專利名稱::溶劑耐受微生物及分離方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及工業(yè)微生物的領(lǐng)域。特別是,已分離了對醇特別是丁醇顯示出高耐受性的微生物。
背景技術(shù):
:丁醇是重要的工業(yè)化學(xué)制劑,用作燃料添加劑,塑料工業(yè)中的給料化學(xué)制劑,以及食品和調(diào)料工業(yè)中的食品級提取物。每年通過石油化學(xué)途徑生產(chǎn)10到12十億磅的丁醇,并且對于這種助劑的需求4艮可能會增加。丁醇的化學(xué)合成方法是已知的。例如,1-丁醇可利用Oxo工藝,Reppe工藝,或巴豆搭的氳4b而生產(chǎn)([/〃m"/w'《Ewqyc/opeWao/7wt/組〃'a/C72e冊'欲少,6thedition,2003,Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.,Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)。2-丁醇可利用正丁烯水合而生產(chǎn)(f/〃waw!vjEV^cyc/opet//"/"(iwWn'a/C/zew^/>y,6thedition,2003,Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.,Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)。另外,異丁醇可利用Oxo合成,一氧化碳的催化氫化(6V/maww!s1£V7c_yc/o/ec/z.a/"(iwWn'a/C7zew/Wr少,6edition,2003,Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.,Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)或利用正丙醇的曱醇才各爾伯特濃縮(Guerbetcondensation)(Carlini等人,A/o/ec.Ca^/.A'C&w.220:215-220(2004))而生產(chǎn)。這些方法利用源于石油化學(xué)品的起始材料,通常是昂貴的,并且對于環(huán)境是不友好的。通過發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法也是已知的,其中最通常的方法生產(chǎn)丙酮,1-丁醇和乙醇的混合物,并且表示為ABE工藝(Blaschek等人,U.S.專矛J6,358,717)。通過丙酉同丁酉孚才炎菌(C7o對nWwmacefo6w0^'cwm,的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵是已知的最古老的工業(yè)發(fā)酵方法之一,已經(jīng)報道了用于生產(chǎn)這些溶劑的途徑和基因(Girbal等人,7>e"ds,"S,Wec/mo/ogy16:11-16(1998))。另外,已經(jīng)描述了表達1-丁醇的生物合成途徑(Donaldson等人,共同未決和共同擁有的美國專利申請No.11/527995),2-丁醇生物合成途徑(Donaldson等人,共同未決和共同擁有的美國專利申請No.60/796816),和異丁醇生物合成途徑(Maggio-Hall等人,共同未決和共同擁有的美國專利申請No.11/586315)的重組微生物生產(chǎn)宿主。但是,丁醇的生物生產(chǎn)據(jù)信受限于丁醇對用于發(fā)酵中宿主微生物的毒性。對1-丁醇耐受的梭菌菌林已通過化學(xué)突變(Jain等人U.S.專利5,192,673;和Blaschek等人U.S.專利6,358,717),某些類基因例如表達應(yīng)激反應(yīng)蛋白的基因的過表達(Papoutsakis等人U.S.專利6,960,465;和Tomas等人,v^//.Mzcra6/o/.69(8):4951-4965(2003》,和通過連續(xù)富集(Quratulain等人,F(xiàn)o/&A^craho/ogz'ca(Prague)40(5):467-471(1995);和Soucaille等人,CurrentMicrobiology14(5):295-299(1987))而分離。Desmond等人(^^/.£>Wra".A^'cra^o/.70(10):5929-5936(2004))報道了GroESL,一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白,在乳酸乳球菌6L(2"ococcws/ac"s,詳口類干酷專L片干菌產(chǎn)丄a"o6ac'〃ws/Mracas^Z,中的過表達生產(chǎn)了能夠在0.5%體積/體積(v/v)的1-丁醇的存在下生長的菌株。另外,已經(jīng)描述了1_丁醇耐受菌抹從河口沉積物中(Sardessai等人,C鮮e"""e歸82(6):622-623(2002))和從活性污泥中(Bieszkiewicz等人,M'cra6/o/og/ca尸o/om'ca36(3):259-265(1987))的分離。但是,對于這些技術(shù)中描述的大多數(shù)微生物,當(dāng)在37°C下生長于液體培養(yǎng)基中時,在低于2.0%w/v濃度的1-丁醇中生長被完全抑制。而且,對2-丁醇和異丁醇耐受的微生物抹在這些技術(shù)中是未知的。因此,鑒定對于1-丁醇,2-丁醇和異丁醇具有高耐受性的微生物在現(xiàn)有技術(shù)中將代表一種進步。另外,2-丁酮和乙醇是可通過利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的有價值的化合物。2-丁酮,也表示為曱基乙基酮(MEK),是廣泛利用的溶劑并且是丙酮之后最重要的商業(yè)生產(chǎn)的酮。它用作涂料,樹脂和粘合劑的溶劑,以及氧化反應(yīng)的選擇性提取物和活化劑。2-丁酮可通過省略2-丁醇生物合成途徑的最后步驟而制備(Donaldson等人,共同未決和共同擁有的美國專利申請No.60/796816)。乙醇作為替代的燃料是高度需求的。大腸埃希氏菌的遺傳修飾菌林已被用作用于乙醇生產(chǎn)的生物催化劑(Underwood等人,(2002)Appl.Environ.Microbiol.68:6263-6272).在US2003/0162271Al中已經(jīng)描述了具有提高的乙醇產(chǎn)量的運動發(fā)酵單胞菌(Zymomom^mo&7&,的遺傳修飾菌林。對于具有對2-丁酮和乙醇提高的耐受性的微生物的鑒定將提高這些化合物的生產(chǎn)。因此,需要對丁醇更耐受并且可用于生物生產(chǎn)高滴度的丁醇的微生物宿主林。本發(fā)明通過發(fā)現(xiàn)丁醇耐受微生物并發(fā)展了分離它們的方法而滿足了這一需求。另夕卜,發(fā)現(xiàn)的微生物具有對2-丁酮和乙醇的提高的耐受性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及丁醇耐受孩i生物,特別是腸球菌屬(E"&racoccw)的成員,和分離相同微生物的方法。富集微生物聚生體并選擇對丁醇的耐受。分離了當(dāng)在37。C生長于固體培養(yǎng)基上時對至少2.5。/。w/v的1-丁醇的丁醇濃度顯示出耐受性的幾種腸球菌。