本發(fā)明屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種文竹中期染色體的熒光原位雜交方法。

背景技術(shù)：

文竹，又名云片松、刺天冬、云竹，是百合科天門冬屬多年生草質(zhì)藤本植物。文竹葉片輕柔，竹形優(yōu)雅，常年翠綠，是著名的室內(nèi)盆花，也是小型盆景和切花的優(yōu)良襯葉材料，具有極高的觀賞價(jià)值。其根可入藥，可治急性氣管炎，具有潤(rùn)肺止咳的功能。對(duì)文竹的研究目前主要集中在栽培技術(shù)等方面，對(duì)其細(xì)胞學(xué)的研究相對(duì)滯后，這主要是由于文竹的種子發(fā)芽比較困難，葉片呈針狀，而莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)也較難于取材，很難獲得理想的制備玻片標(biāo)本的材料，且其細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞壁較堅(jiān)硬，處理細(xì)胞比較困難，染色體較小，很難獲得形態(tài)清晰、分散良好的分裂相。因此，適合于文竹的染色體玻片標(biāo)本制備和高分辨率的核型分析技術(shù)有待開發(fā)。

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization, FISH）是根據(jù)核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將經(jīng)過標(biāo)記的外源核酸（探針）直觀的定位到染色體或染色質(zhì)上的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法。該技術(shù)是20世紀(jì)70年代末80年代初在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。與原有的放射性原位雜交技術(shù)相比，該技術(shù)具有安全性高、操作簡(jiǎn)便快速、穩(wěn)定性和可重復(fù)性強(qiáng)、同一張玻片可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)探針等優(yōu)點(diǎn)。目前，該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物理圖譜構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)及定位、異源染色質(zhì)鑒定、染色體畸變檢測(cè)、基因組結(jié)構(gòu)解析和物種親緣關(guān)系和進(jìn)化分析等方面。但是，在FISH技術(shù)操作過程中，染色體玻片標(biāo)本質(zhì)量、探針標(biāo)記的方法和效率、探針和染色體共變性的溫度和時(shí)間均影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如染色體玻片標(biāo)本的質(zhì)量是FISH能否雜交成功的關(guān)鍵因素之一，酶解不足或過度都會(huì)導(dǎo)致染色體制片的失??；玻片細(xì)胞質(zhì)太濃，探針不容易雜交且會(huì)造成高背景；預(yù)處理是否合適決定著染色體長(zhǎng)度是否適中，是否有利于雜交。探針標(biāo)記的方法不同，也會(huì)相應(yīng)的影響雜交結(jié)果。探針和染色體共變性的溫度和時(shí)間也是重要的因素，如果共變性溫度低或時(shí)間短，雙鏈沒有完全打開，不會(huì)雜交出特異信號(hào)，而共變性溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致染色體膨脹變形，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不正常。FISH技術(shù)已在很多植物上運(yùn)用成功，但是，目前還未見在文竹中熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，穩(wěn)定性和重復(fù)性高的文竹中期染色體的熒光原位雜交方法，該方法觀察到的文竹中期染色體的形態(tài)完好，信號(hào)清晰。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案，一種文竹中期染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于：以文竹中期染色體作為靶DNA，以玉米45S rDNA或/和5S rDNA為探針進(jìn)行文竹染色體熒光原位雜交。

本發(fā)明所述的文竹中期染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于具體步驟為：

（1）染色體玻片標(biāo)本的制備，將盆栽文竹控水三天，然后澆水，在澆水的第二天早上9:00-10:00取根尖，用N₂O處理2h后，體積百分?jǐn)?shù)為90%的乙酸冰上固定10min，固定后用去離子水冰上水洗10min，然后切取根尖分生組織區(qū)，置于質(zhì)量體積百分比分別為1%果膠酶和2%纖維素酶的混合液中于37℃酶解2h，酶解完成后用體積百分?jǐn)?shù)為70%的乙醇清洗根尖兩次，然后在40μL乙醇中用解剖針搗碎根尖，渦旋懸浮細(xì)胞，離心保留沉淀并加入30μL無水乙酸，混勻后吸取5-8μL滴片，室溫放置5min后進(jìn)行鏡檢，鏡檢良好的玻片放紫外交聯(lián)儀中經(jīng)過120-125mJ/cm²處理2min固定染色體得到染色體玻片標(biāo)本備用；

