本發(fā)明涉及基因工程、細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及一種人lncRNA及其病毒載體在制備抑制真皮成纖維細(xì)胞膠原合成藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：增生性疤痕是指皮膚真皮層受損后的愈合期間，膠原局部過量沉積形成突出于皮膚表面的增殖性疤痕組織。皮膚損傷及外科手術(shù)后，疤痕的總體發(fā)病率為40％～70％，燒傷患者的發(fā)病率高達(dá)91％。增生性疤痕是燒傷外科和整形外科界面臨的巨大挑戰(zhàn)，因其不僅影響美觀，特殊部位的疤痕還會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，給他們帶來生理和心理的雙重壓力。目前，雖然有手術(shù)切除、壓力治療、局部皮質(zhì)激素注射等方法治療疤痕，但是均存在局限性或不良并發(fā)癥，無法從根本上阻止疤痕產(chǎn)生。目前已知增生性疤痕形成的病理學(xué)本質(zhì)是真皮層中細(xì)胞外基質(zhì)的過量沉積，其主要成分是由真皮成纖維細(xì)胞合成的膠原，尤以I、III型膠原為主。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種特異高表達(dá)于真皮成纖維細(xì)胞膠原合成的分離lncRNA及其的引物對(duì)，以及含有前述過表達(dá)lncRNA的病毒載體及宿主細(xì)胞；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供前述lncRNA、病毒載體、宿主細(xì)胞在制備抑制真皮成纖維細(xì)胞膠原合成藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的一種分離的lncRNA，含有如SEQIDNO.1所示的基因序列。所述lncRNA的轉(zhuǎn)錄本核苷酸序列位于人的第7號(hào)染色體上COL1A2基因5’端上游位置，與COL1A2為天然反義(NaturalAntisense)的關(guān)系。增生性疤痕形成的病理學(xué)本質(zhì)是真皮層中細(xì)胞外基質(zhì)的過量沉積，其主要成分是由真皮成纖維細(xì)胞合成的膠原(collagen)，尤以I、III型膠原為主。本發(fā)明是基于增生性疤痕的形成機(jī)制，采用lncRNA芯片(lncRNAArray)技術(shù)篩選獲得特異高表達(dá)于真皮成纖維細(xì)胞膠原合成的人lncRNA。目前沒有關(guān)于該lncRNA相關(guān)的報(bào)道。所述SEQIDNO.1的序列為：CCUGGACCUAGAAACAAAAAAUGAAAGUGGAGAAAACCAAACAAGAAUCUUUCUUUCUUAAAGUAAACAUCGGACUGACAUCUCCUUUCAAACAUUCAUUGAGGAUCUACUCUGUGAGAAGAAGCAAUACCAUGUUAUCUCAUUCUAGUUCCAGUUCUAGUUGACUUGAUUGUCAAACGACUGCUAAGAAGGUGAAAUAGAGGAGAUGACAUGAAUGAGGGACUACAUUGGAAUGAAGAAGAACCUGGAGGAGGUAAAAAAACUGAAGGCUCCGGAUGUCGGACGAUGGAAAAUAAAAACAACAAGCAAGUGAAACUCCCUGACUUAUCAACCUUACUCAAGAAUUCCUUCU本發(fā)明通過構(gòu)建慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體，經(jīng)包裝、感染，來干擾人真皮成纖維細(xì)胞的膠原合成，從而抑制疤痕增生。所述的病毒載體含有前述lncRNA序列。具體地說，先提取人離體增生性疤痕組織的lncRNA，合成cDNA第一鏈，然后設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增所述lncRNA，在反應(yīng)體系中與雙酶切擴(kuò)增序列和載體，建立連接反應(yīng)；然后轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆、抽提質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證。接著轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒，獲取病毒上清液后，過濾凍存。其中，擴(kuò)增所述lncRNA的引物對(duì)分別如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，經(jīng)設(shè)計(jì)分別含有BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)：上游引物：5′-GCCGGATCCCCTGGACCTAGAAACAAAAAATG-3’；下游引物：5′-ACCGAATTCAGAAGGAATTCTTGAGTAAGG-3’，上述劃線區(qū)域即分別指示了BamHI位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn)。經(jīng)PCR獲得的產(chǎn)物切膠進(jìn)一步純化回收，選用Gel/PCRExtractionKit，購(gòu)于Biomiga公司。所述轉(zhuǎn)化步驟之后，37℃孵育培養(yǎng)并挑取陽性克隆，選用德國(guó)QIAGEN公司的PlasmidMiniKit質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。