本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于CRISPR/Cas9技術(shù)的單子葉植物基因敲除載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)是來自鏈球菌屬的一種獲得性免疫系統(tǒng)，能夠抵御外源基因的入侵。經(jīng)過人工修飾，這種系統(tǒng)在動(dòng)植物中得到了廣泛應(yīng)用。它主要由CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)和特異的Cas9蛋白組成。CRISPR是一成簇的規(guī)律間隔的短回文DNA重復(fù)序列，它由一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列和長(zhǎng)度相似的序列間隔排列組成。Cas9蛋白是一種由1409個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白，含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域RuvC-like和HNH。CRISPR/Cas9系統(tǒng)于2013年被Seung等人(Seung Woo Cho et al.,2013)首次成功運(yùn)用于真核細(xì)胞的基因組編輯?；贑RISPR/Cas9的基因組編輯體系包括2部分：sgRNA及酶Cas9。這種系統(tǒng)能夠特異的識(shí)別毗鄰PAM(NGG)基序的靶序列，并在其上游3nt處進(jìn)行切割，同時(shí)RuvC-like結(jié)構(gòu)域在PAM區(qū)上游3～8nt處進(jìn)行切割，形成DSB(double strains break雙鏈斷裂),隨后機(jī)體通過自身的修復(fù)機(jī)制如同源重組、非同源重組來修復(fù)損傷的DNA,進(jìn)而產(chǎn)生Indel(包括缺失和插入)的現(xiàn)象。

目前應(yīng)用于植物上的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建體系并不多，有基于基因槍轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建體系和基于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建體系。在目前普遍使用的植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方面，基于CRISPR/Cas9技術(shù)的植物基因敲除載體體系構(gòu)建過程比較繁瑣，需要多步才能將各個(gè)部分整合到雙元載體上。已報(bào)道的CRISPR/Cas9體系，有的體系是借助限制性內(nèi)切酶BbsI先把sgRNA插入pATU6-26SK/pOsU6SK載體,再通過限制性內(nèi)切酶KpnI和SalI酶切得到AtU6-sgRNA片段或通過KpnI和HindIII雙酶切獲得OsU6-sgRNA片段，同時(shí)將酶切過的SalI-Cas9-EcoRI或HindIII-Cas9-EcoRI片段與已用KpnI和EcoRI酶切的線性化的質(zhì)粒pCAMBIA1300連接構(gòu)建雙元載體，這種系統(tǒng)在構(gòu)建過程中比較復(fù)雜而且周期長(zhǎng)(ZY Feng,JK Zhu et al.,2013)；另外有利用合成的方法直接合成啟動(dòng)子和sgRNA單元，再構(gòu)建到雙元載體上，這種體系成本高，周期長(zhǎng)(Wenzhi Jiang et al.,2013)。而在基因槍轉(zhuǎn)化方面中，已報(bào)道的體系都是將pU6-gRNA或pU3-gRNA載體與Cas9載體共同包裹在金粉中打入植物組織中，這種費(fèi)用比較高。以上這些體系，要完成一個(gè)植物基因CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建，要么成本高昂，要么過程繁瑣，且不能滿足高通量植物基因CRISPR/Cas9敲除載體構(gòu)建的需求。

還有一種體系是將啟動(dòng)子、sgRNA scaffold和Cas9片段整合到一個(gè)雙元載體，并選用Bsa I作為插入位點(diǎn)，但是這種體系的缺陷在于，在兩個(gè)Bsa I之間存在SpR(spectinomycin resistance gene壯觀霉素抗性基因)片段，在構(gòu)建過程中需要Bsa I酶切回收線性化載體，再連接target sites(靶位)(HL Xing,L Dong et al.,2014)。

而本發(fā)明是將水稻OsU3啟動(dòng)子及sgRNA元件與35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的Cas9元件直接整合在雙元載體pCAMBIA1300上，并在sgRAN scaffold元件中選用Aar I作為靶序列的插入位點(diǎn)，且兩個(gè)Aar I只間隔7bp堿基，只需要通過酶切純化獲取線性化載體，再一步連接的方法插入target oligos，從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速和高效的構(gòu)建CRISPR/Cas9基因敲除載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的單子葉植物基因敲除載體pCAMBIA1300-OsU3-2x35s-Cas9，該載體具有以下特征：

(1)骨架載體為雙元載體pCAMBIA1300；

(2)在所述雙元載體上，同時(shí)連入了sgRNA元件和Cas9元件；

(3)所述sgRNA元件由sgRNA啟動(dòng)子、sgRNA-scaffold及靶點(diǎn)插入酶切位點(diǎn)組成；

(4)所述sgRNA啟動(dòng)子為OsU3啟動(dòng)子；

(5)所述靶點(diǎn)插入酶切位點(diǎn)為Aar I,酶切位點(diǎn)信息為：

Aar I:CTTGGCTCGCAGGTGAACACAACACCTGCACAC(SEQ ID NO：1)