（2）玉米45S rDNA或/和5S rDNA探針標(biāo)記，將下列各組分在冰上分別加入離心管，玉米45S rDNA或/和5S rDNA 2μg、10×nick translation buffer 2μL、Labeled-dNTP 0.5μL、Non-labeled-dNTPs 2μL、DNA polymerase I 5μL和DNaseI 0.5μL，再用去離子水補(bǔ)至20μL，混合均勻后在PCR儀中于15℃處理2h，加入質(zhì)量濃度為140ng/μL鮭精DNA 175μL，再加入體積百分?jǐn)?shù)為90%的乙醇450μL和摩爾濃度為3mol/L的乙酸鈉50μL，混合均勻后沉淀探針2h以上，然后置于離心機(jī)中于13000rpm的離心速率離心處理30min，再用乙醇清洗兩遍，將沉淀的探針室溫避光30min進(jìn)行干燥；

（3）雜交與雜交后洗脫，在0.5μL步驟（2）得到的標(biāo)記探針中加入20μL 2×SSC 1×TE得到探針溶液，在步驟（1）得到的染色體玻片標(biāo)本上有細(xì)胞的地方加上探針溶液，蓋上塑料蓋玻片，再將染色體玻片標(biāo)本置于鋪有濕潤(rùn)紙巾的金屬容器中，沸水浴處理5min，然后將染色體玻片標(biāo)本放入雜交盒中于55℃雜交3h以上，再將染色體玻片標(biāo)本取出放入2×SSC中5min，除去塑料蓋玻片；

（4）信號(hào)檢測(cè)，在步驟（3）處理后的染色體玻片標(biāo)本上加20μL含抗淬滅劑的DAPI熒光染液染色10min，蓋上長(zhǎng)蓋片進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，用先控水再澆水的方法處理文竹，可使文竹根尖分生組織分裂活動(dòng)旺盛，有利于獲得大量中期分裂相；

（2）本發(fā)明采用N₂O預(yù)處理文竹根尖，并采用酶解滴片法制備中期染色體玻片標(biāo)本，可有助于去除細(xì)胞質(zhì)背景，使染色體分散良好，且方法簡(jiǎn)單，不需要加蓋片去蓋片等繁復(fù)的步驟，無污染；

（3）本發(fā)明探針制備采用缺口平移法將熒光素直接標(biāo)記到探針上，標(biāo)記效率高，且在后續(xù)的原位雜交過程中不需要加抗體可直接檢測(cè)，可提高雜交特異性；

（4）在探針和染色體共變性時(shí)采用沸水浴進(jìn)行變性，確立了合適的時(shí)間，并在共變性結(jié)束后直接進(jìn)行雜交，無需冷卻，操作簡(jiǎn)便無污染，且得到的文竹染色體形態(tài)完好，變性完全，信號(hào)點(diǎn)清晰，數(shù)目穩(wěn)定；

（5）本發(fā)明采用55℃高溫復(fù)性雜交，雜交后洗脫采用短時(shí)2×SSC室溫洗脫，提高特異性的同時(shí)，操作簡(jiǎn)單且省時(shí)；

（6）本發(fā)明整個(gè)操作步驟簡(jiǎn)單，節(jié)約了大量時(shí)間，便于快速的獲得探針在文竹染色體上的定位信息；

（7）本發(fā)明清楚地顯示了文竹的染色體，熒光信號(hào)清晰，雜交特異性高，確立了適合文竹的中期染色體制備和FISH方法；

（8）本發(fā)明將玉米45S rDNA和5S rDNA探針清晰的定位在了文竹中期染色體上，可分辨同源染色體和非同源染色體，有助于核型分析，對(duì)于文竹染色體物理圖譜構(gòu)建、遺傳育種、染色體鑒定和結(jié)構(gòu)研究，以及天門冬屬植物的進(jìn)化研究等具有重要的理論和實(shí)踐意義。

