本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種基于靶向新一代測(cè)序的耳聾基因檢測(cè)集合、試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：耳聾是語言學(xué)習(xí)及交流的最大的障礙，其中50％～70％可能與遺傳因素有關(guān)。在世界范圍內(nèi)，每1000名新生兒中就有1名先天性耳聾患兒。在發(fā)達(dá)國(guó)家，先天性耳聾患者中至少50％是由遺傳因素造成的。據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部2012年出生缺陷防治報(bào)告顯示，先天性聽力障礙在目前出生缺陷中位居首位約1‰-3‰，每年新發(fā)出生缺陷達(dá)90萬例，先天性聽力障礙約3.5萬例，聽力語言殘疾者達(dá)2780萬以上，并以每年新生2-3萬聾兒快速增長(zhǎng)。絕大部分遺傳性耳聾為非綜合征性耳聾，不伴隨其他系統(tǒng)疾病。遺傳性耳聾主要有隱性、顯性、伴性染色體遺傳和線粒體母系遺傳四種遺傳方式。目前已發(fā)現(xiàn)近300個(gè)耳聾疾病相關(guān)基因。在我國(guó)，常見的耳聾相關(guān)基因及突變熱點(diǎn)包括GJB2、(35delG、176del16bP、235delC及299-300delAT)，GJB3(538C>T及547G>A)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)和線粒體DNA12SrRNA(A1555G)。傳統(tǒng)耳聾基因研究主要采用定位克隆技術(shù)，集中在候選基因克隆和位置候選基因克隆，但流程復(fù)雜效率不高。Sanger測(cè)序是臨床分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是檢測(cè)效率低、成本高，傳統(tǒng)的酶切、雜交、TaqMan探針、DHPLC和HRM等方法針對(duì)突變熱點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，但檢測(cè)通量較低。近幾年微陣列芯片技術(shù)的發(fā)展可以同時(shí)針對(duì)數(shù)百個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行高通量檢測(cè)，極大提高了診斷效率，降低了檢測(cè)成本。但微陣列芯片技術(shù)存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本相對(duì)較高，對(duì)除點(diǎn)突變之外的其他突變類型的檢出能力有限的缺點(diǎn)。以上策略均不適于大量的耳聾散發(fā)病例和小家系的研究，特別是對(duì)一些罕見的綜合征型耳聾。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的其中一個(gè)目的是提供基于靶向新一代測(cè)序的耳聾基因檢測(cè)集合，較為全面的展現(xiàn)了與聾病相關(guān)的基因及位點(diǎn)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供高通量、檢測(cè)成本低、檢測(cè)區(qū)域大、適用范圍廣的基于靶向新一代測(cè)序的耳聾基因檢測(cè)方法，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供基于靶向新一代測(cè)序的耳聾基因檢測(cè)試劑盒。技術(shù)方案：一種基于靶向新一代測(cè)序的耳聾基因檢測(cè)集合，包括：人聾病的基因及位點(diǎn)，其中，所述聾病的基因包括ACSL4、ACTB、ACTG1、ADCY1、ADD1、AGAP1、AIFM1、ALDH7A1、ALMS1、ALX3、AQP1、AQP2、AQP3、ATP2B2、ATP6V0A4、ATP6V1B1、ATP6V1B2、BAI1、BCS1L、BSND、CABP2、CACNA1D、CAMSAP3、CATSPER2、CCDC50、CDH23、CEACAM16、CEMIP、CHD7、CIB2、CISD2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL11A1、COL11A2、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL9A1、COL9A2、COL9A3、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIABLO、DIAPH1、DIAPH3、DLX5、DNMT1、DSPP、ECE1、ECM1、EDN3、EDNRA、EDNRB、ELMOD3、EPS8、ERCC2、ERCC3、ESPN、ESRRB、ESRRG、EYA1、EYA4、FAM107B、FAM65B、FAS、FBXO33、FCGR2A、FCGR3A、FGF3、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLNA、FOXI1、FOXO3、FREM1、FXN、GATA3、GIPC3、GJA1、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJC3、GLI3、GPR152、GPR98、