本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種利用射線實(shí)現(xiàn)供二代測(cè)序使用的DNA片段化的方法及裝置。

背景技術(shù)：

從1977年第一代DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展至今三十多年時(shí)間，測(cè)序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展，從第一代到第三代乃至第四代。就當(dāng)前形勢(shì)看來，第二代測(cè)序技術(shù)在全球測(cè)序市場(chǎng)上仍然占有著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)位置。DNA的片段化，是決定能否成功構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)的關(guān)鍵。

現(xiàn)有的DNA片段化的方法主要有超聲機(jī)械片段化和片段化酶片段化兩種。超聲機(jī)械片段化是將裝有DNA樣品的EP管(一般為0.5μg～10μgDNA樣品，用蒸餾水補(bǔ)足體積至150μL)放入超聲水槽中，以0℃左右的水作為超聲介質(zhì)進(jìn)行間斷的超聲。每超聲一段時(shí)間檢測(cè)一次片段化效果，直至DNA片段達(dá)到目標(biāo)長(zhǎng)度為止。這種片段化方法中超聲儀器價(jià)格較高，需要配套的冷室存放機(jī)器以免片段化過程中產(chǎn)生熱量使機(jī)器的溫度過高。片段化酶片段化是將需要片段化的DNA樣品置于片段化酶的反應(yīng)體系中，在37℃的條件下進(jìn)行孵育。在此過程中，要時(shí)時(shí)檢測(cè)DNA的片段化情況，以免使片段化形成的片段過小。這種片段化方法易形成小片段污染，且重復(fù)性易受酶活性(比如片段化酶反復(fù)凍融影響活性)的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是：使DNA樣品(主要是基因組DNA)經(jīng)過片段化之后片段大小達(dá)到目標(biāo)長(zhǎng)度范圍，既沒有大片段殘余也沒有小片段污染。

具體來說，本發(fā)明提出了如下技術(shù)方案。

第一方面，本發(fā)明提供了一種利用射線實(shí)現(xiàn)DNA片段化的方法，該方法包括：

將DNA溶液暴露于輻射源中，使DNA溶液中的DNA分子經(jīng)照射被損傷，從而發(fā)生斷裂，得到目標(biāo)范圍長(zhǎng)度的DNA片段.。

優(yōu)選的，其中，所述DNA分子經(jīng)輻射被損傷，從而發(fā)生斷裂過程中，將DNA溶液經(jīng)冷卻處理。

優(yōu)選的，其中，所述DNA分子為基因組DNA，所述DNA溶液濃度為20～100ng/μl。

優(yōu)選的，其中，所述輻射源為紫外線和/或X射線。

優(yōu)選的，其中，DNA片段化程度隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而加深。

優(yōu)選的，其中，所述照射時(shí)間為0.8-1.2小時(shí)，優(yōu)選1小時(shí)，照射強(qiáng)度為400-600mW/m²，優(yōu)選500mW/m²。

優(yōu)選的，其中，所述DNA分子經(jīng)輻射被損傷，從而發(fā)生斷裂過程中，將DNA溶液冷卻在0-8℃溫度范圍內(nèi)。

優(yōu)選的，其中，所述DNA分子為2000-10000bp的DNA分子。

第二方面，本發(fā)明提供了一種利用射線實(shí)現(xiàn)DNA片段化的裝置，該裝置包括：輻射源發(fā)射裝置，和DNA溶液容器；

所述輻射源發(fā)射裝置發(fā)出射線；

所述DNA溶液容器置于發(fā)出的射線的輻射范圍內(nèi)。

優(yōu)選的，其中所述裝置還包括冷卻裝置，所述冷卻裝置用于冷卻DNA溶液容器中的DNA溶液。

優(yōu)選的，其中，所述輻射源發(fā)射裝置發(fā)出紫外線和/或X射線。

第三方面，本發(fā)明提供一種上述任一種目標(biāo)范圍長(zhǎng)度的DNA片段在構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)中的應(yīng)用。

采用本發(fā)明的技術(shù)方案，至少具有如下有益效果：DNA的片段化，是決定能否成功構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)的關(guān)鍵。本發(fā)明能夠使DNA樣品(主要是基因組DNA)經(jīng)過片段化之后片段大小達(dá)到目標(biāo)長(zhǎng)度范圍，既沒有大片段殘余也沒有小片段污染，且實(shí)驗(yàn)設(shè)備低能耗，無需特殊的實(shí)驗(yàn)耗材、成本低，實(shí)驗(yàn)條件具有高重復(fù)性、穩(wěn)定性的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1是人的血液基因組DNA分子的瓊脂糖凝膠圖。