相應(yīng)的,在一個實施方案中本發(fā)明提供了用于分離丁醇耐受微生物的方法,所述方法包括a)提供包含微生物聚生體的微生物樣品;b)接觸在包含可發(fā)酵碳源的生長培養(yǎng)基中的微生物聚生體直到微生物聚生體成員正在生長;c)將步驟(b)中生長的微生物聚生體與丁醇接觸;和d)分離步驟(c)中存活的成員,其中丁醇耐受微生物被分離。在一個優(yōu)選實施方案中,微生物聚生體的存活成員通過包含下述步驟的方法分離i)在不存在丁醇時在液體培養(yǎng)基中生長已經(jīng)用丁醇攻擊(challenge)的聚生體中的存活成員;由此存活成員繁殖;ii)在存在丁醇時生長步驟(i)的細胞;和iii)收集在存在丁醇時生長的步驟(ii)的細胞,其中丁醇耐受微生物被分離。在另一實施方案中,本發(fā)明提供了通過本發(fā)明方法分離的丁醇耐受微生物,其中優(yōu)選的丁醇耐受微生物屬于腸球菌屬。在另一實施方案中,本發(fā)明提供了分離丁醇耐受腸球菌的方法,所述方法包括a)提供包含微生物聚生體的微生物樣品;b)在包含下述成分的生長培養(yǎng)基中為腸球菌的存在富集微生物聚生體i)可發(fā)酵碳源;和ii)竟爭物生長抑制劑;以產(chǎn)生腸球菌富集培養(yǎng)物,其中腸球菌富集培養(yǎng)物成員正在生長;c)使步驟(b)的生長的腸球菌富集培養(yǎng)物與丁醇接觸;和d)分離步驟(c)的存活成員,其中丁醇耐受腸球菌被分離。在另一實施方案中,本發(fā)明提供了具有下述特征的丁醇耐受腸球菌i)為兼性厭氧性生物;和ii)為革蘭氏陽性;和iii)為不能動的;和iv)具有球形或卵形細胞形態(tài)學(xué);和v)具有啟動在6.5%氯化鈉肉湯中和在PH9.6的肉湯中生長的能力;和vi)當(dāng)生長于固體培養(yǎng)基上時,對至少2.5。/。w/v丁醇耐受。在另一實施方案中,本發(fā)明提供的丁醇耐受腸球菌選自ATCCPTA-7478(屎腸J求菌(5V^racocc^y^"ww)PN0110),ATCC—PTA-7479(鵓雞腸球菌(^m^racoccwga〃z冊nwm,PN0048),ATCCPTA-7477(糞腸球菌(^Weracoccw/"eca/^,PN0197-10)和ATCCPTA-7480(屎腸球菌fj5Vz/^racoccwsy^e"'畫,PN0133)。在另一實施方案中,本發(fā)明提供了生產(chǎn)2-丁酮的方法,所述方法包括a)提供包含編碼2-丁酮生物合成途徑的遺傳構(gòu)建體的腸球菌,其具有下述特征i)為兼性厭氧生物;和ii)為革蘭氏陽性;和iiO為不能動的;iv)具有球形或卵形細胞形態(tài)學(xué);和v)具有啟動在6.5%氯化鈉肉湯和PH9.6肉湯中生長的能力;和vi)當(dāng)生長于固體培養(yǎng)基上時對至少2.5%w/v丁醇耐受,和b)在生產(chǎn)2-丁酮的條件下生長步驟(a)的腸球菌。對生物保藏和序列描述的簡要說明本發(fā)明的多種實施方案可從下述詳細的描述,生物保藏,和所附的序列描述中更充分地理解,其組成本申請的一部分。申請人根據(jù)國際承認用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約進行了如下生物保藏保藏者鑒定參考國際保藏編號保藏日屎腸球菌rfwferacoc"",/aec,'wwATCC:PTA-74782006年4月7曰PN0110離雞應(yīng)球霧6E"to"ococct^ATCC:PTA-74792006年4月7曰g"〃,旨,'羅JPN0048("£WeTOCoccj/aeca//sJATCC:PTA-74772006年4月7曰PN0197-10屎腸球菌^E"teracoc""/aecmwJATCC:PTA-74802006年4月7日PN0133下述序列遵守37C.F.R.1.821-1.825("包含核普酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求-序列規(guī)則")并與世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標準ST.25(1998)和EPO和PCT(細則5.2和49.5(a陽bis),和行政規(guī)程第208部分和附件C)的序列表要求一致。用于核苷酸和氨基酸序列的符號和才各式遵守37C.F.R.§1.822中設(shè)定的規(guī)則。序列表按照37CFR1.53(e)在此提供在光盤上,并且在此引入作為參考。表1用于1-丁醇生物合成途徑的基因和蛋白SEOID號的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2用于2-丁醇生物合成途徑的基因和蛋白SEOID號的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3用于異丁醇生物合成途徑的基因和蛋白SEOID號的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如實施例1所述,SEQIDNOs:39和40是用于擴增丁醇耐受菌林的16SrRNA基因的引物的核苷酸序列。SEQIDNOs:41-44是如實施例1-4所述分離的丁醇耐受腸球菌菌才朱的16SrRNA基因的核苷酸序列。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了對于醇特別是丁醇以及2-丁醇和乙醇顯示出高耐受性的微生物。本發(fā)明的微生物能夠在固體培養(yǎng)基上存在2.5%w/v或更高的1-丁醇,2-丁醇,異丁醇,2-丁酮,或乙醇時生長。另夕卜,本發(fā)明提供了分離丁醇耐受微生物的方法。這些丁醇耐受微生物可被遺傳工程化以包含丁醇生物合成途徑或2-丁酮生物合成途徑,并且可被用于生物生產(chǎn)高滴度的1-丁醇,2-丁醇,異丁醇或2-丁酮。下述定義和縮寫可用于解釋權(quán)利要求和說明書。如此處所用的術(shù)語"丁醇"指1-丁醇,2-丁醇,異丁醇,或其混合物。當(dāng)用于描述本發(fā)明的微生物時,術(shù)語"丁醇耐受微生物"和"耐受"指當(dāng)在37°C下在固體培養(yǎng)基中生長時,在2.5%w/v或更高的1_丁醇,2-丁醇,或異丁醇存在下顯示出生長,或者當(dāng)在37°C下在液體培養(yǎng)基中生長時,在2.0%w/v或更高的1-丁醇,2-丁醇,或異丁醇存在下顯示出生長的細菌或酵母。術(shù)語"微生物聚生體"指不同基因型的微生物的異源組。通過舉例的方式,微生物聚生體可以是環(huán)境樣品例如廢水污泥或土壤或堆肥或污染的水樣品;純細菌林的化學(xué)突變微生物群;包含多拷貝質(zhì)粒庫的微生物林;特定林的轉(zhuǎn)座子標記的突變體群。術(shù)語"環(huán)境樣品"指獲自環(huán)境的樣品。特別的,環(huán)境樣品可以是廢水污泥或獲自已經(jīng)暴露于丁醇和/或其他溶劑的環(huán)境的其他樣品。環(huán)境樣品包含微生物聚生體。當(dāng)應(yīng)用于微生物培養(yǎng)物并且特別是應(yīng)用于微生物聚生體的培養(yǎng)時,術(shù)語"富集,,指向聚生體細胞或微生物培養(yǎng)物提供過量的生長養(yǎng)分以增強或促進細胞的生長。術(shù)語"可發(fā)酵的碳源","碳底物"或"可發(fā)酵的碳底物"可互換使用,并且指容易地為微生物聚生體利用的碳源。