本發(fā)明屬于基因組DNA提取領(lǐng)域，特別涉及一種黑鯛基因組DNA的快速提取方法。

背景技術(shù)：

隨著分子生物學(xué)手段在魚類研究的大規(guī)模應(yīng)用，基因組DNA的提取已經(jīng)成為了一種最常用的技術(shù)之一，是各類研究成功進(jìn)行的前提和保證。

酚/氯仿抽提法是一種常用的DNA提取方法，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)，通常是將處理好的樣本，分別加入細(xì)胞裂解液，蛋白酶K，苯酚以及氯仿和異戊醇的混合液逐步進(jìn)行處理，再加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。苯酚可以使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制DNase的降解作用。加入苯酚后，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿可以除去核酸溶液中的苯酚，加速有機(jī)相與液相分層。異戊醇可以降低表面張力，減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相和下層的有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

酚/氯仿抽提法是魚類基因組提取中最常用的方法，該方法技術(shù)較為成熟，提取效果理想，但操作較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，且提取試劑多具有毒性，易對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員造成傷害。而采用試劑盒提取的成本則較高，不適用于基因組DNA的大量提取。目前許多生物技術(shù)手段，如遺傳育種中家系的鑒定，群體遺傳多樣性分析，利用分子標(biāo)記對(duì)增殖放流效果進(jìn)行評(píng)估等，都需要大量個(gè)體進(jìn)行分析或篩查，基因組DNA提取工作量較大。所以，急需發(fā)明一種快速、低成本的DNA提取方法將為這些研究提供便利。

專利號(hào)201210031745.5公開了一種草魚基因組DNA快速提取方法，相較于該方法，本發(fā)明所用試劑不含SDS、EDTA等會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)有直接影響的物質(zhì)，因此，DNA提取液可不經(jīng)吸附柱等方式純化直接用于PCR反應(yīng)。步驟大為簡(jiǎn)化，操作時(shí)間更短，對(duì)設(shè)備的要求更低，提取成本也更低，可在試驗(yàn)條件相對(duì)簡(jiǎn)陋的地點(diǎn)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)操作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種黑鯛基因組DNA的快速提取方法，該方法提取步驟簡(jiǎn)單、快速，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求較低，基因組DNA的提取可在1h內(nèi)完成，相較于試劑盒提取更便捷。

本發(fā)明的一種黑鯛基因組DNA的快速提取方法，包括：

將黑鯛鰭條或肌肉樣品研磨或剪碎，加入提取緩沖液，震蕩混勻，得到黑鯛組織提取液；然后于65℃放置20～40min，取出樣品，冷卻，靜置或離心取上清，得到黑鯛基因組DNA；其中，提取緩沖液為1％TritonX-100、pH＝8.0的100mM Tris-HCl、300mM NaAc和500mM NaCl的混合液。

所述黑鯛鰭條或肌肉樣品為新鮮樣品或無水乙醇保存樣品。

所述提取緩沖液與黑鯛鰭條或肌肉樣品的比例為10～20μL:1μg。

所述取出樣品前采用金屬浴或恒溫水浴鍋65℃放置30min，期間間或混勻。

所述靜置的時(shí)間為3～5min。

所述離心的條件為13000r/min離心3min。

所述黑鯛基因組DNA可通過加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀，再經(jīng)70％乙醇洗滌純化以滿足更高實(shí)驗(yàn)要求或用于長(zhǎng)期保存。

專利號(hào)201210031745.5公開了一種草魚基因組DNA快速提取方法，相較于該方法，本發(fā)明所用試劑不含SDS、EDTA等會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)有直接影響的物質(zhì)，因此，DNA提取液可不經(jīng)吸附柱等方式純化直接用于PCR反應(yīng)。步驟大為簡(jiǎn)化，操作時(shí)間更短，對(duì)設(shè)備的要求更低，提取成本也更低，可在試驗(yàn)條件相對(duì)簡(jiǎn)陋的地點(diǎn)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)操作。

有益效果

(1)本發(fā)明提取步驟簡(jiǎn)單、快速，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求較低，基因組DNA的提取可在1h內(nèi)完成，相較于試劑盒提取更便捷；