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSTP1、HAL、HARS、HARS2、HCFC1、HGF、HLA-DRB1、HMX1、HOXA1、HOXA2、HSD17B4、HSPA1A、IGF1、IL13、IL1A、ILDR1、JAG1、KARS、KCNE1、KCNE3、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KLC2、KLHL18、KRT9、LAMA3、LARS2、LHFPL5、LHX3、LOXHD1、LRIG1、LRP2、LRTOMT、MARVELD2、MASP1、MCPH1、MIR96、MITF、MKRN2、MPZ、MSRB3、MTAP、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO1C、MYO1F、MYO3A、MYO6、MYO7A、NDP、NDRG1、NF2、NOS1、NOS2、NR2F1、OCM、OPA1、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、OTOR、P2RX2、PABPN1、PAN3、PARP1、PAX2、PAX3、PAX9、PCDH15、PCDH9、PDSS1、PDZD7、PEPD、PEX3、PEX6、PHEX、PHF20、PMP22、PNPT1、POLR1C、POLR1D、POU3F4、POU4F3、PROK2、PROKR2、PRPS1、PRRX1、PTPN22、PTPRQ、RDX、RPGR、SALL1、SALL4、SCARF2、SEC23A、SEMA3E、SERAC1、SERPINB6、SETD5、SIX1、SIX2、SIX5、SLC12A1、SLC17A8、SLC19A2、SLC25A21、SLC26A4、SLC26A5、SLC4A11、SLITRK6、SMAD4、SMPX、SNAI2、SOBP、SOX10、SOX2、SOX9、SPINK5、SPNS2、SRSF7、STRC、SYNE4、TBC1D24、TBL1X、TCF21、TCOF1、TECTA、TFCP2、TIMM8A、TJP2、TMC1、TMEM126A、TMIE、TMPRSS3、TMPRSS5、TNC、TNFRSF11B、TPRN、TRAM2、TRIOBP、TRMU、TSHZ1、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、WBP2、WFS1、YWHAE和ZCCHC14；所述位點(diǎn)如下表所示：申請(qǐng)人經(jīng)過在OMIM、Clinvar、TheHereditaryHearinglossHomepage、DVD等數(shù)據(jù)庫(kù)中收集與整理，并參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)聯(lián)合分子病理學(xué)學(xué)會(huì)(AMP)發(fā)布的基因變異的解讀標(biāo)準(zhǔn)及指導(dǎo)原則篩選出致病和可能致病的位點(diǎn)和基因。基因：只要該基因的突變能導(dǎo)致耳聾的發(fā)生(致病和可能致病)；線粒體：考慮到線粒體基因的突變能導(dǎo)致聾病，加之部分位點(diǎn)的突變能否導(dǎo)致聾病尚未有確切的答案，所以把所有線粒體序列都包含進(jìn)去。非CDS：部分能導(dǎo)致或可能導(dǎo)致耳聾發(fā)生的位點(diǎn)不在以上所述位置，將這類位點(diǎn)單獨(dú)列出來。另外申請(qǐng)人還進(jìn)行了大量的耳聾相關(guān)樣本收集、測(cè)序和數(shù)據(jù)篩選，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)篩選和實(shí)際樣本檢測(cè)篩選，申請(qǐng)人獲得了上述基因和位點(diǎn)，上述核基因共計(jì)258個(gè)，位點(diǎn)包括81個(gè)核的非CDS區(qū)域以及全線粒體組，能夠較為全面的展現(xiàn)與聾病相關(guān)的基因與位點(diǎn)，這些基因和位點(diǎn)也是目前耳聾相關(guān)疾病涵蓋面最廣的、適用人群最廣的panel。上述具體的基因和位點(diǎn)可以在文獻(xiàn)或者本領(lǐng)域通用數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢。本發(fā)明還公開了一種用于疾病或非疾病診斷目的的基于靶向新一代測(cè)序的耳聾基因檢測(cè)方法，包括：(1)針對(duì)所述的部分或全部的聾病的基因及位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物；(2)以待測(cè)樣本的DNA為模板，利用所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建耳聾檢測(cè)基因文庫(kù)；(3)根據(jù)所述的耳聾檢測(cè)基因文庫(kù)建立測(cè)序模板，進(jìn)行高通量測(cè)序，分析測(cè)序數(shù)據(jù)信息。步驟(1)中，“部分”的含義為：所述的耳聾基因檢測(cè)集合(panel)中的所有基因或位點(diǎn)可以自由組合，如可以是任意的2個(gè)、3個(gè)、30個(gè)、150-339個(gè)、200-339個(gè)、250-339個(gè)、300-339個(gè)等等自由組合，至于選擇哪些基因和位點(diǎn)可以根據(jù)自己的需求(如耳聾的表型或用途)進(jìn)行設(shè)置，例如篩選藥物致聾的時(shí)候可以選擇線粒體的12SrRNA，篩選大前庭水管綜合癥可以選擇SLC26A4、FOXI1、KCNJ10等。