圖2是實(shí)施例1基因組DNA片段的瓊脂糖凝膠圖。

圖3是實(shí)施例2基因組DNA片段的瓊脂糖凝膠圖。

圖4是實(shí)施例3基因組DNA片段的瓊脂糖凝膠圖。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但具體的實(shí)施方式并不是對(duì)本發(fā)明所做的限制。

紫外線、X射線等輻射源會(huì)導(dǎo)致DNA分子的損傷甚至斷裂，本發(fā)明通過電極產(chǎn)生以上幾種輻射源中的任意一種或幾種，作用于DNA溶液，使溶液中的DNA分子受到損傷，從而發(fā)生斷裂。同時(shí)通過制冷模塊進(jìn)行制冷，以防止強(qiáng)輻射導(dǎo)致的溫度過高。本發(fā)明采用輻射照射的方式，實(shí)現(xiàn)DNA片段化，具有低能耗、高重復(fù)性、穩(wěn)定性、無需特殊的實(shí)驗(yàn)耗材、成本低等特點(diǎn)，能夠滿足二代測(cè)序后續(xù)樣本富集、建庫(kù)和測(cè)序的需要。

本發(fā)明提供了一種利用射線實(shí)現(xiàn)DNA片段化的方法，該方法包括：

1)將DNA溶液暴露于輻射源中，使DNA溶液中的DNA分子經(jīng)照射被損傷，從而發(fā)生斷裂，得到目標(biāo)范圍長(zhǎng)度的DNA片段。

本發(fā)明中，“目標(biāo)范圍長(zhǎng)度的DNA片段”是指為了構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)的需要，DNA片段的堿基長(zhǎng)度范圍。針對(duì)不同的庫(kù)有不同的目標(biāo)控制，根據(jù)射線的強(qiáng)度和時(shí)間能夠得到不同大小的目標(biāo)片段，以適用不同庫(kù)。

本發(fā)明中，所述DNA分子為基因組DNA，任何生物的基因組DNA都可以應(yīng)用于本發(fā)明，只要DNA分子為2000-10000bp的DNA分子。所述DNA溶液濃度為20～100ng/μl。

所述輻射源為紫外線、X射線中的至少一種。本發(fā)明所用紫外線的波長(zhǎng)為10-400nm。輻射射線作用于DNA分子上，當(dāng)輻射對(duì)DNA分子的損傷大于DNA分子鏈中的分子間作用力時(shí)，DNA分子斷裂，形成短的DNA分子片段，從而達(dá)到DNA分子片段化的作用。DNA片段化程度隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而加深。優(yōu)選的，所述照射時(shí)間為0.8-1.2小時(shí)，優(yōu)選1小時(shí)，照射時(shí)間強(qiáng)度為400-600mW/m²，優(yōu)選500mW/m²。

2)可選的，所述DNA分子經(jīng)輻射被損傷，從而發(fā)生斷裂過程中，將DNA溶液經(jīng)冷卻處理。優(yōu)選的，將DNA溶液冷卻在0-8℃溫度范圍內(nèi)。

為了完成上述方法，本發(fā)明提供了一種利用射線實(shí)現(xiàn)DNA片段化的裝置，該裝置包括：輻射源發(fā)射裝置，DNA溶液容器，以及可選的冷卻裝置；

所述輻射源發(fā)射裝置發(fā)出射線；

所述DNA溶液容器置于發(fā)出的射線的輻射范圍內(nèi)；

所述冷卻裝置用于冷卻DNA溶液容器中的DNA溶液。

本發(fā)明中，所述輻射源發(fā)射裝置發(fā)出紫外線、X射線中的至少一種。本發(fā)明所用輻射源發(fā)射裝置為常規(guī)市購(gòu)裝置，例如紫外線發(fā)生器。

本發(fā)明中，所述冷卻裝置是壓縮機(jī)制冷、半導(dǎo)體制冷或冰浴。本發(fā)明制冷所用半導(dǎo)體是常規(guī)市售半導(dǎo)體制冷片。

本發(fā)明利用射線實(shí)現(xiàn)可供二代測(cè)序使用的DNA片段，同時(shí)利用采用壓縮機(jī)制冷、半導(dǎo)體制冷或冰浴等方式防止輻射過程中DNA溶液以及裝置的某個(gè)區(qū)域過熱。DNA片段化的現(xiàn)有技術(shù)主要有超聲機(jī)械片段化和酶片段化兩種。其中超聲機(jī)械片段化具有超聲儀器價(jià)格較高，對(duì)環(huán)境要求高的缺陷；而片段化酶片段化易形成小片段污染，且重復(fù)性差。本發(fā)明利用射線實(shí)現(xiàn)可供二代測(cè)序使用的DNA片段化，設(shè)備價(jià)格較為低廉，設(shè)備中本身包括降溫設(shè)備，對(duì)環(huán)境的溫度、濕度等要求低，同時(shí)實(shí)驗(yàn)條件的可重復(fù)性好，可以盡量省去每次實(shí)驗(yàn)對(duì)條件的摸索。