(6)所述Cas9元件為2x35S-Cas9-ter，2x35S為串聯(lián)的2個(gè)35S啟動(dòng)子，ter為終止子(terminator)，Cas9為編碼基因Cas9的全長(zhǎng)CDS序列并且兩端加有核定位的信號(hào)NLS(Nuclear localization signal)，N端加有Flag標(biāo)簽。

本發(fā)明是將sgRNA結(jié)構(gòu)單元與Cas9基因共同整合到骨架載體pCAMBIA1300上的敲除載體pCAMBIA1300-OsU3-2x35s-Cas9，同時(shí)sgRNA結(jié)構(gòu)單元中有Aar I的插入位點(diǎn)，其序列如下：

Aar I:CTTGGCTCGCAGGTGAACACAACACCTGCACAC(SEQ ID NO：1)

本發(fā)明使用的啟動(dòng)子是OsU3啟動(dòng)子，在植物中啟動(dòng)sgRNA scaffold結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子屬于Pol III promoters,包括U3和U6的啟動(dòng)子，而OsU3是單子葉植物中啟動(dòng)效率較高的啟動(dòng)子；同時(shí)選用的限制性酶的插入位點(diǎn)也是一類特征的酶—Type IIs限制性內(nèi)切酶，可選用的酶有Aar I、BspQ I、Bbs I/Bpi l、BsmB I/Esp3 I、BfuA I/Be I和Bsa I/Eco31 I，而在本發(fā)明中選用Aar I的插入位點(diǎn)(其他位點(diǎn)在pCAMBIA1300載體上都存在)。

本發(fā)明使用pCAMBIA1300作為骨架載體，將2x35s-Cas9-ter(2x35s：2個(gè)串聯(lián)在一起的35S啟動(dòng)子；cas9:cas9酶的CDS序列；ter:終止子序列)及sgRNA元件(單子葉植物使用水稻的OsU3啟動(dòng)子啟動(dòng))連入骨架載體；同時(shí)將Aar I的酶切位點(diǎn)連入sgRNA元件的靶位點(diǎn)插入處(sgRNA啟動(dòng)子與sgRNA scaffold之間)，構(gòu)建出適用于單子葉植物基因敲除載體pCAMBIA1300-OsU3(Aar I)-2x35s-Cas9。

2x35s-Cas9-ter的序列(SEQ ID NO：2)：

CGGTATCGATAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTGATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACCTCGACCTCAACACAACATATACAAAACAAACGAATCTCAAGCAATCAAGCATTCTACTTCTATTGCAGCAATTTAAATCATTTCTTTTAAAGCAAAAGCAATTTTCTGAAAATTTTCACCATTTACGAACGATACTCGAGATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGTAAGGATCCTGATTGATCGATAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGG

sgRNA scaffold的序列為(SEQ ID NO：3)：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTT

本發(fā)明基于CRISPR/Cas9技術(shù)的植物基因敲除載體能夠應(yīng)用到植物靶基因的敲除中，同時(shí)也能夠以試劑盒的形式運(yùn)用到植物基因編輯中。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、由Aar I插入位點(diǎn)組成的sgRNA-OsU3結(jié)構(gòu)序列與2x35s-Cas9-ter序列共同構(gòu)建的CRISPR/Cas9植物敲除的雙元載體pCAMBIA1300-OsU3-2x35s-Cas9，能夠通過一步酶切連接的方法來實(shí)現(xiàn)高效、快速構(gòu)建單子葉植物基因敲除載體的目的。

2、本發(fā)明提供的CRISPR/Cas9敲除載體pCAMBIA1300-OsU3-2x35s-Cas9，具有打靶效率高、脫靶效率極低的特點(diǎn)，本發(fā)明載體的打靶效率高于10％，優(yōu)選達(dá)到60％，特別適合應(yīng)用于植物靶基因的敲除或者以試劑盒的形式運(yùn)用到植物基因編輯中。

附圖說明

圖1為單子葉基因敲除載體結(jié)構(gòu)圖—pCAMBIA1300-OsU3(Aar I)-Cas9。

圖2為敲除基因OsPDS的水稻表型及檢測(cè)的酶切和測(cè)序結(jié)果圖。

圖3為敲除基因Gn1a的測(cè)序結(jié)果和測(cè)序峰圖

具體實(shí)施方案：

一.單子葉基因敲除載體構(gòu)建：

1.設(shè)計(jì)含有Hind III酶切序列的Hind III-OsU3-F/R引物并擴(kuò)增質(zhì)粒pOsU3-gRNA中的OsU3(Aar I插入位點(diǎn))(中科院遺傳與發(fā)育研究所高彩霞實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))片段，

Hind III-OsU3-F：5’-CCCAAGCTTAGGAATCTTTAAACATACGAAC-3’(SEQ ID NO：5)；

Hind III-OsU3-R：5’-CAAGCTTGATCCTCTAGAGATTATGTGG-3’(SEQ ID NO：6)