(2)本發(fā)明中所用試劑成本極低，適用于黑鯛基因組DNA的大規(guī)模提?。?/p>

(3)本發(fā)明中所用試劑較為安全，對(duì)人體傷害小，對(duì)環(huán)境友好；

(4)本發(fā)明中試劑對(duì)PCR和酶切等反應(yīng)的影響小，DNA提取液可不經(jīng)純化直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M為生工生物DNA Marker D；

圖2為實(shí)施例2中基因組DNA的PCR擴(kuò)增效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

從無水乙醇保存黑鯛背鰭鰭條樣品提取DNA，并用于線粒體COⅠ基因的PCR擴(kuò)增。實(shí)施步驟如下：

(1)剪取20μg無水乙醇浸泡黑鯛鰭條樣品于1.5mL離心管中，用玻璃研磨棒將樣品在管壁充分研碎；

(2)加入200μL提取緩沖液(1％TritonX-100+100mM Tris-HCl(pH＝8.0)+300mM NaAc+500mM NaCl)，震蕩1min充分混勻；

(3)金屬浴或恒溫水浴鍋65℃放置30min，期間間或混勻；

(4)取出樣品，冷卻，于離心機(jī)中13000r/min離心3min；

(5)吸取上清于另一新管中，用于下一步PCR擴(kuò)增。用本方法提取的黑鯛基因組DNA，較為完整，效果理想。所取的黑鯛基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示(M為生工生物DNAMarker D)。

實(shí)施例2

(1)剪取20μg黑鯛新鮮肌肉樣品于1.5mL離心管中，用玻璃研磨棒將樣品在管壁充分研磨；

(2)加入300μL提取緩沖液(1％TritonX-100+100mM Tris-HCl(pH＝8.0)+300mM NaAc+500mM NaCl)，震蕩1min充分混勻，得到黑鯛組織提取液；

(3)恒溫水浴鍋65℃放置35min，期間間或混勻；

(4)取出樣品，冷卻，靜置5min；

(5)上清液即為得到的黑鯛基因組DNA，用于下一步PCR擴(kuò)增。

(6)用一對(duì)黑鯛線粒體COⅠ基因引物對(duì)上述提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：

上游引物：5′-TACTCCTTACAGACCGAAAT-3′；

下游引物：5′-TTATGAAGAAAGTGGCAGA-3′；

采用25μL擴(kuò)增體系：2.5μL 10×PCR buffer，0.5μL dNTP(10mmol/L)，1.5μL Mg²⁺(25mmol/L)，2.5μL DNA提取液，上下游引物各0.75μL(10μmol/L)，0.25μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃45s，52℃退火45s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增條帶清晰，無雜帶，符合預(yù)期目標(biāo)大小，可以滿足測(cè)序等分析的需要。擴(kuò)增效果如圖2所示。

對(duì)比例1

試劑盒提取黑鯛基因組DNA：

(1)20-50mg組織剪成小碎塊，轉(zhuǎn)入裝有180μl組織裂解液的1.5ml離心管中，用大口徑槍頭吹打混勻；

(2)加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋震蕩充分混勻；

(3)將裂解物放置在55℃水浴1-3小時(shí)，期間輕柔震蕩幾次；

(4)加入200μl結(jié)合液，立刻渦旋震蕩充分混勻，70℃放置10min；

(5)冷卻后加100μl異丙醇，立刻渦旋震蕩充分混勻；

(6)用1ml的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個(gè)吸附柱中，吸附柱放入收集管，13000rpm離心60s，倒掉收集管中廢液；

(7)加入500μl抑制物去除液，12000rpm離心30s，棄去廢液；

(8)加入700μl漂洗液，12000rpm離心30s，棄去廢液；

(9)將吸附柱放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液；

(10)取出吸附柱，放入干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB，室溫放置3-5分鐘，12000rpm離心1分鐘。離心管中基因組DNA放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)比例1可以發(fā)現(xiàn)，試劑盒提取步驟繁瑣，采用的試劑種類多，工藝成本高，不適用于大規(guī)模作業(yè)。