同時(shí)選擇基因或位點(diǎn)時(shí)也可兼顧基于高通量測(cè)序的成本和速度等。當(dāng)選擇全部的基因和位點(diǎn)時(shí)可以較為全面的進(jìn)行檢測(cè)?；跍y(cè)序方法設(shè)計(jì)引物時(shí)，一對(duì)引物的擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度通常為150-275bp，因此對(duì)某一基因或位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物時(shí)可能需要多對(duì)引物。對(duì)于引物設(shè)計(jì)的擴(kuò)增區(qū)域選擇原則為：針對(duì)基因設(shè)計(jì)引物時(shí)，所有引物對(duì)擴(kuò)增區(qū)域應(yīng)覆蓋基因的所有外顯子序列、外顯子上游5bp內(nèi)的序列。針對(duì)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物時(shí)，所有引物對(duì)擴(kuò)增區(qū)域應(yīng)覆蓋上述位點(diǎn)序列。對(duì)于上述擴(kuò)增區(qū)域，可采用一般通用的引物設(shè)計(jì)原則利用常用引物設(shè)計(jì)軟件如primer、Oligo、在線軟件等進(jìn)行設(shè)計(jì)。步驟(2)中，PCR擴(kuò)增時(shí)，10μL體系中，DNA模板的加入量為10～100ng，優(yōu)選為20～50ng，更優(yōu)選為30～40ng。所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?9℃酶活化2min；99℃變性15s，60℃退火與延伸16min，15個(gè)循環(huán)；10℃持續(xù)結(jié)束。通過提高DNA的量、延遲反應(yīng)的時(shí)間增加擴(kuò)增的均一性。耳聾檢測(cè)基因文庫(kù)的構(gòu)建步驟包括：1)引物的消化：將PCR擴(kuò)增后的反應(yīng)液加入消化試劑進(jìn)行消化反應(yīng)；2)加接頭：消化后的產(chǎn)物連接接頭，加接頭結(jié)束后純化得到文庫(kù)。所述的消化試劑為FuPa試劑。所述的接頭為P1接頭和barcode接頭。連接接頭時(shí)，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)條件為：22℃，30min；68℃，5min；72℃，5min；10℃，不超過60min。純化后的文庫(kù)可根據(jù)實(shí)際需要選擇是否需要進(jìn)行擴(kuò)增。構(gòu)建基因文庫(kù)可采用市售試劑盒，測(cè)序模板的制備可采用測(cè)序儀配套的試劑及使用說明進(jìn)行。測(cè)序儀可以采用DA8600測(cè)序儀。測(cè)序技術(shù)后，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析即可獲得耳聾相關(guān)基因變異信息。本發(fā)明所述待檢測(cè)樣本為血液、干血斑或羊水。本發(fā)明還提供了所述的基于靶向新一代測(cè)序的耳聾基因檢測(cè)試劑盒，包括：引物：針對(duì)所述的部分或全部的耳聾病的基因及位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，用于對(duì)待檢測(cè)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增試劑，用于對(duì)待檢測(cè)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；文庫(kù)構(gòu)建試劑，用于對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建；測(cè)序試劑，用于對(duì)文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序模板的制備和上機(jī)測(cè)序。其中關(guān)于引物，可以采用關(guān)于上述測(cè)序方法中關(guān)于步驟(1)論述的內(nèi)容進(jìn)行基因及位點(diǎn)的選擇以及引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增試劑、文庫(kù)構(gòu)建試劑以及測(cè)序試劑可采用市售的相關(guān)試劑即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所提供的基因集合能夠較為全面的展現(xiàn)與聾病相關(guān)的基因與位點(diǎn)，是目前耳聾相關(guān)疾病涵蓋面最廣的、適用人群最廣的panel。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn)：1.通量高：不僅能夠檢出現(xiàn)有已知突變，還能夠檢出新發(fā)突變類型等優(yōu)點(diǎn)。2.