PCR反應(yīng)條件95℃，30s；56℃，30s；72℃，40s；35cycles。

2.膠回收OsU3片段，連入T載體PMD19-T進(jìn)行T/A克隆，并挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序，所測(cè)得的OsU3(Aar I)-sgRNA結(jié)構(gòu)序列(畫下劃線的為Aar I的識(shí)別序列)為(SEQ ID NO：4)：

AAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTCGGAAACCACGTGATGTGAAGAAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAGCTCGCAGGTGAACACAACACCTGCACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCCACATAATCTCTAGAGGATC

3.酶切獲得Hind III-OsU3片段：直接用Hind III限制性內(nèi)切酶從pMD19-T質(zhì)粒上酶切獲得Hind III-OsU3片段。并與已用Hind III酶切線性化的pCAMBIA1300進(jìn)行T4連接，構(gòu)建pCAMBIA1300-OsU3質(zhì)粒，構(gòu)建成功后將質(zhì)粒送去測(cè)序，其中測(cè)序引物OsU3-F的序列為:CCCAAGCTTAGGAATCTTTAAACATACGAAC(SEQ ID NO：5)。

4.從2X35s-Cas9質(zhì)粒(中科院上海生命科學(xué)研究院朱健康實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))上用EcoR I和Sal I酶酶切得到2X35s-Cas9-ter片段，并進(jìn)行膠回收。同時(shí)用EcoR I和Sal I酶切pCAMBIA1300-OsU3質(zhì)粒，獲得線性化質(zhì)粒。

5.將2X35s-Cas9-ter片段連入pCAMBIA1300-OsU3線性化質(zhì)粒中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、酶切檢測(cè)和測(cè)序，獲得正確的pCAMBIA300-OsU3(Aar I)-Cas9質(zhì)粒。

實(shí)施例1：水稻白化基因的敲除與驗(yàn)證

一、水稻白化基因OsPDS敲除載體的構(gòu)建

1.根據(jù)水稻白化基因OsPDS序列和sgRNA設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)特意的靶序列，序列如下：

OsPDS-oligo1:GGCAGTTGGTCTTTGCTCCTGCAG(SEQ ID NO：7)

OsPDS-oligo2:AAACCTGCAGGAGCAAAGACCAAC(SEQ ID NO：8)

2.將設(shè)計(jì)的target oligos按如下條件進(jìn)行退化磷酸化過程：

在PCR管中配制反應(yīng)體系：

在PCR儀上按以下程序完成反應(yīng)過程：

3.用Aar I酶酶切pCAMBIA1300-OsU3(Aar I)-Cas9質(zhì)粒，獲取線性化載體，并用CIP酶做去磷酸化處理，以免自連。

4.將退火磷酸化產(chǎn)物稀釋100倍，取2μl與線性化載體進(jìn)行T4連接：

在PCR管中配制連接體系：

16℃連接0.5～1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中并篩選陽(yáng)性克隆2～4個(gè)送去測(cè)序。成功插入靶位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果為：

GGCAGTTGGTCTTTGCTCCTGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTT

表明水稻白化基因OsPDS的CRIPSR/Cas9敲除載體構(gòu)建成功。

5.將其敲除載體轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌中，并完成整個(gè)組培過程，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性幼苗，做檢測(cè)驗(yàn)證。

6.酶切試驗(yàn)和目的片段PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果都表明13％的單株中產(chǎn)生了缺失現(xiàn)象，同時(shí)植株中出現(xiàn)白化苗表型，見附圖2。

實(shí)施例2：水稻Gn1a基因的敲除與驗(yàn)證

1.根據(jù)水稻基因Gn1a序列和sgRNA設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)特意的靶序列，序列如下：

Gn1a-2-oligo1:GGCAGCGGCCAGGCCTTCCGCCA(SEQ ID NO：9)

Gn1a-2-oligo2:AAACTGGCGGAAGGCCTGGCCGC(SEQ ID NO：10)

2.按照實(shí)施例1中的步驟成功構(gòu)建Gn1a的敲除載體。

3.將其敲除載體轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌中，并完成整個(gè)組培過程，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性幼苗，做檢測(cè)驗(yàn)證。

4.Gn1a轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的檢測(cè)：利用Gn1a-F/R引物

Gn1a-F:5’-GATTGATTGATTGATAATGAAGC-3’(SEQ ID NO：11)；

Gn1a-R:5’-CCTATACCTTAATTACCTC-3’(SEQ ID NO：12)

進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，PCR反應(yīng)條件為95℃，30s；55℃，30s；72℃，40s；35cycles。

5.目的片段的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果：在14株轉(zhuǎn)基因水稻中有5株存在突變現(xiàn)象，即突變頻率為35％，見附圖3。

從這些實(shí)施例可知，本發(fā)明所構(gòu)建的單子葉敲除載體pCAMBIA1300(Aar I)-OsU3-Cas9具有簡(jiǎn)便、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，特別是具有較高的打靶效率和極低的脫靶率。

所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，步驟可以以任意順序?qū)崿F(xiàn)，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡(jiǎn)明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。