所述慢病毒包裝是在37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(購(gòu)于美國(guó)Sciencell公司)培養(yǎng)病毒包裝細(xì)胞HEK-293T細(xì)胞(該細(xì)胞保藏于美國(guó)ATCC，編號(hào)ATCCACS-4500，購(gòu)于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，并接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80％左右時(shí)，共轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染試劑、表達(dá)/包裝質(zhì)粒按體積比為2.5∶1，慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒按質(zhì)量比為Pcgvp、Rev、Vsvg比例為1.5∶1.5∶1∶0.5。轉(zhuǎn)染收取病毒上清液于0.45μM濾器過濾后，分裝-80℃凍存。其中，所述轉(zhuǎn)染試劑為購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司的LipofectamineTM2000。設(shè)計(jì)試驗(yàn)，利用上述慢病毒感染離體人真皮成纖維細(xì)胞(即宿主細(xì)胞)，感染效率在80％以上時(shí)抽提RNA，RT-PCR鑒定所述lncRNA在人真皮成纖維細(xì)胞中的過表達(dá)。并利用WesternBlot法檢測(cè)過表達(dá)真皮成纖維細(xì)胞的蛋白表達(dá)量。WesternBlot實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述人lncRNA過表達(dá)組的真皮成纖維細(xì)胞中膠原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表達(dá)量顯著降低，表明真皮成纖維細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA可顯著抑制膠原合成量。因此，所述lncRNA及其過表達(dá)的病毒載體可用于制備抑制真皮成纖維細(xì)胞合成膠原的藥物，為抑制疤痕增生提供了新的靶點(diǎn)。附圖說明圖1為本發(fā)明pGLV-H1-GFP/Puro載體圖譜和lncRNA的插入位點(diǎn)；圖2為本發(fā)明lncRNA過表達(dá)慢病毒載體酶切的電泳圖譜；圖3為本發(fā)明lncRNA的測(cè)序鑒定結(jié)果；圖4為本發(fā)明試驗(yàn)例1中人lncRNA過表達(dá)慢病毒感染人真皮成纖維細(xì)胞的RT-PCR鑒定；圖5為本發(fā)明試驗(yàn)例2中Westernblot檢測(cè)膠原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表達(dá)量以及灰度分析結(jié)果；其中，空白：不做任何處理的真皮成纖維細(xì)胞，對(duì)照：pGLV-H1-GFP/Puro空載轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞，lncRNA：pGLV-H1-lncRNA-GFP/Puro過表達(dá)的真皮成纖維細(xì)胞。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。如本文所用，術(shù)語“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需表達(dá)的載體，以及利用現(xiàn)有的質(zhì)粒產(chǎn)品和試劑盒包裝本發(fā)明所述的病毒載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、基因合成技術(shù)、病毒重組技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。實(shí)施例一、試驗(yàn)材料pGLV-H1-GFP/Puro質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪公司，包裝質(zhì)粒Pcgvp、Rev、Vsvg購(gòu)自美國(guó)AlleleBiotech&Pharmaceuticals公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，PCR試劑盒TaKaRaLAPolymeraseHot-StartVersionPCR購(gòu)自日本Takara公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司，全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、WesternBlot檢測(cè)試劑盒、ECL檢測(cè)試劑盒、Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒、預(yù)染蛋白分子量以及麗春紅染色液均購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，顯色液、定影液購(gòu)自中國(guó)無錫市靈琦服務(wù)用品廠。二、IncRNA序列的擴(kuò)增及慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建1.1RNA提取1)取約100mg解凍的人增生性疤痕組織至1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol，勻漿機(jī)勻漿10秒。室溫放置5分鐘。