專利名稱：米根霉rh1-5及其分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及霉菌類微生物及分離培養(yǎng)方法，具體涉及一種米根霉RH1-5及其分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
大曲作為濃香型曲酒的糖化發(fā)酵劑，在培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)過(guò)一定富集、培養(yǎng)、自然篩選、馴化形成了特殊的微生物系，為曲酒生產(chǎn)發(fā)酵提供豐富而有益的微生物菌源，從而形成代謝產(chǎn)物的多樣性，即香味成份的復(fù)雜性，同時(shí)大曲還是復(fù)合酶制劑，大曲中含有淀粉酶、糖化酶、酒化酶、酯化酶、蛋白酶等多種酶系，為形成復(fù)雜的香氣成份提供催化劑。但受環(huán)境微生物的影響，大曲微生物菌系繁雜，其糖化力波動(dòng)較大，直接影響大曲在釀酒過(guò)程中的糖化效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種米根霉RH1-5及其分離培養(yǎng)方法，通過(guò)該分離培養(yǎng)方法獲得米根霉RH1-5，分離培養(yǎng)方法工藝簡(jiǎn)單，米根霉RH1-5糖化力波動(dòng)較小，穩(wěn)定大曲在釀酒過(guò)程中的糖化效果。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該米根霉RH1-5菌株是從濃香中高溫大曲中分離篩選而得，菌種已于2011年11月29日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，菌種編號(hào)為=CGMCC No.5513,分類命名米根霉 Rhizopus oryzae。所述米根霉RH1-5的分離培養(yǎng)方法是取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無(wú)菌吸管吸取菌懸液l.OmL，放入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90_無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，搖勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中28°C _32°C倒置培養(yǎng)3-5天；挑取培養(yǎng)皿內(nèi)形態(tài)規(guī)則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，進(jìn)行多次反復(fù)的分離純化，獲得單個(gè)純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基備用；將所得霉菌菌株點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基平板上，用透明圈法進(jìn)行糖化霉菌初篩，篩出產(chǎn)糖化酶能力強(qiáng)的微生物，最終篩選出一株霉菌，經(jīng)26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名腿-5。所述麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基在I. OL麩皮汁中加入其質(zhì)量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min ;其中，麩皮汁制備加入5_6倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過(guò)濾得麩皮汁。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時(shí)，用雙層紗布過(guò)濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補(bǔ)水至1000毫升。
所述孟加拉紅瓊脂養(yǎng)基購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。所述察氏培養(yǎng)基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質(zhì)量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養(yǎng)基中加入IOOul鏈霉素。所述篩選培養(yǎng)基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KN03 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 2-7. 4，121°C滅菌 30min。 本發(fā)明對(duì)大曲中的微生物進(jìn)行分離篩選獲得一株霉菌——米根霉，與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的保藏菌株進(jìn)行性能對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明該菌株不僅糖化力高，而且耐酸、耐高溫，適宜于 釀酒窖池發(fā)酵的酸性環(huán)境，有益于培養(yǎng)制作強(qiáng)化高溫大曲，對(duì)提高出酒率具有重要的意義。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實(shí)施例不能理解為是對(duì)技術(shù)解決方案的限制。實(shí)施例I :依以下步驟分離培養(yǎng)米根霉RH1-5
取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無(wú)菌吸管吸取菌懸液I. OmL，放入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，搖勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中28°C倒置培養(yǎng)5天，每個(gè)稀釋度同時(shí)做3個(gè)平行；挑取培養(yǎng)皿內(nèi)形態(tài)規(guī)則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，進(jìn)行多次反復(fù)的分離純化，獲得單個(gè)純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基備用；將所得霉菌菌株按編號(hào)點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基平板上，用透明圈法進(jìn)行糖化霉菌初篩，篩出產(chǎn)糖化酶能力強(qiáng)的微生物，最終篩選出一株霉菌，經(jīng)26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名RH1-5。其中，所述麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基在I. OL麩皮汁中加入其質(zhì)量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min ;其中，麩皮汁制備加入5倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過(guò)濾得麩皮汁。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時(shí)，用雙層紗布過(guò)濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補(bǔ)水至1000毫升。所述孟加拉紅瓊脂養(yǎng)基購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。所述察氏培養(yǎng)基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質(zhì)量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養(yǎng)基中加入IOOul鏈霉素。所述篩選培養(yǎng)基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 2，121°C滅菌 30min。實(shí)施例2 :依以下步驟分離培養(yǎng)米根霉RH1-5
取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無(wú)菌吸管吸取菌懸液I. OmL，放入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，搖勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中30°C倒置培養(yǎng)4天，每個(gè)稀釋度同時(shí)做3個(gè)平行；挑取培養(yǎng)皿內(nèi)形態(tài)規(guī)則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，進(jìn)行多次反復(fù)的分離純化，獲得單個(gè)純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基備用；將所得霉菌菌株按編號(hào)點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基平板上，用透明圈法進(jìn)行糖化霉菌初篩，篩出產(chǎn)糖化酶能力強(qiáng)的微生物，最終篩選出一株霉菌，經(jīng)26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名RH1-5。所述麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基在I. OL麩皮汁中加入其質(zhì)量1%葡萄糖、O. 5%酵母 膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min;其中，麩皮汁制備加入5. 5倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過(guò)濾得麩皮汁。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時(shí)，用雙層紗布過(guò)濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補(bǔ)水至1000毫升。所述孟加拉紅瓊脂養(yǎng)基購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。所述察氏培養(yǎng)基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質(zhì)量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養(yǎng)基中加入IOOul鏈霉素。所述篩選培養(yǎng)基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 3，121°C滅菌 30min。實(shí)施例3 :依以下步驟分離培養(yǎng)米根霉RH1-5