附圖說明

圖1為45S rDNA在文竹中期染色體上信號(hào)位點(diǎn)分布圖像（A為DAPI復(fù)染的染色體，B為Alexa Fluor-488熒光素標(biāo)記的45S rDNA的信號(hào)位點(diǎn)，C為合成圖）；

圖2為5S rDNA在文竹中期染色體上信號(hào)位點(diǎn)分布圖像（A為DAPI復(fù)染的染色體，B為Texas red熒光素標(biāo)記的5S rDNA的信號(hào)位點(diǎn)，C為合成圖）；

圖3為45S rDNA和5S rDNA同時(shí)在文竹中期染色體上信號(hào)位點(diǎn)分布圖像（A為DAPI復(fù)染的染色體，B為Alexa Fluor-488熒光素標(biāo)記的45S rDNA的信號(hào)，C為Texas red熒光素標(biāo)記的5S rDNA的信號(hào)，D為A、B和C的合成圖）。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

（1）染色體玻片標(biāo)本的制備，將盆栽文竹控水三天，然后澆水，在澆水的第二天早上9:00-10:00取根尖，用N₂O處理2h后，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為90%的乙酸冰上固定10min，固定后用去離子水冰上水洗10min，然后切取根尖分生組織區(qū)，置于質(zhì)量體積百分比分別為1%果膠酶和2%纖維素酶的混合液中于37℃酶解2h，酶解完成后用體積百分?jǐn)?shù)為70%的乙醇清洗根尖兩次，然后在40μL乙醇中用解剖針搗碎根尖，渦旋懸浮細(xì)胞，離心保留沉淀并加入30μL無水乙酸，混勻后吸取5-8μL滴片，室溫放置5min后進(jìn)行鏡檢，鏡檢良好的玻片放紫外交聯(lián)儀中經(jīng)過120-125mJ/cm²處理2min固定染色體得到染色體玻片標(biāo)本備用；

（2）玉米45S rDNA或/和5S rDNA探針標(biāo)記，將下列各組分在冰上分別加入離心管，玉米45S rDNA或/和5S rDNA 2μg、10×nick translation buffer 2μL、Labeled-dNTP 0.5μL、Non-labeled-dNTPs 2μL、DNA polymerase I 5μL和DNaseI 0.5μL，再用去離子水補(bǔ)至20μL，混合均勻后在PCR儀中于15℃處理2h，加入質(zhì)量濃度為140ng/μL鮭精DNA 175μL，再加入體積百分?jǐn)?shù)為90%的乙醇450μL和摩爾濃度為3mol/L的乙酸鈉50μL，混合均勻后沉淀探針2h以上，然后置于離心機(jī)中于13000rpm的離心速率離心處理30min，再用乙醇清洗兩遍，將沉淀的探針室溫避光30min進(jìn)行干燥；

（3）雜交與雜交后洗脫，在0.5μL步驟（2）得到的標(biāo)記探針中加入20μL 2×SSC 1×TE得到探針溶液，在步驟（1）得到的染色體玻片標(biāo)本上有細(xì)胞的地方加上探針溶液，蓋上塑料蓋玻片，再將染色體玻片標(biāo)本置于鋪有濕潤(rùn)紙巾的金屬容器中，沸水浴處理5min，然后將染色體玻片標(biāo)本放入雜交盒中于55℃雜交3h以上，再將染色體玻片標(biāo)本取出放入2×SSC中5min，除去塑料蓋玻片；

（4）在步驟（3）處理后的染色體玻片標(biāo)本上加20μL含抗淬滅劑的DAPI熒光染液染色10min，蓋上長(zhǎng)蓋片（22mm×40mm）進(jìn)行檢測(cè)。用Olympus BX63熒光顯微鏡觀察，CCD拍照，Metamorph軟件進(jìn)行染色體分析，Photoshop進(jìn)行圖像處理，結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示，通過熒光顯微鏡可以觀察到明亮的雜交信號(hào)。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。