12,000g，室溫離心10min；2)加入氯仿(每使用1mlTRIzol加0.2ml氯仿)，蓋緊離心管管蓋，振蕩器上振蕩15s，溶液呈乳白狀，室溫靜置3min；3)12,000g，4℃離心15min；4)取出離心管，樣品分為三層：無色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機(jī)相；5)小心吸取無色上清水相移至另一離心管，水相體積約為所用Trizol試劑的60％；6)向得到的上清水相加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min；12,000g，4℃離心10min；7)小心去除上清，緩慢沿管壁加入1ml70％的乙醇(用DEPC處理過的水配制)，輕輕混勻；8)12,000g，4℃離心10min；9)小心吸盡上清，室溫干燥沉淀5min左右，適量而定(不可晾得太干，否則RNA將會(huì)很難溶解)，加入30～50μL的無RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。1.2RNA濃度和純度的測(cè)定1)取5μLRNA樣品到595μL1×TEBuffer中，測(cè)定樣品在260nm和280nm的吸收值確定；2)RNA的濃度＝OD260×稀釋倍數(shù)×0.04μg/μL(比色皿光徑1cm)，OD260/280在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度很高。1.3cDNA第一鏈合成(20μL體系)：1)使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；2)取滅過菌且無核酸酶的0.2mlPCR管，依次加入如下組份：RNA(2μg)nμLOligodT(18)(50μM)2μL無核酸酶的雙蒸水至總體積12.5μL3)65℃保溫5min，然后冰浴5min；4)往上步驟中的0.2mlPCR管依次加入如下組份：5)輕輕混勻后，然后2000rpm離心20s；6)先在42℃保溫1h，然后70℃保溫10min，然后置于冰上5min；7)上述產(chǎn)物可立即進(jìn)行下一步的PCR反應(yīng)或-20℃保存。2.1目標(biāo)lncRNA的擴(kuò)增目標(biāo)lncRNA序列如SEQIDNO.1所示，根據(jù)引物設(shè)計(jì)規(guī)則，采用Primer5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增包括lncRNA的序列，并在其上游和下游分別引入BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，上游引物為5′-GCCGGATCCCCTGGACCTAGAAACAAAAAATG-3’，含有BamHI酶切位點(diǎn)；下游引物為5′-ACCGAATTCAGAAGGAATTCTTGAGTAAGG-3’，含有EcoRI酶切位點(diǎn)。目的基因轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度為352bp，其序列如SEQIDNO.2所示。PCR反應(yīng)體系如表1所示：表1lncRNA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃5min；PCR產(chǎn)物切膠純化回收(Gel/PCRExtractionKit，Biomiga)1)按照5μlPCR產(chǎn)物+1μl上樣緩沖液(6×)比例混勻后，在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，在成像儀顯色下，切取352bp的目的條帶于離心管中。2)加入1倍體積的BufferGC，至于55℃水浴中8-10分鐘，至凝膠完全融化。冷卻至室溫。3)轉(zhuǎn)移以上混合液至一帶有收集管的吸附柱中，室溫下，13,000×g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)此步驟，直至剩余液體全部通過吸附柱。4)加入650μlDNAWashBuffer至吸附柱中，室溫下，13,000×g離心30秒，倒掉廢液，重復(fù)此步驟。5)室溫下，13,000×g開蓋離心2分鐘，去除殘余的乙醇。6)轉(zhuǎn)移吸附柱至一新的1.5ml的離心管中，加入30-50μl在60℃預(yù)熱的ddH2O，室溫放置數(shù)分鐘，13,000×g離心1分鐘。2.2PCR產(chǎn)物及載體pGLV-H1-GFP/Puro雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pGLV-H1-GFP/Puro分別按照下述反應(yīng)體系，37℃反應(yīng)1小時(shí)，得到PCR產(chǎn)物目的片段及載體片段。表2擴(kuò)增序列和載體雙酶切體系酶切產(chǎn)物，加入2倍體積BufferGC后，瞬時(shí)離心。其余步驟按照上述切膠純化回收步驟進(jìn)行純化。必要時(shí)進(jìn)行二次酶切。2.3PCR產(chǎn)物及載體pGLV-H1-GFP/Puro連接反應(yīng)按照載體片段和PCR產(chǎn)物目的片段數(shù)目比例為1∶3左右加反應(yīng)體系(見表2)，通常10μl體系，同時(shí)加入1μlT4DNA連接酶及1μlT4DNABuffer，16℃過夜，得到連接產(chǎn)物(pGLV-H1-lncRNA-GFP/Puro)。以不加入目的片段的載體為對(duì)照。表3擴(kuò)增序列和載體的連接反應(yīng)體系2.4轉(zhuǎn)化(無菌操作)1)從-80℃冰箱取出TOP10感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，冰上融化，每200μl感受態(tài)細(xì)菌加入2-4μl連接產(chǎn)物，輕輕扣擊管壁混勻細(xì)菌。2)冰上30min，42℃熱休克90sec，然后迅速放置冰上3min。3)加入500μl預(yù)熱到37℃的LB培養(yǎng)基，37℃200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)90分鐘。然后將菌液鋪于含有Ampicillin抗生素(100mg/ml)的LB固體培養(yǎng)板。