取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無(wú)菌吸管吸取菌懸液I. OmL，放入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，搖勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中32°C倒置培養(yǎng)3天，每個(gè)稀釋度同時(shí)做3個(gè)平行；挑取培養(yǎng)皿內(nèi)形態(tài)規(guī)則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，進(jìn)行多次反復(fù)的分離純化，獲得單個(gè)純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基備用；將所得霉菌菌株按編號(hào)點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基平板上，用透明圈法進(jìn)行糖化霉菌初篩，篩出產(chǎn)糖化酶能力強(qiáng)的微生物，最終篩選出一株霉菌，經(jīng)26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名RH1-5。所述麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基在I. OL麩皮汁中加入其質(zhì)量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min ;其中，麩皮汁制備加入6倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過(guò)濾得麩皮汁。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時(shí)，用雙層紗布過(guò)濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補(bǔ)水至1000毫升。所述孟加拉紅瓊脂養(yǎng)基購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。所述察氏培養(yǎng)基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質(zhì)量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養(yǎng)基中加入IOOul鏈霉素。
所述篩選培養(yǎng)基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 4，121°C滅菌 30min。實(shí)施例4 :菌種性能對(duì)比優(yōu)化試驗(yàn)
將實(shí)施例1-3獲得的菌株與實(shí)驗(yàn)室保藏的四株糖化菌株從試飯?zhí)腔?、糖化力、液化力及酯化力指?biāo)進(jìn)行性能對(duì)比試驗(yàn)。接種培菌糖化米飯滅菌后，冷卻至35 40°C，以無(wú)菌操作接入霉菌孢子懸浮液，充分搖勻，于不同溫度和不同pH培養(yǎng)不同時(shí)間，中間隔IOh左右搖瓶I次；取出后測(cè)其水分、試飯酸度、試飯?zhí)腔?、糖化力、液化力、酯化力指?biāo)；查閱資料得知試飯?zhí)欠譄o(wú)法真實(shí)的反應(yīng)曲的質(zhì)量好壞，因?yàn)樵囷執(zhí)欠譁y(cè)定值未考慮接種量及時(shí)間的影響，試飯?zhí)腔梢韵鄬?duì)準(zhǔn)確地反應(yīng)曲的質(zhì)量。試飯?zhí)腔g/gh
試飯?zhí)腔?試飯?zhí)欠? (菌種對(duì)米飯的接種量X試飯時(shí)間)X1000糖化酶活力結(jié)果以I克絕干曲在Ph4. 6溶液中，35°C糖化可溶性淀粉I小時(shí)所產(chǎn)生的葡萄糖毫克數(shù)(mg/gh)
液化酶活力在35°C、Ph4. 6溶液時(shí)，I克絕干曲在I小時(shí)液化可溶性淀粉的質(zhì)量(g/gh)，α-淀粉酶作用于α-1，4葡萄糖苷鍵。(I)、不同培菌糖化溫度
表I不同培菌糖化溫度指標(biāo)測(cè)定
權(quán)利要求
1.米根霉RH1-5,其特征在于該米根霉RH1-5菌株是從濃香中聞溫大曲中分尚篩選而得，菌種已于2011年11月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，菌種編號(hào)為CGMCC No. 5513。
2.米根霉RH1-5的分離培養(yǎng) 方法，其特征在于該分離培養(yǎng)方法包括以下步驟取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無(wú)菌吸管吸取菌懸液I. OmL，放入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，搖勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中28°C _32°C倒置培養(yǎng)3-5天；挑取培養(yǎng)皿內(nèi)形態(tài)規(guī)則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，進(jìn)行多次反復(fù)的分離純化，獲得單個(gè)純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基備用；將所得霉菌菌株點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基平板上，用透明圈法進(jìn)行糖化霉菌初篩，篩出產(chǎn)糖化酶能力強(qiáng)的微生物，最終篩選出一株霉菌，經(jīng)26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名RH1-5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述麩皮汁固體斜面培養(yǎng)基在I. OL麩皮汁中加入其質(zhì)量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min ;其中，麩皮汁制備加入5-6倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過(guò)濾得麩皮汁。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時(shí)，用雙層紗布過(guò)濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補(bǔ)水至1000暈升。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述孟加拉紅瓊脂養(yǎng)基購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述察氏培養(yǎng)基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質(zhì)量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養(yǎng)基中加入IOOul鏈霉素O
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述篩選培養(yǎng)基(g/L):由可溶性淀粉 10g、K2HP04 0.3 g、MgC03 或 MgS04lg、NaCl O. 5g、KN03 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 2 — 7· 4，121°C滅菌 30min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種米根霉RH1-5及其分離培養(yǎng)方法，通過(guò)該分離培養(yǎng)方法獲得米根霉RH1-5，該米根霉RH1-5菌株是從濃香中高溫大曲中分離篩選而得，菌種已于2011年11月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，菌種編號(hào)為CGMCCNo.5513。本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法工藝簡(jiǎn)單，米根霉RH1-5糖化力波動(dòng)較小，穩(wěn)定大曲在釀酒過(guò)程中的糖化效果。
文檔編號(hào)C12N1/02GK102634460SQ20121005965
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者吳建峰, 孫瑩, 季方, 張培訓(xùn), 楊艷 申請(qǐng)人:江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司