技術(shù)特征：

1.一種植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)植物預處理：取植物樣本0.5-1g，經(jīng)超聲清洗后在超凈臺中使用有效率濃度2％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒4-6min，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，隨后使用無菌水沖洗3-5遍徹底去除樣本表面消毒劑；

(2)植物樣本總DNA提?。和ㄟ^表面消毒的樣本經(jīng)液氮研磨均勻后轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，通過CTAB法純化樣本總DNA；

(3)樣本16S rRNA基因的擴增：包括16S rRNA基因全長的乳液PCR擴增和16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴增子擴增；

31)16S rRNA基因全長的乳液PCR擴增

①設(shè)計三對引物AP1429/F-R，MTR/F-R和CHP/F-R均以原核生物和植物16S rRNA基因為模板，其中MTR/F-R和CHP/F-R引物3’末端以C3spacer或C5spacer修飾，紅色標記堿基為鎖核酸修飾基團，用于抑制植物宿主來源的污染，AP1429/F-R引物對用于植物內(nèi)生細菌16S rRNA基因的擴增；

②配置植物內(nèi)生細菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，該混合液由體積為1:1的乳液發(fā)生劑和PCR擴增緩沖液混合而成。

③將步驟②用于擴增植物內(nèi)生細菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mL PCR管中并置于帶有熱蓋功能的PCR儀中，在PCR以上運行以下反應循環(huán)：95℃1min，1個循環(huán)；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25個循環(huán)；68-72℃5min，1個循環(huán)；25℃恒溫；

④向步驟③每個PCR管的反應產(chǎn)物中添加10％體積的2-丁醇，震蕩混勻后以13200×g離心4-6min，離心完成后取下層水相溶液為模板進行16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴增子擴增，結(jié)果檢測通過吸取5μL反應產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物對的PCR產(chǎn)物作為陽性對照，回收目的條帶；

32)16S rRNA基因高變區(qū)/保守區(qū)擴增子擴增：以31)中的④步驟水相反應產(chǎn)物為模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR擴增緩沖液中，在95℃1min，1個循環(huán)；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20個循環(huán)；68-72℃5min，1個循環(huán)；25℃恒溫的PCR循環(huán)條件下完成，結(jié)果通過吸取該步驟反應產(chǎn)物5μL在瓊脂糖凝膠電泳中檢測；

(4)基于Illumina平臺的高通量測序及生物信息分析：包括植物內(nèi)生細菌16S rRNA基因擴增子純化回收、擴增子測序文庫構(gòu)建、Illumina HiSeq測序和測序數(shù)據(jù)生物信息學分析；

41)植物內(nèi)生細菌16S rRNA基因擴增子純化回收

將步驟32)的反應產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒切膠回收片段大小在280-300bp之間的目標條帶，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段；使用2％瓊脂糖電泳檢測，檢測條件5V/cm，20min；

42)擴增子測序文庫構(gòu)建

文庫構(gòu)建使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit；

43)Illumina HiSeq測序

測序平臺為Illumina HiSeq 2500，測序模式為V2 SBS快速250PE模式；

44)測序數(shù)據(jù)生物信息學分析

測序得到的PE reads用FLASH軟件進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列操作過程后完成數(shù)據(jù)過濾，得到供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標序列，后續(xù)生物信息學操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，統(tǒng)計和作圖使用R完成，操作步驟如下：

a、根據(jù)Barcode區(qū)分樣品；

b、使用Uchime去除嵌合體；

c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法進行OTU的聚類；

d、挑選出OTU的代表性序列；

e、使用Greengene或Silva數(shù)據(jù)庫進行物種分類信息的劃分。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增方法，其特征在于，所述步驟31)的步驟②中，所述乳液發(fā)生劑由含有質(zhì)量分數(shù)為94.9％礦物油、4.5％Span 80、0.5％吐溫80、0.1％Triton X-100構(gòu)成，所述PCR擴增緩沖液由0.4μM引物、2.5mM氯化鎂、0.2mM dNTPs、1U Taq DNA聚合酶以及DNA模板組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增方法，其特征在于，所述步驟32)中的PCR擴增緩沖液由40mM Tris-HCl pH8.0、40mM KCl、3mM MgCl₂、5％甘油、1％吐溫20、1mM dNTPs、1個單位的KOD DNA聚合酶、10μM U515F、10μM E806R和1μL的31)步驟④水相反應產(chǎn)物構(gòu)成。

4.一種如權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生菌16S rRNA基因擴增方法的應用，其特征在于，該基因擴增方法用于高通量測序的植物病害檢測及植食性動物腸道微生物檢測。