專利名稱：特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆dp-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等轉(zhuǎn)基因作物已在許多國家允許種植和生產(chǎn)，并被廣泛用作食品或飼料的加工原料。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品存在著生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和食品安全等一系列的問題，因此，世界各國政府和相關(guān)國際組織紛紛制定相應(yīng)的安全管理法規(guī)，加強(qiáng)遺傳改良作物的規(guī)范管理，并對遺傳改良作物及其產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識制度。我國于2001年5月9 日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，并在2002年I月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)、標(biāo)示和進(jìn)ロ安全管理三個(gè)配套管理辦法。為了應(yīng)對遺傳改良作物管理相關(guān)的法律法規(guī)和制度，建立高效、快速、特異的檢測技術(shù)十分必要，它是各國際組織和國家管理遺傳改良作物的有力技術(shù)支撐。目前已經(jīng)發(fā)展并廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法有兩類ー類是基于核酸水平的檢測，另ー類是基于蛋白質(zhì)水平的免疫學(xué)檢測?；诤怂岬木酆厦告湻磻?yīng)(PCR)檢測技術(shù)因具有高靈敏度和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，已成為目前最重要、應(yīng)用最廣泛的遺傳改良作物及其產(chǎn)品檢測技木。不論采用基于核酸還是基于蛋白質(zhì)的方法，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測時(shí)都應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽性對照，以確保檢測過程的有效和檢測結(jié)果的可靠性。目前，用于轉(zhuǎn)基因檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要是用純合的轉(zhuǎn)基因植物材料配置的，位于比利時(shí)的歐盟聯(lián)合研究中心下屬的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)專業(yè)配制和提供用于轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。到目前為止僅能得到十幾種在市場上銷售的遺傳改良作物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。但這類來源于農(nóng)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其必須有專門的研究機(jī)構(gòu)來制備，貯存和測定過程受很多因素影響，很難維持恒定的量，價(jià)格昂貴， 而且，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因含量范圍一般是從0. 1%到5%，而實(shí)際檢測的樣品中的轉(zhuǎn)基因含量可能會超出這個(gè)范圍。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏已成為檢測方法建立和應(yīng)用的瓶頸，阻礙了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度的順利實(shí)施。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子是ー種重組質(zhì)粒分子，其中一般包含轉(zhuǎn)基因作物檢測的外源基因片段或品系特異性片段以及物種特異性片段。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的優(yōu)點(diǎn)主要是可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高，同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時(shí)包含多個(gè)外源目的基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，經(jīng)濟(jì)高效。近年來，越來越受到各國轉(zhuǎn)基因檢測專家和學(xué)者們的重視，并逐漸取代傳統(tǒng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品用于轉(zhuǎn)基因品系及其加工產(chǎn)品的PCR檢測。轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系由先鋒公司研發(fā)，已先后在美國、加拿大和日本三國批準(zhǔn)環(huán)境釋放，并在澳大利亞、韓國、菲律賓、墨西哥等8個(gè)國家和地區(qū)批準(zhǔn)用于食品和飼料加工原料。我國雖然不種植轉(zhuǎn)基因大豆，但每年都進(jìn)ロ幾千萬噸轉(zhuǎn)基因大豆用于食品或飼料加工原料。迄今為止，還沒適用于轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的報(bào)道。為了給中國轉(zhuǎn)基因大豆品系監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐，有必要開發(fā)適用于轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系特異性檢測的、穩(wěn)定可靠的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用，本發(fā)明的目的在于提供特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其包含以下序列片段DP_305423品系特異性片段和大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異序列片段。所述的DP-305423的品系特異性序列，指的是轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423的外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的DNA序列如SEQ ID NO: I所示。所述大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性片段，指的是大豆凝集素基因片段，其DNA 序列如SEQ ID NO:2所示。所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的骨架質(zhì)粒是PMD18-T。所述的用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其中用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的引物序列如下(表I)
表I構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的PCR引物
權(quán)利要求
1.一種特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征在于其序列如SEQ ID No:8 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的一種特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟①以轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系為總體積為50 μ 1，其中10倍的PCR反應(yīng)液5 μ 1，dNTPs 4μ I,上下游引物20 μ M各I μ 1，模板5μ I, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ 1，用 ddH20 補(bǔ)足至 50 μ I ；反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5分鐘；然后進(jìn)入以下循環(huán)94°C 50秒，55°C 50秒，72°C 60秒，共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 5 分鐘；產(chǎn)物記為Pdp305423 SEQ ID No: I、PLectin SEQ ID No:7 ；②將Ρ Ρ305423 和P^tin克隆進(jìn)PMD18-T載體，分兩步進(jìn)行第一步采用PMD18-T為基礎(chǔ)載體將上步PCR擴(kuò)增的Pdp3ci5423 SEQ ID No: I片段采用T-A 克隆的方式連接到載體中；第二步用限制性內(nèi)切酶&oR I和漢·Η I將P^etin片段SEQ ID No:7和含有Pdp3ci5423 片段的PMD18-T重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切；然后用T4連接酶將二者連接；獲得將轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423品系特異性序列片段及大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性片段融合在 PMD18-T上的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，將其命名為pMD-DP305423，其序列如SEQ ID Νο:8所示，將 PMD-DP305423導(dǎo)入大腸桿菌JM109即可長期保存使用。
3.如權(quán)利要求2所述的一種特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的的構(gòu)建方法，其特征在于所述的引物序列如下DP305-F ACATAATTTTGAAAGATGATTAATG SEQ ID NO:3DP305-R CAAAGCTTATATATGCCTTCCG SEQ ID NO:4LN-F CGGAATTCAAGGCAAACTCAGCGGAAAC SEQ ID NO:5LN-R CGGGATCCAGTGTCAAACTCAACAGCGAC SEQ ID NO:6。
4.如權(quán)利要求I所述的一種特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系中作為陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用，構(gòu)建了適用于轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其包含轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的品系特異性序列和大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段，對所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測中的適用性進(jìn)行了驗(yàn)證表明，所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子高度特異于轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102586308SQ20121005960
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者孫昌雷, 李文華, 楊正友, 趙鳳春 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)