檢測(cè)區(qū)域大：能在短時(shí)間內(nèi)完成大量目的區(qū)域的測(cè)序和分析，對(duì)于耳聾相關(guān)的幾百個(gè)基因的全部外顯子和調(diào)控區(qū)有可能發(fā)生致病突變的位置進(jìn)行相關(guān)測(cè)序和分析，含SNP、indel、CNV等。3.平均成本低、速度快：通過本方法均能一次性全面檢測(cè)耳聾相關(guān)基因的所有變異情況，而且平均每個(gè)基因全外顯子檢測(cè)成本低于10元。4.適用范圍廣：從適用人群來看，不僅僅滿足患者的檢測(cè)需求，還能滿足疑似患者和正常人的檢測(cè)需求；從樣本類型上看，可以有多種選擇，如足跟血、全血、羊水等；從功能上看，能為受檢者提供干預(yù)指導(dǎo)，包括耳聾防治的婚前指導(dǎo)、耳聾相關(guān)用藥指導(dǎo)、早期干預(yù)與防治等。附圖說明圖1為靶向高通量測(cè)序檢測(cè)流程圖；圖2為基因靶向捕獲數(shù)據(jù)分析流程。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法主要包括檢測(cè)遺傳性耳聾的目的基因的確定和檢測(cè)方法的開發(fā)。(1)遺傳性耳聾目的基因的確定耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，通常分為非綜合征型遺傳性耳聾和綜合征型遺傳性耳聾。目前已發(fā)現(xiàn)近300個(gè)耳聾疾病相關(guān)基因，截止2015年11月，本研究通過在OMIM、Clinvar、TheHereditaryHearinglossHomepage、DVD等數(shù)據(jù)庫(kù)中收集，并自主進(jìn)行大量樣本收集、測(cè)序和數(shù)據(jù)篩選，匯總所有與人的耳聾相關(guān)的基因，匯總結(jié)果包括258個(gè)基因和81個(gè)非CDS區(qū)域，以及全線粒體組。上述258個(gè)基因?yàn)椋篈CSL4、ACTB、ACTG1、ADCY1、ADD1、AGAP1、AIFM1、ALDH7A1、ALMS1、ALX3、AQP1、AQP2、AQP3、ATP2B2、ATP6V0A4、ATP6V1B1、ATP6V1B2、BAI1、BCS1L、BSND、CABP2、CACNA1D、CAMSAP3、CATSPER2、CCDC50、CDH23、CEACAM16、CEMIP、CHD7、CIB2、CISD2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL11A1、COL11A2、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL9A1、COL9A2、COL9A3、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIABLO、DIAPH1、DIAPH3、DLX5、DNMT1、DSPP、ECE1、ECM1、EDN3、EDNRA、EDNRB、ELMOD3、EPS8、ERCC2、ERCC3、ESPN、ESRRB、ESRRG、EYA1、EYA4、FAM107B、FAM65B、FAS、FBXO33、FCGR2A、FCGR3A、FGF3、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLNA、FOXI1、FOXO3、FREM1、FXN、GATA3、GIPC3、GJA1、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJC3、GLI3、GPR152、GPR98、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSTP1、HAL、HARS、HARS2、HCFC1、HGF、HLA-DRB1、HMX1、HOXA1、HOXA2、HSD17B4、HSPA1A、IGF1、IL13、IL1A、ILDR1、JAG1、KARS、KCNE1、KCNE3、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KLC2、KLHL18、KRT9、LAMA3、LARS2、LHFPL5、LHX3、LOXHD1、LRIG1、LRP2、LRTOMT、MARVELD2、MASP1、MCPH1、MIR96、MITF、MKRN2、MPZ、MSRB3、MTAP、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO1C、MYO1F、MYO3A、MYO6、MYO7A、NDP、NDRG1、NF2、NOS1、NOS2、NR2F1、OCM、OPA1、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、OTOR、P2RX2、PABPN1、PAN3、PARP1、PAX2、PAX3、PAX9、PCDH15、PCDH9、PDSS1、PDZD7、PEPD、PEX3、PEX6、PHEX、PHF20、PMP22、PNPT1、POLR1C、POLR1D、POU3F4、POU4F3、PROK2、PROKR2、PRPS1、PRRX1、PTPN22、PTPRQ、RDX、RPGR、SALL1、SALL4、SCARF2、SEC23A、SEMA3E、SERAC1、SERPINB6、SETD5、SIX1、SIX2、SIX5、SLC12A1、SLC17A8、SLC19A2、SLC25A21、SLC26A4、SLC26A5、SLC4A11、SLITRK6、SMAD4、SMPX、SNAI2、SOBP、SOX10、SOX2、SOX9、SPINK5、SPNS2、SRSF7、STRC、SYNE4、TBC1D24、TBL1X、TCF21、TCOF1、TECTA、TFCP2、TIMM8A、TJP2、TMC1、TMEM126A、TMIE、TMPRSS3、TMPRSS5、TNC、TNFRSF11B、TPRN、TRAM2、TRIOBP、TRMU、TSHZ1、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、WBP2、WFS1、YWHAE、ZCCHC14。