可發(fā)酵的碳源包括但不限于單糖,寡糖,多糖,和一碳底物或其混合物。優(yōu)選的可發(fā)酵的碳源的非限制性名單包括單糖,例如葡萄糖,果糖,和蔗糖;以及羧酸例如脂肪酸,丁酸,和戊酸。術(shù)語"需氧條件"表示在氧氣存在下的生長條件。術(shù)語"厭氧條件"表示在氧氣不存在下的生長條件。術(shù)語"微需氧條件"表示具有低水平氧氣的生長條件(也就是,在正常大氣氧氣水平之下)。術(shù)語"丁醇生物合成途徑"指生產(chǎn)l-丁醇,2-丁醇,或異丁醇的酶途徑。術(shù)語"1-丁醇生物合成途徑"指從乙酰-輔酶A(乙酰-CoA)生產(chǎn)1-丁醇的酶途徑。術(shù)語"2-丁醇生物合成途徑"指從丙酮酸鹽生產(chǎn)2-丁醇的酶途徑。術(shù)語"2-丁酮生物合成途徑"指從丙酮酸鹽生產(chǎn)2-丁酮的酶途徑。術(shù)語"異丁醇生物合成途徑"指從丙酮酸鹽生產(chǎn)異丁醇的酶途徑。術(shù)語"乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶"指催化兩分子乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰-CoA和輔酶A(CoA)的酶。優(yōu)選的乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶是對短鏈酰基-CoA和乙酰-CoA具有底物偏好(正向反應(yīng))的乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶,并且分類為E.C.2.3.1.9[齊命名法/992,AcademicPress,SanDiego];雖然具有更寬底物范圍的酶(E.C.2.3.1.16)也將是功能性的。乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶可獲自多種來源,例如,大腸埃希氏菌(&c/7erz'c/^co/z)(GenBankNos:NP—416728,NC—000913;NCBI(國家生物信息中心)氨基酸序列,NCBI核苷酸序列),丙酮丁醇才發(fā)菌(C/oWn'Wwmace^>6wf_y//cwmJ(GenBankNos:NP一349476.1(SEQIDNO:2),NC—003030;NP—149242(SEQIDNO:4),NC—001988),枯草芽孢桿菌(Sac〃/wsra&Z/k)(GenBankNos:NP—390297,NC一000964),禾口酉良酒酵母(Sacc/zara/^ycescerev&z"e)(GenBankNos:NP—015297,NC—001148)。術(shù)語"3-羥基丁酰-CoA脫氳酶,,指催化乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰-CoA的酶。3-羥基丁酰-CoA脫氫酶可以是還原煙酰胺腺噤呤二核苷酸(NADH)-依賴性的,具有對于(S)-3-羥基丁酰-CoA或(R)-3-羥基丁酰-CoA的底物偏好,并且分別分類為E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。另外,3-羥基丁酰-CoA脫氳酶可以是還原煙酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸鹽(NADPH)-依賴性的,具有對于(S)—3—羥基丁酰—CoA或(R)-3—羥基丁?!狢oA的底物偏好,并且分別分類為E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羥基丁酰-CoA脫氳酶可從許多來源獲得,例如,丙酮丁醇梭菌(C."cetoZw(y/,ci/m)(GenBankNOs:NP—349314(SEQIDNO:6),NC—003030),枯草芽孢桿菌(SjwM/w)(GenBankNOs:AAB09614,U29084),富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(eWra//w)(GenBankNOs:ZP—0017144,NZ—AADY01000001,富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(j/ca"gem^ez^ra//z附)(GenBankNOs:YP—294481,NC—007347),和富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Ae^rop/zw)(GenBankNOs:P14697,J04987)。術(shù)語"巴豆酸酶"指催化3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)化為巴豆酰-CoA和水的酶。巴豆酸酶可具有對(S)-3-羥基丁酰-CoA或(R)-3-輕基丁酰-CoA的底物偏好,并且分別分類為E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶可^v多種來源獲得,例如,大腸埃希氏菌co//,(GenBankNOs:NP—415911(SEQIDNO:8),NC一000913),丙酮丁醇梭菌("C.ac"o6w(y/zcwwy>(GenBankNOs:NP—349318,NC—003030),枯草芽孢桿菌(^jW"/m」(GenBankNOs:CAB13705,Z99113),和豚鼠氣單胞菌(血畫o膽c謂'ae)(GenBankNOs:BAA21816,D88825)。術(shù)語"丁酰-CoA脫氫酶",也稱作轉(zhuǎn)-烯酰CoA還原酶,指催化巴豆酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁酰-CoA的酶。丁酰-CoA脫氫酶可以是NADH-依賴性的或NADPH-依賴性的,并且分別分類為E.C.1.3.1.44和E.C.1.3.1.38。丁酰-CoA脫氬酶可從多種來源獲得,例如,丙酮丁醇梭菌("C.ac"o^(y"cwm,(GenBankNOs:NP—347102(SEQIDNO:10),NC—003030),小目艮蟲(Ewg/e腦gra"7&)(GenBankNOs:Q5EU90,AY741582),山丘鏈霉菌(5V豐謂戸sco〃/脂)(GenBankNOs:AAA92890,U37135),和天藍色鏈霉菌(5^e;^omyc^coe//co/or)(GenBankNOs:CAA22721,AL939127)。術(shù)語"丁醛脫氳酶"指利用NADH或NADPH作為輔因子催化丁酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁醛的酶。對于NADH偏好的丁醛脫氫酶稱作E.C.1.2.1.57并且可獲自例如,拜氏梭菌(C/owWwm6eyen"c^)(GenBankNOs:AAD31841(SEQIDNO:12),AF157306)和丙酮丁醇梭菌廣C.acetoZw(y/zcwm(GenBankNOs:NP—149325,NC—001988)。術(shù)語"1-丁醇脫氬酶"指催化丁搭轉(zhuǎn)化為1-丁醇的酶。1-丁醇脫氫酶是醇脫氫酶的廣大家族中的亞群。1-丁醇脫氫酶可以是NADH-或NADPH-依賴性的。