本發(fā)明涉及個(gè)體化醫(yī)學(xué)基因分型實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制領(lǐng)域，尤其涉及一種預(yù)測(cè)甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效的基因分型質(zhì)控品。

背景技術(shù)：

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，其主要表現(xiàn)為慢性、對(duì)稱性、破壞性多關(guān)節(jié)炎，其中雙手、腕、膝、踝、和足關(guān)節(jié)受累最為常見(jiàn)。若不盡早給予合理治療，病情會(huì)逐漸發(fā)展，最終可致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。

目前，甲氨蝶呤(methotrexate)是國(guó)內(nèi)外治療RA的首選藥物之一，因其物美價(jià)廉而成為RA患者使用最廣泛的基礎(chǔ)用藥。甲氨蝶呤主要通過(guò)抑制葉酸代謝，從而抑制細(xì)胞增殖和復(fù)制，其可作用于氨基咪唑甲酰胺酶(ATIC)，減少5-氨基咪唑-4-氨甲酰胺核苷酸(AICAR)轉(zhuǎn)化為5-甲酰氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(FAICAR)，導(dǎo)致AICAR在細(xì)胞內(nèi)蓄積。而AICAR同時(shí)又可通過(guò)抑制腺苷脫氨酶(ADA)和腺苷單磷酸脫氨酶(AMPD)活性，減少腺苷和腺苷酸分解，從而增加這兩種物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的濃度。腺苷作為抑制抗炎性介質(zhì)，通過(guò)與相應(yīng)的腺苷受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)甲氨蝶呤的抗炎作用。

近年來(lái)，藥物基因組學(xué)(pharmacogenetics)的，近年來(lái)藥物基因組學(xué)(pharmacogenetics)研究揭示，編碼藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物作用靶點(diǎn)的基因序列的不同是引起藥物個(gè)體化差異的一個(gè)主要原因，20％-95％藥物反應(yīng)和處置的個(gè)體差異卻是由遺傳因素引起的。藥物基因組學(xué)研究則為實(shí)現(xiàn)個(gè)體化臨床用藥提供了新的途徑。

氨基咪唑甲酰胺酶(ATIC)基因位于2q35，存在數(shù)種多態(tài)性標(biāo)記，其中包含rs4673993(C>T)位點(diǎn)。Lee YC等人對(duì)120名接受甲氨蝶呤單藥治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者開(kāi)展的研究發(fā)現(xiàn)，ATIC rs4673993位點(diǎn)突變與低疾病活性相關(guān)(P＝0.01)。與基因型為TT的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者相比，基因型為CC的患者接受甲氨蝶呤治療可獲得較好的療效?；蛐蜑镃T的患者則獲得中等療效。因此，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的rs4673993(C>T)基因分型決定其甲氨蝶呤治療的療效。 因此，對(duì)接受甲氨蝶呤治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行ATIC rs4673993(C>T)基因分型檢測(cè)能夠預(yù)測(cè)其治療療效，從而為個(gè)體化治療提供依據(jù)。

國(guó)外開(kāi)展臨床實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評(píng)價(jià)已有60年歷史。近十年來(lái)，我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室也已經(jīng)普遍開(kāi)展了室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的準(zhǔn)確性和各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的一致性。然而，目前已開(kāi)展的室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目?jī)?nèi)容主要限于臨床檢驗(yàn)，與個(gè)體化用藥監(jiān)測(cè)相關(guān)的僅有治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)，且種類和方法有限。隨著個(gè)體化用藥新技術(shù)的發(fā)展、國(guó)家對(duì)新藥研發(fā)的鼓勵(lì)和投入增多，越來(lái)越多的醫(yī)院、臨床實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)開(kāi)展藥物基因檢測(cè)、藥物血中濃度檢測(cè)項(xiàng)目。由于國(guó)家相關(guān)政策尚未完善、對(duì)機(jī)構(gòu)的監(jiān)督及核查不足，各個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)水平參差不齊，造成了不同實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)水平差異顯著，嚴(yán)重影響了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，數(shù)據(jù)質(zhì)量的不可靠可能為藥物個(gè)體化應(yīng)用埋下潛在風(fēng)險(xiǎn)。