4)37℃孵育，培養(yǎng)板先正置1h后倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)后挑取克隆或于4℃保存。2.5陽性克隆擴(kuò)增和質(zhì)粒抽提1)取5ml無菌AmpicillinLB液體培養(yǎng)基，加入到無菌的15ml試管中，用無菌移液器槍頭在培養(yǎng)板上隨機(jī)挑選陽性克隆，置于上述試管中，37℃200rpm振蕩孵育過夜。2)室溫下，10,000rpm離心1分鐘，收集菌體，并盡可能棄去上清3)加入250μlBufferA1，渦旋震蕩混勻。4)加入250μlBufferB1，混勻后靜置5分鐘至溶液粘稠而澄清5)加入350μlBufferN1，立即反轉(zhuǎn)多次，至溶液充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。13,000rpm離心10分鐘。6)吸取上清至帶有收集管的DNA吸附柱中，13,000rpm離心1分鐘，棄去收集管中的廢液。7)加入500μlBufferKB，室溫下13,000rpm離心1分鐘，棄去收集管中的廢液。8)加入500μlDNAWashBuffer，13,000rpm離心1分鐘，棄去收集管中的廢液。充分此步驟后，開蓋離心5分鐘。9)向吸附柱中加入50-100μlddH2O。2.6pGLV-H1-lncRNA-GFP/Puro雙酶切驗(yàn)證、測(cè)序及保種按照前述酶切方法(表2)進(jìn)行雙酶切后，1％瓊脂糖凝膠電泳，切開雙條帶及條帶大小與目的條帶大小相符的(約500多bp)，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。同時(shí)取無菌1.5ml離心管并作標(biāo)記，加入0.15ml無菌甘油溶液，分別吸取0.85ml陽性克隆的菌液，加入相應(yīng)標(biāo)記的離心管中，充分混勻，貯存于-80℃保種。構(gòu)建載體及酶切、測(cè)序結(jié)果如圖1所示。3慢病毒包裝在37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒包裝細(xì)胞HEK-293T細(xì)胞(美國(guó)ATCC，購(gòu)于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)。將HEK-293T細(xì)胞按105/ml密度均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80％左右時(shí)，共轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invtrogen公司LipofectamineTM2000)(μl)與表達(dá)和包裝質(zhì)粒總質(zhì)量(μg)比例為2.5∶1，慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒Pcgvp、Rev、Vsvg比例為1.5∶1.5∶1∶0.5(質(zhì)量比)。轉(zhuǎn)染12h換液，24h后使用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，于48h、72h收取細(xì)胞培養(yǎng)液上清(即病毒上清)，0.45μM濾器過濾后，分裝-80℃凍存。構(gòu)建載體及酶切、測(cè)序結(jié)果如圖1、圖2、圖3所示。三、慢病毒感染人真皮成纖維細(xì)胞在37℃、5％CO2孵箱中，培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞，按105/ml密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)60％左右時(shí)，將收集的病毒上清與凝聚胺(polybrene，終濃度5μg/ml)一同加入人真皮成纖維細(xì)胞，24h后換液，48h-72h在熒光顯微鏡通過觀察熒光表達(dá)情況判斷感染效率，80％以上細(xì)胞可見綠色熒光，表明感染效率達(dá)到80％以上(如圖4所示)，72h時(shí)使用RNA抽提試劑盒(TRIzol法)提取細(xì)胞總RNA。試驗(yàn)例1RT-PCR鑒定人IncRNA在人真皮成纖維細(xì)胞中過表達(dá)本試驗(yàn)例基于前述實(shí)施例所獲得的慢病毒載體感染獲得的人真皮成纖維細(xì)胞。分別收集lncRNA慢病毒組(lncRNA過表達(dá)組)及空載對(duì)照組的人真皮成纖維細(xì)胞，使用RNA抽提試劑盒(TRIzol法)抽提總RNA，Nanodrop2.0檢測(cè)RNA濃度，定量150ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)一步使用相應(yīng)引物檢測(cè)人lncRNA表達(dá)。RealtimePCR反應(yīng)體系為：2XSybrMix10μl，cDNA1μl，引物1μl，雙蒸水8μl，共20μl，在ABI7500運(yùn)行，條件為：預(yù)變性95℃10min后，95℃15s，60℃1min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。用ΔΔCT法計(jì)算人lncRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖4所示。試驗(yàn)例2Westernblot法檢測(cè)蛋白表達(dá)含量將人lncRNA過表達(dá)的真皮成纖維細(xì)胞、空載對(duì)照細(xì)胞、空白處理細(xì)胞培養(yǎng)在10cm培養(yǎng)皿里。待細(xì)胞長(zhǎng)滿，進(jìn)行如下操作：全蛋白的提取將細(xì)胞用胰酶消化后，于冷PBS中洗滌2遍，各加入200ul冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30min，每隔5min渦旋震蕩10s，充分裂解。離心：4℃，13000×g，10min。