1-丁醇脫氫酶可獲自例如,丙酮丁醇梭菌("C."c"oZm(y/,cwm,(GenBankNOs:NP—149325,NC—001988;NP—349891(SEQIDNO:14),NC一003030;和NP—349892(SEQIDNO:16),NC—003030)和大腸埃希氏菌co/z'J(GenBankNOs:NP—417484,NC—000913)。術(shù)語"乙酰乳酸合酶",也稱作"乙酰羥酸合酶",指具有催化兩分子的丙酮酸轉(zhuǎn)化為一分子的a-乙酰乳酸的酶活性的多肽。乙酰乳酸合酶,稱作EC2.2.1.6[以前為4.1.3.18]Mwe"c/^w^/992,AcademicPress,SanDiego),可以是依賴于輔因子硫胺焦磷酸鹽的。適當(dāng)?shù)囊阴H樗岷厦缚梢垣@自多種來源,例如,枯草芽孢桿菌65ac/'〃Mw歸W(GenBankNos:AAA22222NCBI(國家生物技術(shù)信息中心)氨基酸序列,L04470NCBI核香酸序列),土生克雷伯氏菌卩A7eZ^e〃a/簡g謹j(GenBankNos:AAA25055,L04507),和肺炎克雷伯氏菌0:/e^e〃a戸謂o"認y>(GenBankNos:AAA25079(SEQIDNO:20),M73842(SEQIDNO:19)。術(shù)語"乙酰乳酸脫羧酶"指具有催化a-乙酰乳酸鹽轉(zhuǎn)化為乙偶姻的酶活性的多肽。乙酰乳酸脫羧酶稱作EC4.1.1.5,并且可獲自例如,枯草芽孢桿菌6^"〃^^6"7^J(GenBankNos:AAA22223,L04470),土生克雷伯氏菌(^7eZwe〃a^rn'ge""j(GenBankNos:AAA25054,L04507)和肺炎克雷伯氏菌廣A7eZwW/"/7"ewmomae,(SEQIDNO:18(氨基酸)SEQIDNO:17(核苷酸))。術(shù)語"丁二醇脫氫酶"也稱作"乙偶姻還原酶",指具有催化乙偶姻轉(zhuǎn)化為2,3-丁二醇的酶活性的多肽。丁二醇脫氫酶是醇脫氬酶的廣大家族中的亞群。丁二醇脫氳酶可具有生產(chǎn)醇產(chǎn)品中R-或S-立體化學(xué)的特異性。S-特異性丁二醇脫氫酶稱作EC1.1.1.76并且可獲自,例如,肺炎克雷伯氏菌n/eb.e〃a戸謂固aej(GenBankNos:BBA13085(SEQIDNO:22),D86412。A-特異性丁二醇脫氬酶稱作EC1.1丄4并且可獲自,例如蠟樣芽孢桿菌(5""'〃mcere^)(GenBankNos.NP—830481,NC—004722;AAP07682,AE017000),和乳酸乳球菌a""ococcws/a",:d(GenBankNos.AAK04995,AE006323)。術(shù)語"丁二醇脫水酶"也稱作"二醇脫水酶"或"丙二醇脫水酶",指具有催化2,3-丁二醇轉(zhuǎn)化為2-丁酮的酶活性的多肽,2-丁酮也稱作甲基乙基酮(MEK)。丁二醇脫水酶可利用輔因子腺苷鈷胺素。腺苷鈷胺素-依賴性酶稱作EC4.2.1.28,并且可獲自,例如,產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(GenBankNos:BAA08099(a亞基)(SEQIDNO:24),BAA08100(P亞基)(SEQIDNO:26),和BBA08101(y亞基)(SEQIDNO:28),(注意這三種亞基對于活性都是需要的),D45071)。術(shù)語"2-丁醇脫氪酶"指具有催化使2-丁酮轉(zhuǎn)化為2-丁醇的酶活性的多肽。2-丁醇脫氫酶是醇脫氫酶的廣大家族中的亞群。2-丁醇脫氪酶可以是NADH或NADPH-依賴性的。NADH-依賴性酶稱作EC1.1.1.1,并且可獲自例如,赤紅球菌6R/zot/ococcwn^er,(GenBankNos:CAD36475(SEQIDNO:30),AJ491307(SEQIDNO:29))。NADPH-依賴性酶稱作EC1.1.1.2并且可獲自例如,激烈熱球菌(尸戶coc,/w"o愿)(GenBankNos:AAC25556,AF013169)。術(shù)語"乙酰羥酸異構(gòu)還原酶"或"乙酰羥酸還原異構(gòu)酶"指利用NADPH(還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽)作為電子供體催化乙酰乳酸鹽轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基異戊酸鹽的酶。優(yōu)選的乙酰羥酸異構(gòu)還原酶稱作EC1丄1.86,并且序列可獲自大量的微生物,包括但不限于,大腸埃希氏菌(&c/zenc/2&co")(GenBankNos:NP一418222(SEQIDNO:32),NC—000913(SEQIDNO:31)),酉良酒酵母(cwei^/ae)(GenBankNos:NP—013459,NC—001144),海沼曱烷球菌(她,/^wococcwsmar—/wtfo)(GenBankNos:CAF30210,BX957220),和枯草芽孢桿菌r曲/fe;(GenBankNos:CAB14789,Z99118)。術(shù)語"乙酰羥酸脫水酶"指催化2,3-二羥基異戊酸鹽轉(zhuǎn)化為-酮異戊酸鹽的酶。優(yōu)選的乙酰羥酸脫水酶稱作EC4.2丄9。這些酶可獲自大量《敖生物,包括但不限于,大腸埃希氏菌「£.co/z'J(GenBankNos:YP026248(SEQIDNO:34),NC000913(SEQIDNO:33》,釀酒酵母(S.C6簡廳)(GenBankNos:NP—012550,NC—001142),海沼甲烷球菌(M,加〃pfl/wtfo)(GenBankNos:CAF29874,BX957219),和枯草芽孢桿菌^0jz^/7/^,(GenBankNos:CAB14105,Z99115)。術(shù)語"支鏈-酮酸脫羧酶"指催化-酮異戊酸鹽轉(zhuǎn)化為異丁醛和二氧化石友的酶。優(yōu)選的支纟連-酮酸脫f友酶稱作EC4.1.1.72,并且可獲自許多來源,包括但不限于,乳酸乳球菌aa"ococc^/ac^,(GenBankNos:AAS49166,AY548760;CAG34226(SEQIDNO:36),AJ746364,^^另寒沙、門氏菌(5Vif/mowe〃a(yp/z/wwn.wm)(GenBankNos:NP—461346,NC一003197),和丙酮丁醇梭菌(C/o^Wwmaceto^(y"cwm)(GenBankNos:NP—149189,NC001988)。術(shù)語"支鏈醇脫氫酶"指催化異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇的酶。優(yōu)選的支鏈醇脫氫酶稱作EC1.1.1.265,但也可歸類到其他醇脫氬酶之下(特別是,EC1.1.1.1或1.1.1.2)。這些酶利用NADH(還原煙酰胺腺苷二核苦酸)和/或NADPH作為電子供體,并且可獲自多種來源,包括但不限于,酉良酒酵母(S.cerev"、,ae)(GenBankNos:NP—010656,NC—001136;NP—014051,NC—001145),大腸埃希氏菌廣E.co"J(GenBankNos:NP—417484(SEQIDNO:38),NC—000913(SEQIDNO:37)),和丙酮丁醇梭菌廣C.固fo—"cww;(GenBankNos:NP—349892,NC一003030)。術(shù)語"基因"指能夠作為特定蛋白表達的核酸片段,任選地包括在編碼序列之前(5'非編碼序列)和之后(3'非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。"