上述81個(gè)非CDS區(qū)域和全線粒體組位置如表1。表181個(gè)非CDS區(qū)域和線粒體位置該方法能夠檢測(cè)出258個(gè)基因和81個(gè)非CDS區(qū)域以及全線粒體組的突變情況及具體突變類型(含SNP、indel、CNV等)，并針對(duì)這些基因的外顯子、外顯子上游5bp以及非CDS區(qū)域和全線粒體組進(jìn)行多重PCR的引物設(shè)計(jì)，總共6140對(duì)引物，這六千多對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋上述258個(gè)基因的所有外顯子序列、外顯子上游5bp內(nèi)序列(即外顯子上游第1～5bp范圍)，以及覆蓋上述81個(gè)非CDS區(qū)域和線粒體序列，每對(duì)引物的擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度通常為150-275bp，對(duì)于上述確定的擴(kuò)增區(qū)域，可采用一般通用的引物設(shè)計(jì)原則利用常用引物設(shè)計(jì)軟件如primer、Oligo、在線軟件等進(jìn)行設(shè)計(jì)。序列表中列舉了部分引物，其他引物不再一一列舉，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述引物設(shè)計(jì)的指導(dǎo)可以自主設(shè)計(jì)，并不影響本發(fā)明的實(shí)施。申請(qǐng)人將將這些引物分在不同的管內(nèi)，標(biāo)記為DGPPrimerPool1和DGPPrimerPool2。也可以組合識(shí)別，即選擇在上述基因、非CDS區(qū)域和線粒體中任意組合，將所選擇的基因?qū)?yīng)的引物混合即可檢測(cè)以下含有的目的區(qū)域。(2)檢測(cè)方法的開發(fā)基本流程如圖2所示，首先需要將接受的樣本中進(jìn)行全基因組DNA的提取，并將檢測(cè)合格的DNA進(jìn)行多重PCR，然后再進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，文庫(kù)的構(gòu)建包括引物的消化、加接頭、文庫(kù)擴(kuò)增(此步驟也可以省略)，再通過qPCR或者qubit質(zhì)檢，質(zhì)檢通過則進(jìn)行乳液PCR，再進(jìn)行ES富集，之后再進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序下機(jī)的數(shù)據(jù)通過質(zhì)檢，則進(jìn)行生物信息分析，生物信息的過程見圖2。得到的突變位點(diǎn)進(jìn)一步進(jìn)行sanger驗(yàn)證，驗(yàn)證之后即可進(jìn)行報(bào)告的發(fā)放和對(duì)受檢者進(jìn)行遺傳咨詢。為了更加清楚明白的表達(dá)本方法的目的、技術(shù)方案，以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本方法做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1外周血耳聾相關(guān)基因檢測(cè)1.樣本先天性聽力損失患者的外周血樣本，對(duì)其進(jìn)行基因檢測(cè)，檢測(cè)致病突變。2.基因組核酸抽提離心柱法抽提血液樣本的基因組DNA，采用核酸純化試劑純化基因組DNA。采用Qubit2.0熒光計(jì)檢測(cè)所提取核酸質(zhì)量。3.多重PCR多重PCR及“4.耳聾檢測(cè)基因文庫(kù)構(gòu)建”采用市售的多重PCR文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，本實(shí)施例采用的試劑盒品牌為life，名稱為IonAmpliSeqTMLibraryKit2.0-96LV，貨號(hào)為4480441。但試劑盒并不僅限于此。按表2配制PCR反應(yīng)體系，按表3程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。表2基因組DNA目標(biāo)區(qū)域PCR擴(kuò)增體系表3基因組DNA目標(biāo)區(qū)域PCR擴(kuò)增程序4.耳聾檢測(cè)基因文庫(kù)構(gòu)建4.1部分消化引物序列上述擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)液中加入1μLFuPa試劑，按表4程序進(jìn)行消化反應(yīng)。表4部分消化引物序列反應(yīng)程序溫度時(shí)間50℃10min55℃10min60℃20min10℃持續(xù)(最長(zhǎng)1h)4.2連接接頭按表5配置連接反應(yīng)，按表6在PCR儀上運(yùn)行連接反應(yīng)。