dá)到的精度和準(zhǔn)確度；

3、本發(fā)明采用的植物內(nèi)生細(xì)菌測序技術(shù)相較于目前采用roche 454測序平臺(tái)進(jìn)行的測序，結(jié)果顯示本發(fā)明的結(jié)果多樣性更高，成本低于roche454測序平臺(tái)的十分之一。

附圖說明

圖1為植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果示意圖。

M：DNA分子量標(biāo)記；C：對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果；R：植物內(nèi)生細(xì)菌擴(kuò)增結(jié)果。

圖2為門水平植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)高通量測序結(jié)果示意圖。

GSS：本發(fā)明植物內(nèi)生細(xì)菌樣本；C：對(duì)照植物內(nèi)生細(xì)菌樣本

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴(kuò)增方法如下：

(1)植物預(yù)處理：取植物樣本0.5-1g，經(jīng)超聲清洗后在超凈臺(tái)中使用有效率濃度2％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒5min，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為75％的乙醇溶液浸泡30s，隨后使用無菌水沖洗4遍徹底去除樣本表面消毒劑；

(2)植物樣本總DNA提取：通過表面消毒的樣本經(jīng)液氮研磨均勻后轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，通過CTAB法純化樣本總DNA；

(3)樣本16S rRNA基因的擴(kuò)增：包括16S rRNA基因全長的乳液PCR擴(kuò)增和16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴(kuò)增子擴(kuò)增；

31)16S rRNA基因全長的乳液PCR擴(kuò)增

①設(shè)計(jì)三對(duì)引物AP1429(F/R)，MTR(F/R)和CHP(F/R)均以原核生物和植物16S rRNA基因?yàn)槟０?，其中MTR(F/R)和CHP(F/R)引物3’末端以C3spacer或C5spacer修飾，紅色標(biāo)記堿基為鎖核酸修飾基團(tuán)，用于抑制植物宿主來源的污染，AP1429(F/R)引物對(duì)用于植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增；

②配置植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，該混合液由乳液發(fā)生劑和PCR擴(kuò)增緩沖液構(gòu)成；乳液發(fā)生劑由含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5％Span 80、0.4％吐溫80、0.05％Triton X-100的礦物油和余量蒸餾水混合而成；PCR擴(kuò)增緩沖液由40mM Tris-HCl pH8.0、40mM KCl、3mM MgCl₂、5％甘油、1％吐溫20、1mM dNTPs、1個(gè)單位的KOD DNA聚合酶、10μM AP1429-F、10μM AP1429-R、10μM MTR-F、10μM MTR-R、10μM CHP-F、10μM CHP-R和50-100納克的樣本總DNA混合而成；

③將步驟②用于擴(kuò)增植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mLPCR管中并置于帶有熱蓋功能的PCR儀中，在PCR以上運(yùn)行以下反應(yīng)循環(huán)：95℃1min，1個(gè)循環(huán)；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25個(gè)循環(huán)；68-72℃5min，1個(gè)循環(huán)；25℃恒溫；

④向步驟③每個(gè)PCR管的反應(yīng)產(chǎn)物中添加10％體積的2-丁醇，震蕩混勻后以13200×g離心4-6min，離心完成后取下層水相溶液為模板進(jìn)行16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴(kuò)增子擴(kuò)增，結(jié)果檢測通過吸取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物對(duì)的PCR產(chǎn)物作為陽性對(duì)照，回收目的條帶；

32)16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴(kuò)增子擴(kuò)增：以31)中的④步驟水相反應(yīng)產(chǎn)物為模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR擴(kuò)增緩沖液中(PCR擴(kuò)增緩沖液由40mM Tris-HCl pH8.0、40mM KCl、3mM MgCl₂、5％甘油、1％吐溫20、1mM dNTPs、1個(gè)單位的KOD DNA聚合酶、10μM U515F、10μM E806R和1μL的31)步驟④水相反應(yīng)產(chǎn)物構(gòu)成)在95℃1min，1個(gè)循環(huán)；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20個(gè)循環(huán)；68-72℃5min，1個(gè)循環(huán)；25℃恒溫的PCR循環(huán)條件下完成，結(jié)果通過吸取該步驟反應(yīng)產(chǎn)物5μL在瓊脂糖凝膠電泳中檢測；

(4)基于Illumina平臺(tái)的高通量測序及生物信息分析：包括植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子純化回收、擴(kuò)增子測序文庫構(gòu)建、Illumina HiSeq測序和測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析；

41)植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子純化回收

將步驟32)的反應(yīng)產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒切膠回收片段大小在280-300bp之間的目標(biāo)條帶，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段；使用2％瓊脂糖電泳檢測，檢測條件5V/cm，20min；

42)擴(kuò)增子測序文庫構(gòu)建

文庫構(gòu)建使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit(FC-121-3001/3002)；

43)Illumina HiSeq測序

測序平臺(tái)為Illumina HiSeq 2500，測序模式為V2SBS快速250PE模式；

44)測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

測序得到的PE reads用FLASH軟件進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列操作過程后完成數(shù)據(jù)過濾，得到供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列，后續(xù)生物信息學(xué)操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，統(tǒng)計(jì)和作圖使用R完成，操作步驟如下：

a、根據(jù)Barcode區(qū)分樣品；

b、使用Uchime去除嵌合體；

c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法進(jìn)行OTU的聚類；

d、挑選出OTU的代表性序列；

e、使用Greengene或Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類信息的劃分。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟31)的步驟②中，

實(shí)施例

采用CTAB法純化椴樹葉片總DNA，按照前述方法進(jìn)行材料預(yù)處理，隨后按照本發(fā)明的方法進(jìn)行植物內(nèi)生菌片段的擴(kuò)增，同時(shí)以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物的樣本做對(duì)照，擴(kuò)增完畢后采用1％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)結(jié)果進(jìn)行分離，結(jié)果如圖1所示。在對(duì)照樣本中擴(kuò)增出的條帶為線粒體與葉綠體條帶，采用本發(fā)明后線粒體和葉綠體條帶幾乎不可見，僅有內(nèi)生細(xì)菌條帶清晰可見。

隨后將植物內(nèi)生細(xì)菌條帶純化回收后采用前述方法進(jìn)行16S高變區(qū)二次擴(kuò)增后建庫測序。測序結(jié)果如圖2所示，常規(guī)16S測序因?yàn)槭艿饺~綠體同源基因的污染，測序結(jié)果95％以上均為非目的片段，而本發(fā)明將葉綠體污染降到最低，還原植物內(nèi)生菌真實(shí)結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明采用了經(jīng)過修飾的寡聚核苷酸引物組合，通過PCR方法抑制植物宿主來源的16S rRNA基因的擴(kuò)增，與此同時(shí)植物內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA基因的擴(kuò)增不受影響，最終通過高通量測序的方法對(duì)植物內(nèi)生菌的種類及豐度能夠有一個(gè)詳盡的調(diào)查和了解，對(duì)于植物內(nèi)生細(xì)菌的鑒定提供了一個(gè)可靠的新途徑。相對(duì)傳統(tǒng)的分離純化后鑒定的方法，本發(fā)明克服了已有的技術(shù)局限性。通過本發(fā)明可降低復(fù)雜操作過程中帶來的環(huán)境污染，所需樣本量極少，試驗(yàn)操作簡便易行，可極大地提高植物內(nèi)生細(xì)菌的鑒定水平。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。