天然基因"指在自然界發(fā)現(xiàn)具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因。"嵌合基因"指不是天然基因的任何基因,包含沒有在自然界一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和編碼序列。相應(yīng)地,嵌合基因可包含源于不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列,或源于相同來源但以與在自然中發(fā)現(xiàn)的不同方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。"內(nèi)源基因"指位于生物的基因組中其天然位點的天然基因。"外來"基因指通常在宿主生物中沒有發(fā)現(xiàn)但通過基因轉(zhuǎn)移引入宿主生物的基因。外來基因可包含插入非天然生物的天然基因,或嵌合基因。"轉(zhuǎn)基因"是通過轉(zhuǎn)化方法引入基因組的基因。如此處所用,術(shù)語"編碼序列"指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。"適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列"指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列),之間或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列,其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄,RNA加工或穩(wěn)定性,或翻譯。調(diào)節(jié)序列可包括啟動子,翻譯引導(dǎo)序列,內(nèi)含子,聚腺苷酸化識別序列,RNA加工位點,效應(yīng)物結(jié)合位點和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。術(shù)語"啟動子"指能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達的DNA序列。一般而言,編碼序列位于啟動子序列的3'。啟動子整體可獲自包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解不同的啟動子可指引不同組織或細胞類型中,或不同發(fā)育階段中,或響應(yīng)于不同環(huán)境或生理條件的基因表達。在大多數(shù)細胞類型中在大多數(shù)時候引起基因表達的啟動子通常稱作"組成型啟動子"。進一步認識到既然在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切邊界沒有完全確定,不同長度的DNA片段可具有等同的啟動子活性。術(shù)語"可操縱連接"指核酸序列與單個核酸片段的聯(lián)合,使得一種的功能被另一種影響。例如,啟動子與編碼序列可操縱連接,此時它能夠影響編碼序列的表達(也就是,編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)。編碼序列可與調(diào)節(jié)序列以正向或反向可操縱連接。術(shù)語"表達",如此處所用,指源于本發(fā)明的核酸片段的正義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定的積累。表達也可指mRNA翻譯為多肽。如此處所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指核酸片段轉(zhuǎn)移入宿主生物,導(dǎo)致遺傳上穩(wěn)定地遺傳。包含轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物稱作"轉(zhuǎn)基因的"或"重組的"或"轉(zhuǎn)化的"生物。術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"指經(jīng)常攜帶基因的染色體外元件,其不是細胞的中心新陳代謝(centralmetabolism)的部分,并且通常為環(huán)形雙鏈DNA片段的形式。所述元件可以是源于任何來源的自主復(fù)制序列,基因組整合序列,噬菌體或核苷酸序列,線性或環(huán)形的單或雙鏈DNA或RNA,其中許多核苦酸序列已被連接或重組入唯一的構(gòu)建體,其能夠?qū)幼悠魏瓦x擇的基因產(chǎn)品的DNA序列與適當(dāng)?shù)?,未翻譯序列引入細胞中。"轉(zhuǎn)化載體"指包含外來基因并且具有外來基因之外促進特定宿主細胞的轉(zhuǎn)化的元件的特定載體。如此處所用,術(shù)語"密碼子簡并性"指允許核苷酸序列改變而不影響編碼多肽的氨基酸序列的遺傳密碼中的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道特定宿主細胞在使用核苷酸密碼子以指定(specify)給定的氨基酸中顯示出的"密碼子-偏好"。因此,當(dāng)為宿主細胞中提高的表達合成基因時,期望設(shè)計基因使得密碼子使用的頻率接近宿主細胞的優(yōu)選密碼子使用頻率。術(shù)語"密碼子最優(yōu)化"當(dāng)指用于轉(zhuǎn)化多種宿主的核酸分子的基因或編碼區(qū)域時,指核酸分子的基因或編碼區(qū)域的密碼子的改變以反映宿主生物的典型密碼子使用而不改變DNA編碼的多肽。此處利用的標準重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域公知的,并且4^述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.禾口Maniatis,T.,Mo/ecw/orC/om力g,'jjLa6or自^y她鼎a/,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)(此后表示為"Maniatis");和Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Ex/7e"附e船vW/7zGeweF釘io朋,ColdSpringHarborLaboratoryColdPressSpringHarbor,NY(1984);和Ausubel,F.M.等人,CwTeW尸rafoco/"'wMo/ecw/arWo/ogy,GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987)出版。此處使用的術(shù)語"發(fā)明"或"本發(fā)明"意味著一般地應(yīng)用于目前或以后修改和補充的權(quán)利要求,或說明書所述的所有實施方案。在一個實施方案中,本發(fā)明提供了分離丁醇耐受微生物的方法。如下面詳細描述的,該方法包含在生長條件下富集微生物聚生體并使富集的微生物聚生體接觸丁醇。還提供了通過本發(fā)明方法鑒定的顯示出對醇特別是丁醇高度耐受的微生物。這些丁醇耐受微生物可被遺傳工程化以包含丁醇生物合成途徑并用于生物生產(chǎn)高滴度的1-丁醇,2-丁醇,或異丁醇。