如果有標(biāo)準(zhǔn)的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，就可以確定某個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)量的能力，并監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室的持續(xù)發(fā)展能力；識(shí)別實(shí)驗(yàn)室中的問(wèn)題并制定相應(yīng)的補(bǔ)救措施；確定新的檢測(cè)和測(cè)量方法的有效性和可比性，并對(duì)這些方法進(jìn)行相應(yīng)的監(jiān)控；增加實(shí)驗(yàn)室用戶的信心；識(shí)別實(shí)驗(yàn)室間的差異，從而可保證個(gè)體化用藥的有效性和安全性。

全國(guó)開(kāi)展藥物基因檢測(cè)的各家單位在標(biāo)本采集和保存、DNA提取方法、基因型檢測(cè)方法、檢測(cè)結(jié)果的分析和解釋等方面存在很大差異，而這些差異將直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而影響個(gè)體化用藥方案制定的可靠性。其中，基因檢測(cè)方法是影響最終檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素。目前應(yīng)用的基因檢測(cè)的方法主要有PCR擴(kuò)增后限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析方法、Taqman探針?lè)?、DNA測(cè)序法、基因分型芯片法以及微測(cè)序法等。其中，DNA測(cè)序法是目前進(jìn)行基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，PCR-RFLP法應(yīng)用較為廣泛，但都容易發(fā)生樣品間交叉污染。另外，探針?lè)ú僮鬟^(guò)程雖然簡(jiǎn)單，但探針在反復(fù)凍融后容易失效?？梢?jiàn)，各種基因檢測(cè)方法各有優(yōu)劣，其結(jié)果難以保證一致。所以，各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的結(jié)果有待一個(gè)第三方室間質(zhì)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估。

在衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心印發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》中，將藥物基因檢測(cè)納入醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理，并指出開(kāi)展檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室每 年必須參加實(shí)驗(yàn)室之間的質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)。全國(guó)開(kāi)展藥物基因檢測(cè)的各家單位在標(biāo)本采集和保存、DNA提取方法、基因型檢測(cè)方法、檢測(cè)結(jié)果的分析和解釋等方面存在很大差異，而這些差異將直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而影響個(gè)體化用藥方案制定的可靠性。但是，目前國(guó)內(nèi)尚缺乏一個(gè)藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)體系。而基因檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控品則是藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)體系一個(gè)重要組成部分。因此，本發(fā)明提供一種基因檢測(cè)質(zhì)控品以供藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)體系使用，這對(duì)開(kāi)展藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)具有重大意義，并對(duì)提升藥物基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的競(jìng)爭(zhēng)力有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的用于甲氨蝶呤個(gè)體化用藥檢測(cè)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)品解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種基因檢測(cè)質(zhì)控品以供藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)體系使用，這對(duì)開(kāi)展藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)具有重大意義，并對(duì)提升藥物基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的競(jìng)爭(zhēng)力有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

本發(fā)明的目的在于提供一種預(yù)測(cè)甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效的基因分型質(zhì)控品，為甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的質(zhì)控品核苷酸序列為SEQ ID NO.1：

TACACGCTGGGTACTGTCAGGCTTCAGTGGCTCTGTGGTTTTGGAGGGCAGAGAGGAGATTTCCCTCACACTGCTCCCACAACCATATTTTTAGTGTATAATTATCTGGCTAAATAGATTTCTGTTTAATTTAGCACAGGCACTAGAAAATGTGCTGCGTAGACTGGGTGTTAAGAAAACTGTCTTGATTTAGGAGTTGACAGGTAGTAACTTTAGCTTTCTTTGTTTATGATTTTACTATTTTCTAACCAGGTGCTGCTGTTGGAATTCCACTCAGTGAAGATGAGGCCAAAGTCTGCA

所述質(zhì)控品模板是含有插入ATIC特異性核苷酸序列的PES質(zhì)粒載體，該載體可在大腸桿菌中擴(kuò)增，并采用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒提取辦法進(jìn)行制備。

本發(fā)明的有益效果

提供一種基因檢測(cè)質(zhì)控品以供藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)體系使用，這對(duì)開(kāi)展藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)具有重大意義，并對(duì)提升藥物基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的競(jìng)爭(zhēng)力有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品模板的核苷酸序列和質(zhì)粒載體圖。