將上清分裝，保存于-70℃，避免反復(fù)凍融。蛋白定量1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的配置：牛血清白蛋白(BSA)50mg，加雙蒸水至50ml，終濃度為1μg/1μl2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：BSA(1mg/mL)(μL)0246810雙蒸水(μL)1086420染液(μL)990990990990990990A(595nm)00.0890.1980.2830.3790.4513.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：A＝0.0459C+0.004R2＝0.9974.取待測(cè)蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭G250染液990ml，混勻，測(cè)定595nmOD值，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求所得濃度。SDS-PAGE電泳取干凈的Bio-Rad1.5～玻璃板，按說明書在制膠架上裝好；根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分離膠(即下層膠)；小心用槍頭將分離膠注入玻璃板間隙中，大約在占三分之二玻璃板高度處停止，爾后在上面加入幾毫升雙蒸水，目的是阻止空氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。分離膠聚合完成后，倒掉膠上面覆蓋的雙蒸水，用濾紙盡量吸凈殘存的液體，小心不要碰到分離膠。表4聚丙烯酰胺分離膠配方按照表4配制SDS-PAGE的濃縮膠并注入分離膠的上端，小心插入與玻璃板厚度相適應(yīng)的樣品梳子，避免產(chǎn)生氣泡：表5配置不同體積SDS-PAGE濃縮膠的組分表成層膠聚合后，小心拔去樣品梳子，然后加入lxTris-Gly的電泳緩沖液。吸取適量樣品上清加入樣品孔中，在樣品旁的孔中加入預(yù)染的蛋白Marker，未添加樣品上清的孔中，加入lxSDS上樣緩沖液保持膠面平衡。打開電源，電壓開始設(shè)置為60V，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)入分離膠后，電壓可提高到90V。參照預(yù)染Marker的位置，待目的條帶進(jìn)入凝膠最佳分離區(qū)(大約凝膠的2/3)時(shí)，停止電泳。預(yù)先將轉(zhuǎn)膜液4℃預(yù)冷。在托盤上打開轉(zhuǎn)移盒，靠近陰極側(cè)的內(nèi)面鋪上已經(jīng)用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕的有孔維墊，其上放三層浸有轉(zhuǎn)膜緩沖液的Whatman3MM濾紙，注意排凈氣泡。小心撬開玻璃板，將膠放置含有轉(zhuǎn)膜液的托盤內(nèi)，將含有目的條帶的分離膠切下，用轉(zhuǎn)膜液浸泡后置于濾紙上。10)在凝膠上鋪上經(jīng)甲醇和轉(zhuǎn)膜液浸濕的NC膜，膠和膜之間不能存有氣泡，膜、濾紙和凝膠的大小，大致相同。在NC膜上再放兩層浸過轉(zhuǎn)膜液的Whatman濾紙，注意排凈氣泡。放上第二塊海綿墊，使整個(gè)轉(zhuǎn)印夾層依次形成“纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖維墊”層次，關(guān)閉轉(zhuǎn)印夾，放入轉(zhuǎn)移槽中，槽中灌滿轉(zhuǎn)膜液。打開電源，穩(wěn)流200mA，120min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC膜并作好標(biāo)記，用TBST洗膜10minX3次。免疫印跡1)封閉：將NC膜放入平皿中，加入含5％脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5-2h；2)封閉結(jié)束后，用TBST洗膜10min×3次；3)將膜放入含一抗(用westem一抗稀釋液稀釋)的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜；4)第二天取出，室溫振蕩30min，吸棄一抗，TBST洗10min×3次；5)用5％脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1-2h；6)二抗反應(yīng)結(jié)束后，回收二抗。然后用TBsT洗膜5-10min×3次；7)將EcL化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A、B兩種液體按1∶1等體積混合，配置成工作液備用；8)將NC膜從TBST中取出，甩掉多余的液體，將含有蛋白質(zhì)的膜正面朝上，放在保鮮膜，滴加適量工作液，用保鮮膜覆蓋，放置顯影夾內(nèi)，關(guān)閉顯影夾；9)使用英國(guó)syngene化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(購(gòu)于上海仁器儀器儀表有限公司)成像，利用ImageJ軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。試驗(yàn)結(jié)果：如圖5所示，通過Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人lncRNA過表達(dá)組的真皮成纖維細(xì)胞中膠原基因COL1A1、COL1A2以及COL3A1的蛋白表達(dá)量顯著降低，分別下降了32％、36％和40％，表明真皮成纖維細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA可顯著抑制膠原合成量。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3