丁醇耐受微生物的分離丁醇耐受微生物可從環(huán)境樣品例如廢水污泥和來自暴露于丁醇和/或其他溶劑的其他環(huán)境的樣品中分離。例如,環(huán)境樣品可獲自化工廠的廢水處理設(shè)備。工業(yè)廢水生物反應(yīng)器是具有期望抗性顯型的微生物的環(huán)境樣品的特別好的來源,因為在多種有機溶劑的存在下的長期生長(Bramucci等人,7>emfeB,o化c/mo/.18:501-505(2000))。丁醇耐受微生物也可以分離自其他微生物樣品。例如,微生物樣品可以是純細菌株的化學(xué)突變的微生物群,包含多拷貝質(zhì)粒庫的微生物抹,或特定抹的轉(zhuǎn)座子標記的突變體。包括混合群體的任何這些微生物樣品可以說包括了微生物聚生體。在本發(fā)明的一個實施方案中,微生物樣品在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)以富集其包含的微生物聚生體直到聚生體成員生長。在一個實施方案中培養(yǎng)物在對數(shù)期中生長。生長培養(yǎng)基包含可發(fā)酵碳源并且可包括適當(dāng)水平的氮,磷,硫和鹽。適當(dāng)水平的對于微生物聚生體生長必需的這些養(yǎng)分是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,并且下面將提供非限制性的例子??砂l(fā)酵碳源可以是被微生物聚生體成員容易地代謝的任何碳源,包括但不限于,蔗糖,果糖,葡萄糖,和其混合物??砂l(fā)酵碳源還可以是羧酸例如脂肪酸,丁酸或戊酸。典型地,>碳源以從大約0.1%重量/體積w/v到大約1.5%w/v的濃度存在。氮源可以是任何適當(dāng)?shù)牡?,包括但不限于銨鹽或酵母提取物。氮源典型地以大約10mM的濃度存在于生長培養(yǎng)基中。磷可以磷酸鹽的形式存在于培養(yǎng)基中,例如磷酸鈉和磷酸鉀,其典型地以大約50mM的濃度存在于生長培養(yǎng)基中。好u可以硫酸鹽的形式存在于培養(yǎng)基中,例如硫酸鈉或硫酸銨,其典型地以大約10mM的濃度存在于生長培養(yǎng)基中。其他的鹽包括但不限于,氯化鎂,氯化鈣,氯化錳,氯化鐵,氯化亞鐵,氯化鋅,氯化銅,氯化鈷,和鉬酸鈉。這些鹽典型地以大約1fxM到大約2mM的濃度存在于生長培養(yǎng)基中。生長培養(yǎng)基還可包含維生素例如鹽酸硫胺素。富集培養(yǎng)物在大約25。C到大約60。C的溫度下生長一段時間,所述時間足以使樣品中微生物聚生體顯示出生長,典型的為大約12小時到大約24小時。培養(yǎng)物可在厭氧,微需氧,或需氧條件下生長,攪拌或不攪拌。如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地理解的,厭氧條件是缺乏氧的條件,需氧條件是包含氧的條件,微需氧條件是其中氧氣以低于空氣中發(fā)現(xiàn)的水平也就是低于21%存在的條件。培養(yǎng)物生長可以通過測量光密度而監(jiān)測,典型地以600nm波長。生長富集培養(yǎng)物然后與丁醇接觸。這種接觸可通過用包含丁醇的新鮮生長培養(yǎng)基稀釋富集培養(yǎng)物而完成。在此點中富集培養(yǎng)物生長于對數(shù)期是特別適合的。使用的丁醇濃度是大約0.8%w/v到大約3.0%w/v,優(yōu)選大約0.8%w/v到大約2.0%w/v。在一個實施方案中,丁醇主要是1-丁醇。在另一實施方案中,丁醇主要是2-丁醇。在另一實施方案中,丁醇主要是異丁醇。如此處所用,主要表示至少總丁醇重量的大約90%。另外,可使用包含兩種或多種1-丁醇,2-丁醇和異丁醇的多種組合的混合物。培養(yǎng)物生長一段時期直到觀察到顯著的生長。任選地,顯示出顯著生長的培養(yǎng)物可再次與丁醇接觸一次或多次以選擇對丁醇提高的耐受。每次接觸可用逐漸增高的丁醇濃度來完成。然后分開與丁醇接觸的微生物聚生體以分離單個抹。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知涉及液體或固體培養(yǎng)基的多種細胞分離方法。例如,與丁醇接觸的微生物聚生體可平板接種于固體培養(yǎng)基上,例如營養(yǎng)瓊脂,LuriaBertani(LB)瓊脂,改良的LB瓊脂(也就是,補充了可發(fā)酵碳源和鹽的LB瓊脂),或具有瓊脂的最小富集培養(yǎng)基,其可包含或不包含丁醇。如果丁醇存在于固體培養(yǎng)基中,其濃度典型地為大約1.2%w/v到大約3%w/v。生長培養(yǎng)物直到形成集落。然后利用本領(lǐng)域已知的方法分離集落以提供丁醇耐受微生物。例如,如下所述,來自固體培養(yǎng)基的集落可利用本領(lǐng)域已知的方法收集和鑒定。可選地,來自固體培養(yǎng)基的集落可接種到生長培養(yǎng)基上(例如,最小富集培養(yǎng)基),液體的或固體的,其不包含丁醇。生長之后,可收集和鑒定細胞。任選地,來自集落的細胞可在存在丁醇時在液體或固體生長培養(yǎng)基中(例如,最小富集培養(yǎng)基)生長。典型地,培養(yǎng)基中的丁醇濃度是大約1.2%w/v到大約3。/。w/v。收集在存在丁醇時生長的細胞。分離的微生物可利用本領(lǐng)域已知的方法鑒定,例如,16S核糖體RNA(rRNA)基因測序,脂肪酸分布圖(profile)分析,或rRNA基因指紋技術(shù)(ribotyping)。通過本發(fā)明方法分離的丁醇耐受微生物當(dāng)在固體培養(yǎng)基上在37°C下生長時對至少2.5%丁醇(也就是,1-丁醇,2-丁醇,或異丁醇)耐受,或當(dāng)在液體培養(yǎng)基上在37。C下生長時對至少2.0%w/v丁醇耐受。應(yīng)該注意微生物的丁醇耐受當(dāng)在固體培養(yǎng)基上生長時典型地比當(dāng)在液體培養(yǎng)基上生長時要高。另外,微生物的丁醇耐受依賴于生長溫度,典型地在更低生長溫度下更高。通過用一種丁醇與富集的微生物聚生體接觸分離的微生物通常對其他丁醇也是耐受的。例如,利用1-丁醇分離的微生物對2-丁醇和異丁醇也是耐受的。富集培養(yǎng)物也可在恒化生物反應(yīng)器中生長并與連續(xù)培養(yǎng)物中的丁醇接觸。恒化生物反應(yīng)器中的細胞可通過適當(dāng)調(diào)整稀釋率而以不同生長率生長。可精確控制恒化培養(yǎng)物的通風(fēng)和PH,產(chǎn)生更高的細胞密度。另外,可通過調(diào)整給料組合物以漸增的濃度逐漸添加丁醇。在富集培養(yǎng)物與丁醇在生物反應(yīng)器中接觸之后,如上所述分離并鑒定丁醇耐受微生物。未預(yù)料到的,此處實施例中利用本發(fā)明方法鑒定的大多數(shù)丁醇耐受微生物是屬于腸球菌屬的細菌。腸球菌是兼性(facultively)厭氧,革蘭氏陽性,不能動的,球形或卯形的細胞,具有啟動在6.5%氯化鈉肉湯和PH9.6的肉湯中生長的能力(5e廠gey:vMcmwa/o/S""e〃.o/ogy,Vol2,Sneath等人,Eds.;Williams&Wilkins,Baltimore,MD,1986,pp.1063-1065)。本發(fā)明的丁醇耐受腸球菌菌抹的另外的特征是SEQIDNOs:41,42,43,和44所示16SrRNA基因序列。分離丁醇耐受微生物的本方法可被修飾以選擇性分離丁醇耐受腸球菌。