圖2是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品模板的核苷酸序列的測(cè)序結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法

1、通過(guò)PCR方法獲得目的基因

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中為Smal 1和EcoRV)，通過(guò)高保真DNA聚合酶PCR循環(huán)擴(kuò)增獲得目的基因片段。

PCR反應(yīng)體系為：

PCR反應(yīng)條件為：94℃變性5min、94℃變性30s、55℃復(fù)性40s、68℃延伸1min(根據(jù)片段大小設(shè)置，1kb/min)，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min；16℃forever。

2、目的基因片段回收純化

將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)品通過(guò)新鮮的TAE緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳跑膠，同時(shí)通過(guò)MarKerV進(jìn)行比較，確定片段大小正確后在紫外燈下切膠回收，接著通過(guò)膠回收純化目的基因片段。

3.雙酶切反應(yīng)

將目的基因和質(zhì)粒載體按照一定的體系分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，雙酶切體系如下：

雙酶切反應(yīng)2.5-3h左右，進(jìn)行跑膠回收純化

4、目的DNA片段和載體的體外連接

分別取1μl左右的目的DNA片段與載體DNA測(cè)量他們的濃度，利用T4DNA連接酶將目的基因與載體DNA摩爾比為3:1-8:1左右連接，放置16℃的恒溫水浴鍋過(guò)夜連接。

5、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

感受態(tài)細(xì)胞的制備

⑴保存于-70℃的DH5α(或其他菌種)用接種環(huán)劃菌于1.5％瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(約14-16hr)。

⑵挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250g振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(約12hr)。

⑶取0.5ml過(guò)夜培養(yǎng)液，接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5hr，至OD₆₀₀為0.4-0.5時(shí)，放置于4℃冰箱冷卻1-2hr。

(注：以下操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。)

⑷將培養(yǎng)液分入兩個(gè)50ml離心管中，4℃離心，4000g×10min，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl₂ 25ml懸浮30min。

⑸4℃離心,4000g×10min，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl₂-甘油溶液1ml懸浮。

⑹以100μl/管分裝入1.5ml離心管中，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

⑴取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開(kāi)；

⑵加入適量連接產(chǎn)物(一般不超過(guò)10μl，輕輕混勻，冰浴20min；

⑶于42℃熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min；

⑷加入LB液體培養(yǎng)基500μl，于37℃緩搖孵育45min；

⑸將培養(yǎng)物適量涂于1.5％瓊脂LB平板(根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素AMP即氨芐50μg/ml)，待膠表面沒(méi)有液體流動(dòng)時(shí)，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。

6、重組質(zhì)粒的鑒定

將過(guò)夜培養(yǎng)的長(zhǎng)出的菌斑進(jìn)行菌落PCR鑒定，接著接種于5ml的LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜振蕩培養(yǎng)利用質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒PCR和雙酶切驗(yàn)證，確定目的基因大小正確送公司測(cè)序進(jìn)一步的分析驗(yàn)證。

實(shí)施例2基于DNA測(cè)序法的陽(yáng)性質(zhì)控品測(cè)試

1.引物設(shè)計(jì)與合成：

以人ATIC基因序列為模板，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。

所述質(zhì)控品模板是含有插入ATIC特異性核苷酸序列的PES質(zhì)粒載體，該載體可在大腸桿菌中擴(kuò)增，并采用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒提取辦法進(jìn)行制備。

所述PES質(zhì)粒載體具有氨芐青霉素抗性片段，在插入目的核苷酸序列后，可產(chǎn)生氨芐青霉素抗性，從而使轉(zhuǎn)化了該質(zhì)粒載體的大腸桿菌具有耐氨芐青霉素的性質(zhì)，能夠在加入一定氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

所述質(zhì)控品模板在大腸桿菌中擴(kuò)增及質(zhì)粒提取步驟如下：

1.活化：取凍存的甘油菌涂布平板或平板劃線，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

2.挑取單菌落，接種于5ml LB(含Amp)培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

3.將菌液1.8ml分裝至2ml離心管，12000rpm離心1min，棄去上清。

4.向離心管中加入100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ，懸浮、混勻菌體沉淀。

5.加入200μl溶液Ⅱ，輕柔顛倒數(shù)次，靜置1min。

6.加入150μl預(yù)冷溶液Ⅲ，輕柔顛倒，靜置1-2min，12000rpm離心10min。

7.吸取上清至新2ml離心管，加入與上清等體積的酚-氯仿，振蕩混勻，冰上靜置10min，12000rpm離心2min。

8.上清移至新離心管，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混勻，室溫靜置2-3min，12000g離心5min。