以下以非限制方式更具體地介紹適用于本發(fā)明的利用射線實(shí)現(xiàn)供二代測(cè)序使用的DNA片段化的方法及裝置。

實(shí)施例1

采用人的血液基因組DNA制成的DNA溶液，通過血液DNA提取試劑盒提取DNA溶液濃度為20ng/μl，將DNA溶液暴露于輻射源中。輻射源為紫外，廠家爍慧，型號(hào)SUNRAY 400/600的紫外線，其強(qiáng)度為500mW/m²。為了得到目標(biāo)長(zhǎng)度300bp的DNA片段，經(jīng)過1小時(shí)時(shí)間的照射，使DNA溶液中的DNA分子被損傷，從而發(fā)生斷裂。在DNA溶液被紫外線照射過程中，采用冰浴冷卻DNA溶液，使DNA溶液的溫度保持在8℃。

對(duì)斷裂處理前的血液基因組DNA，和斷裂后的基因組DNA片段均采用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試長(zhǎng)度。將斷裂處理前的血液基因組DNA加入到瓊脂糖凝膠板中(廠家Biowest，型號(hào)G-10)，電壓140V下進(jìn)行電泳30分鐘，然后用凝膠分析儀(廠家天龍，型號(hào)1600)觀察DNA條帶并照相，結(jié)果如圖1所示，DNA分子為4000bp左右。所采用的Marker測(cè)試范圍bp為100-10000(碧云天的D0107)。

將本實(shí)施例制備的基因組DNA片段加入到瓊脂糖凝膠板中(廠家Biowest，型號(hào)G-10)，電壓140V下進(jìn)行電泳30分鐘，然后用凝膠分析儀(廠家天龍，型號(hào)1600)觀察DNA條帶并照相，結(jié)果如圖2所示，左側(cè)顯示為標(biāo)準(zhǔn)樣，右側(cè)為本實(shí)施例DNA片段。DNA已被斷裂成200bp-400bp的DNA片段。

實(shí)施例2

采用同實(shí)施例1的人的血液基因組DNA制成的DNA溶液，通過血液DNA提取試劑盒提取DNA溶液濃度為100ng/μl，將DNA溶液暴露于輻射源中。輻射源為紫外，廠家爍慧，型號(hào)SUNRAY 400/600的紫外線，其強(qiáng)度為400mW/m²。為了得到目標(biāo)長(zhǎng)度300bp的DNA片段，經(jīng)過0.8小時(shí)時(shí)間的照射，使DNA溶液中的DNA分子被損傷，從而發(fā)生斷裂。在DNA溶液被X射線照射過程中，采用冰浴冷卻DNA溶液，使DNA溶液的溫度保持在5℃。對(duì)基因組DNA片段采用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試長(zhǎng)度。將本實(shí)施例制備的基因組DNA片段加入到瓊脂糖凝膠板中(廠家Biowest，型號(hào)G-10)，電壓140V下進(jìn)行電泳30分鐘，然后用凝膠分析儀(廠家天龍，型號(hào)1600)觀察DNA條帶并照相，結(jié)果如圖2所示，左側(cè)顯示為標(biāo)準(zhǔn)樣，右側(cè)為本實(shí)施例DNA片段。DNA已被斷裂成200bp-400bp的DNA片段。

實(shí)施例3

采用同實(shí)施例1的人的血液基因組DNA制成的DNA溶液，通過血液DNA提取試劑盒提取DNA溶液濃度為100ng/μl，將DNA溶液暴露于輻射源中。輻射源為X射線，廠家恒星科技，型號(hào)BDX3200，其強(qiáng)度為600mW/m²。為了得到目標(biāo)長(zhǎng)度300bp的DNA片段，經(jīng)過0.8小時(shí)時(shí)間的照射，使DNA溶液中的DNA分子被損傷，從而發(fā)生斷裂。在DNA溶液被X射線照射過程中，采用冰浴冷卻DNA溶液，使DNA溶液的溫度保持在8℃。對(duì)基因組DNA片段采用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試長(zhǎng)度。將本實(shí)施例制備的基因組DNA片段加入到瓊脂糖凝膠板中(廠家Biowest，型號(hào)G-10)，電壓140V下進(jìn)行電泳30分鐘，然后用凝膠分析儀(廠家天龍，型號(hào)1600)觀察DNA條帶并照相，結(jié)果如圖3所示，左側(cè)顯示為標(biāo)準(zhǔn)樣，右側(cè)為本實(shí)施例DNA片段。DNA已被斷裂成200bp-400bp的DNA片段。