在此實施方案中,為腸球菌的存在在包含如上所述的可發(fā)酵碳源,適當(dāng)水平氮,磷,硫,和鹽,以及功能為抑制腸球菌之外的微生物生長的"竟爭物生長抑制劑"的生長培養(yǎng)基中富集來自環(huán)境樣品的微生物聚生體。適當(dāng)?shù)木範幬锷L抑制劑包括但不限于膽汁,疊氮化物,和其混合物。使用的竟爭物生長抑制劑的最佳量依賴于微生物聚生體和抑制劑的類型,并且可利用常規(guī)實驗確定。如上所述腸球菌富集培養(yǎng)物生長到對數(shù)期并且與丁醇接觸。如上所述然后分離并鑒定丁醇耐受腸球菌菌林。分離的丁醇耐受腸球菌菌抹可以被遺傳工程化以包含編碼丁醇生物合成途徑的遺傳構(gòu)建體并且在適當(dāng)條件下生長以生產(chǎn)丁醇。丁醇生物合成途徑可以是1-丁醇、2-丁醇或異丁醇生物合成途徑。1-丁醇生物合成途徑Donaldson等人在共同未決和共同擁有的美國專利申請No.11/527995中描述了生產(chǎn)1-丁醇的生物合成途徑,其在此全文引入作為參考。該生物合成途徑包含下述底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA,例如如被SEQIDNO:1或3給出的基因編碼的乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶催化的那樣;b)乙酰乙酰-CoA到3-羥基丁酰-CoA,例如如凈皮SEQIDNO:5給出的基因編碼的3-羥基丁酰-CoA脫氬酶催化的那樣;c)3-羥基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA,例如如被SEQIDNO:7給出的基因編碼的巴豆酸酶催化的那樣;d)巴豆酰-CoA到丁酰-CoA,例如如被SEQIDNO:9給出的基因編碼的丁酰-CoA脫氬酶催化的那樣;e)丁酰-CoA到丁醛,例如如一皮SEQIDNO:ll給出的基因編碼的丁醛脫氳酶催化的那樣;和f)丁醛到1-丁醇,例如如一皮SEQIDNO:13或15給出的基因編碼的1-丁醇脫氬酶催化的那樣。該途徑不需要ATP并且產(chǎn)生NAD+和/或NADP+,因此,它與產(chǎn)生乙酰-CoA的中心新陳代謝(centralmetabolicroute)途徑達成平衡。2-丁醇和2-丁酮生物合成途徑Donaldson等人在共同未決和共同擁有的美國專利申請No.60/796816中描述了生產(chǎn)2-丁醇和2-丁酮的生物合成途徑,其在此全文引入作為參考。一種2-丁醇生物合成途徑包含下述底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a)丙酮酸鹽到oc-乙酰乳酸鹽,例如如一皮SEQIDNO:19給出的基因編碼的乙酰乳酸合酶催化的那樣;b)a-乙酰乳酸鹽到乙偶姻,例如如^皮SEQIDNO:17給出的基因編碼的乙酰乳酸脫羧酶催化的那樣;c)乙偶姻到2,3-丁二醇,例如如尋皮SEQIDNO:21給出的基因編碼的丁二醇脫氫酶催化的那樣;d)2,3-丁二醇到2-丁酮,例如如4皮SEQIDNOs:23,25和27給出的基因編碼的丁二醇脫水酶催化的那樣;e)2-丁酮到2-丁醇,例如如被SEQIDNO:29給出的基因編碼的2-丁醇脫氳酶催化的那樣。省略上述途徑的最后步驟(e)提供了生產(chǎn)2-丁酮,也稱為甲基乙基酮(MEK)的生物合成途徑。異丁醇生物合成途徑Maggio-Hall等人在共同未決和共同擁有的美國專利申請No.11/586315中描述了生產(chǎn)異丁醇的生物合成途徑,其在此全文引入作為參考。一種異丁醇生物合成途徑包含下述底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a)丙酮酸鹽到乙酰乳酸鹽,例如如被SEQIDNO:19給出的基因編碼的乙酰乳酸合酶催化的那樣;b)乙酰乳酸鹽到2,3-二羥基異戊酸鹽,例如如一皮SEQIDNO:31給出的基因編碼的乙酰羥酸異構(gòu)還原酶催化的那樣;c)2,3-二羥基異戊酸鹽到a-酮異戊酸鹽,例如如被SEQIDNO:33給出的基因編碼的乙酰羥酸脫水酶催化的那樣;d)ct-酮異戊酸鹽到異丁醛,例如如被SEQIDNO:35給出的基因編碼的支鏈酮酸脫羧酶催化的那樣;和e)異丁醛到異丁醇,例如如被SEQIDNO:37給出的基因編碼的支鏈醇脫氫酶催化的那樣。用于丁醇生產(chǎn)的腸球菌宿主的構(gòu)建可利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)構(gòu)建包含編碼一種用于將可發(fā)酵碳底物轉(zhuǎn)化為丁醇的酶途徑的必需基因的重組,丁醇耐受腸球菌菌林。糞腸球菌65V2/^racoccw《/aec"/z'W和尿腸球菌(^fiVz/^racoccw^/aecz'應(yīng)j的基因組序列是已知的(國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫)。這些細菌具有37%的G+C含量。鶉雞腸J求菌(^7&racoccwsg"〃z力arwwJ與糞腸球菌(^"政racoccws/aeca//《,和尿腸球菌6EV7,eracoccz^7^e"'騰,密切相關(guān)。本發(fā)明中,編碼一種上述的丁醇生物合成途徑的酶的基因可分離26自多種來源(見上述)。獲得來自細菌基因組的期望的基因的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域普通的并且公知的。例如,如果基因序列是已知的,可設(shè)計引物,并且利用標準引物定向擴增方法例如聚合酶鏈式反應(yīng)(美國專利No.4,683,202)擴增期望的序列以獲得一定量的適合于克隆入轉(zhuǎn)化載體的DNA。如果要分離異源于已知序列的基因,適合的基因組文庫可通過限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生,并且用具有期望的基因序列的互補序列的探針篩選。一旦序列被分離,DNA可利用標準引物-定向擴增方法例如聚合酶鏈式反應(yīng)(美國專利NO.4,683,202)進行擴增,以獲得一定量的適合于利用適當(dāng)載體的轉(zhuǎn)化的DNA。用于為在異源宿主中表達的密碼子最優(yōu)化的工具是可容易地獲得的。一旦相關(guān)途徑基因被鑒定并且^皮分離,它們可通過本領(lǐng)域/〉知的方法插入載體并被轉(zhuǎn)化入丁醇耐受腸球菌宿主。對于腸球菌的轉(zhuǎn)化有用的載體是已知的(見下述)。典型地,載體包含指引插入的DNA片段的轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列,可選擇的標記物,和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。適當(dāng)?shù)妮d體包含插入的DNA片段的5'區(qū)域,其包含轉(zhuǎn)錄起始控制物,和DNA片段的3,區(qū),其控制轉(zhuǎn)錄終止。兩種控制區(qū)域可獲自與轉(zhuǎn)化的宿主細胞同源的基因,雖然可以理解所述控制區(qū)域還可獲自與特定生產(chǎn)宿主非天然的基因。起始控制區(qū)域或啟動子,其對于驅(qū)動在期望的腸球菌宿主細胞中的相關(guān)途徑編碼區(qū)域區(qū)域的表達是有用的,可獲自其他乳酸細菌或其他革蘭氏陽性生物。一種非限制性例子是來自乳球菌的啟動子。終止控制區(qū)域還可獲自優(yōu)選宿主或相關(guān)細菌的多種天然基因。