9.棄上清，用75％乙醇洗滌沉淀一次，室溫靜置干燥10min。

10.用100μl TE(含RNase 20μg/ml)溶解沉淀，37℃水浴30min

11.紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260(按照在260nm波長(zhǎng)產(chǎn)生1個(gè)OD值的DNA濃度是50ng/ml換算)；瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果。

12.溶解后質(zhì)粒置于-20℃保存。

上述步驟中所述溶液I的成分為：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(pH8.0)。

上述步驟中所述溶液II的成分為：0.2M NaOH和1％SDS。

上述步驟中所述溶液III的成分為：5M乙酸鉀60ml、冰乙酸11.5ml調(diào)pH至4.8，加入蒸餾水定容至100ml。

實(shí)施例3類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床治療藥物基因檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)體系的建立

藥物基因檢測(cè)質(zhì)控品的制備

組織者完成血漿中基因提取和序列測(cè)定方法學(xué)的建立及驗(yàn)證。

血漿中基因序列標(biāo)準(zhǔn)品：用金標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序法檢測(cè)本發(fā)明公開(kāi)的含SNP片斷的質(zhì)粒,作為標(biāo)準(zhǔn)品。

血漿中基因檢測(cè)質(zhì)控品：基因標(biāo)準(zhǔn)品→定量→取標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白血漿→得到目標(biāo)基因的質(zhì)控品。

方法學(xué)建立：建立血液樣本DNA提取、目的基因片段PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物，提純以及DNA序列測(cè)定的方法。

含SNP片斷的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

方法學(xué)驗(yàn)證：考察藥物基因檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確度和精密度和穩(wěn)定性。

作業(yè)指導(dǎo)書(shū)(SOP)撰寫：評(píng)價(jià)項(xiàng)目和時(shí)限要求(發(fā)放、回收、評(píng)價(jià))、樣品保存條件、樣本處理方法、檢測(cè)方法描述、方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容、報(bào)告格式以及其他注意事項(xiàng)。

藥物基因檢測(cè)質(zhì)控品的發(fā)放和結(jié)果回收

面向藥物基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)放質(zhì)控品及相關(guān)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)。質(zhì)控品的發(fā)放將 通過(guò)嚴(yán)格監(jiān)控的冷鏈運(yùn)輸體系，以確保質(zhì)控品的穩(wěn)定性。

室間質(zhì)評(píng)參加者須在規(guī)定時(shí)間內(nèi)按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)要求完成測(cè)定，結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)格式通過(guò)網(wǎng)絡(luò)形式上報(bào)至中心，并留存原始記錄及結(jié)果報(bào)告。

結(jié)果評(píng)價(jià)

制定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于每一個(gè)測(cè)定結(jié)果，進(jìn)行評(píng)分。

對(duì)每一次EQA調(diào)查，針對(duì)某一項(xiàng)目的得分計(jì)算公式為：

該項(xiàng)目的可接受結(jié)果數(shù)/該項(xiàng)目的總的測(cè)定樣本數(shù)×100％

而對(duì)評(píng)價(jià)的所有項(xiàng)目，其得分計(jì)算公式為：

全部項(xiàng)目可接受結(jié)果總數(shù)/全部項(xiàng)目總的測(cè)定樣本數(shù)×100％

室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃的成績(jī)要求

每次活動(dòng)每一分析項(xiàng)目未能達(dá)到至少100％可接受成績(jī)則稱為本次活動(dòng)該分析項(xiàng)目不滿意的EQA成績(jī)。

未參加室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)定為不滿意的EQA成績(jī)，該次得分為0。

在規(guī)定的回報(bào)時(shí)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)室未能將能室間質(zhì)評(píng)的結(jié)果回報(bào)給組織者，將定為不滿意的EQA成績(jī)，該次活動(dòng)的得分為0。