表5接頭連接反應(yīng)體系表6接頭連接反應(yīng)過程溫度時(shí)間22℃30min68℃5min72℃5min10℃持續(xù)(不超過1h)4.3純化核酸純化試劑(磁珠法)純化上述文庫(kù)。需要說明的是：上述核酸純化試劑應(yīng)于室溫平衡30min并充分振蕩將磁珠混勻，使用時(shí)緩慢吸取。70％乙醇需要新鮮配置。4.4擴(kuò)增文庫(kù)(選擇性的做)(1)上述含有文庫(kù)的磁珠中加入25μL文庫(kù)擴(kuò)增混合液和1μL的文庫(kù)擴(kuò)增引物混合液。置于磁力架，靜置2min，轉(zhuǎn)移至PCR管中。按表7進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。表7擴(kuò)增文庫(kù)反應(yīng)過程(2)文庫(kù)的純化使用核酸純化試劑純化上述擴(kuò)增后文庫(kù)。最后加入25μLlowTE緩沖液充分洗滌磁珠，混勻。室溫靜置5min。置于磁力架上，靜置2分鐘或待溶液變清澈。移上清至新離心管。4.5文庫(kù)的定量qubit2.0熒光計(jì)檢測(cè)上述文庫(kù)質(zhì)量。文庫(kù)濃度低于0.2ng/μL為不合格，需要重建庫(kù)。若用qPCR對(duì)上述文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)，文庫(kù)濃度不低于100pM。5.高通量測(cè)序模板制備(乳液PCR和ES富集)高通量測(cè)序模板制備操作流程參考DA8600測(cè)序儀配套的試劑及使用說明。6.高通量測(cè)序高通量測(cè)序使用DA8600測(cè)序儀，按照測(cè)序儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。7.信息分析7.1原始數(shù)據(jù)的分析從測(cè)序儀獲取原始數(shù)據(jù)(FASTQ數(shù)據(jù))，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，把trimscore小于13的數(shù)據(jù)去除。再參考hg19，運(yùn)用但不僅限于SOAP軟件對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)，再運(yùn)用但不僅限于GATK軟件包進(jìn)行序列的校正。再運(yùn)用variantCaller進(jìn)行SNP、indel、CNV等突變分析，生成一個(gè)vcf文件。7.2結(jié)果過濾將上一步驟中篩選出來的突變信息(vcf文件)進(jìn)行篩選。篩選內(nèi)容包括reads小于5的片段去除。再主要參考ExAC、Clinvar、1000Genomes、DVD等數(shù)據(jù)庫(kù)，將數(shù)據(jù)分成三類：I對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)里已有報(bào)道致病的突變直接按照ACMG(美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì))的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，II未標(biāo)注的突變需要進(jìn)一步除去高頻(等位基因頻率大于1％)的突變，III把未知突變中的稀有突變(MAF(最小等位基因頻率)小于1％)的進(jìn)行下一步分析。7.3基因篩選將上一步驟中的III類數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行假陽性估計(jì)和過濾，再運(yùn)用Annovar軟件包進(jìn)行突變位點(diǎn)的注釋，再和I類數(shù)據(jù)一起按照ACMG的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，并結(jié)合臨床信息和家系信息挑選位點(diǎn)。7.sanger驗(yàn)證根據(jù)上一步驟中篩選出的位點(diǎn)，運(yùn)用PrimerPremier5或者Primer-BLAST等軟件進(jìn)行對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)并對(duì)樣本進(jìn)行PCR。Sanger測(cè)序參考3730xl等測(cè)序儀及試劑進(jìn)行。8.結(jié)果分析測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表8，檢出的候選突變信息如表9。表8：測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表目標(biāo)區(qū)長(zhǎng)度(bp)730.05kb目標(biāo)區(qū)覆蓋度99.6％數(shù)據(jù)產(chǎn)量8Mreads捕獲特異性100％目標(biāo)區(qū)平均深度1139均一性88％總變異位點(diǎn)數(shù)1337變異分?jǐn)?shù)0.1％目的區(qū)SNP數(shù)1258INDEL數(shù)62內(nèi)含子突變數(shù)763外顯子突變數(shù)507致病位點(diǎn)數(shù)2Splicing位點(diǎn)數(shù)5表9：檢出的候選突變信息表當(dāng)前第1頁1 2 3