任選地,終止位點可以是非必需的,然而,如果包括是最優(yōu)選的。腸球菌屬屬于乳桿菌屬(Z^c^Z^c/〃"/w)家族并且用于乳桿菌(丄(2"o6(2CZ'〃WS人才古草芽孑包4干菌廣5ad〃WSSW6"http://51人和鏈J求菌(5Vr印^coccz^,的許多質(zhì)粒和載體可用于腸J求菌。適合的載體的非限制性例子包括pAMpi及其衍生物(Renault等人,183:175-182(1996);和O,Sullivan等人,G隱137:227-231(1993));pMBBl和pHW800,pMBBl的一種衍生物(Wyckoff等人J///.Tl^cra6,W.62:1481-1486(1996));pMGl,—種接合質(zhì)粒(Tanimoto等人J.184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等人,^op/.E"vz廠o".A^c尸o&o/.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等人,J///.Eww>^.Mc威o/.67:1262-1267(2001》;和pAT392(Arthur等人,血,脂cra6.爿ge"^C/zewW/z^:38:1899-1903(1994))。利用來自乳球菌的mW啟動子的糞腸球菌(五./""a/",的表達質(zhì)粒也可利用(Eichenbaum等人,y^p/.A/zcroZ^/.64:2763-2769(1998)。另外,用于在屎腸球菌(五./ae"wmJ染色體中基因置換的載體可被使用(Nallaapareddy等人,J/;/.£>n;z>o.A^cro&o/.72:334-345(2006》。用于丁醇生物合成途徑的多種基因可被組裝入任何適當(dāng)?shù)妮d體,例如上述的那些。密碼子可為表達基于乂人糞腸J求菌("5V7&racocc船/aeca/z^,或屎腸J求菌("5V&racoccz^/ae"'wm7的基因組序列推導(dǎo)出的密碼子索引(codonindex)進行最優(yōu)化。質(zhì)??衫帽绢I(lǐng)域已知的方法引入丁醇耐受宿主細胞,所述方法例如Cmz-Rodz等人(Mo/ecw/"rGe"",'cs顯^/Ge"o脂"224:1252-154(1990))所述電穿孔,或Tanimoto等人(</.Ba"e"o/.184:5800-5804(2002))和Grohamann等人(A^cra6zo/.A/o/.Ao/.Wev.67:277-301(2003))所述接合。發(fā)酵培養(yǎng)基用于丁醇生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基必須包含適當(dāng)?shù)奶嫉孜?。適當(dāng)?shù)牡孜锟砂ǖ幌抻趩翁抢缙咸烟呛凸牵烟抢缛樘腔蛘崽?,多糖例如淀粉或纖維素,或其混合物和來自可再生飼料例如干酪乳清滲透物,玉米漿,糖用甜菜蜂蜜,和大麥芽的未純化混合物。盡管預(yù)期上述碳底物和其混合物都適用于本發(fā)明,優(yōu)選的碳底物是葡萄糖,果糖和蔗糖。除了適當(dāng)?shù)奶嫉孜镏?,發(fā)酵培養(yǎng)基必須包含對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的,適合于培養(yǎng)物的生長和促進丁醇生產(chǎn)必需的酶途徑的適當(dāng)?shù)牡V物質(zhì),鹽,輔因子,緩沖液和其他成分。培養(yǎng)條件典型地,細胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長于大約25。C到大約40°C的溫度范圍內(nèi)。本發(fā)明中適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基是普通的商業(yè)制備的培養(yǎng)基例如LunaBertani(LB)肉湯,Sabouraud右旋糖(SD)肉湯或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。還可使用其他已知成分的或合成的生長培養(yǎng)基,并且用人員是已知的。已知的直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝物抑制的試劑例如環(huán)腺苷2,3,-一磷酸鹽也可并入發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵的適當(dāng)?shù)腜H范圍是pH5.0到pH9.0,其中pH6.0到pH8.0作為起始條件是優(yōu)選的。發(fā)酵可在需氧或厭氧條件下進行,其中厭氧或微需氧條件是優(yōu)選的。工業(yè)化分批和連續(xù)發(fā)酵丁醇可利用分批發(fā)酵方法生產(chǎn)。經(jīng)典的分批發(fā)酵是封閉的系統(tǒng),其中培養(yǎng)基的組分在發(fā)酵開始設(shè)定,并且在發(fā)酵過程中不進行人工改變。標準分批系統(tǒng)的變體是補料-分批系統(tǒng)。補料-分批發(fā)酵方法也適合于本發(fā)明,并且包含典型的分批系統(tǒng)除了當(dāng)發(fā)酵進行時增量添加培養(yǎng)基中具:限:量的底物時,、二料-分批系統(tǒng)是有用的。、分批:補料_分批發(fā)酵是本領(lǐng)域中普通的并且是公知的,其例子可在ThomasD.Brockinfi/o/^c/wo/ogy:爿7kx/6ooAq/Vwc/wWr/"/AZ/cro/n'o/ogy,SecondEdition(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.,orDeshpande,MukundV.,^//.Szoc/zem.S/o^c/mo/.,36:227,(1992)中找到,其全文在此引入作為參考。丁醇還可利用連續(xù)發(fā)酵方法生產(chǎn)。連續(xù)發(fā)酵是開放的系統(tǒng),其中已知成分的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)添加到生物反應(yīng)器中并且同時移除等量的條件培養(yǎng)基以處理。連續(xù)發(fā)酵通常包含恒定高密度的培養(yǎng)物,其中細胞主要在對數(shù)生長期。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)影響細胞生長或最終產(chǎn)物濃度的一種因素或任何數(shù)目的因素。調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵方法的養(yǎng)分和生長因素和最大化產(chǎn)物形成率的技術(shù)是工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域公知的,并且上述Brock描述了多種方法。預(yù)期可利用分批,補料-分批或連續(xù)方法進行丁醇的生產(chǎn),并且任何發(fā)酵模式是適合的。另外,預(yù)期細胞可固定在底物上作為完整細胞催化劑并在發(fā)酵條件的作用下進行丁醇生產(chǎn)。用于從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離丁醇的方法生物生產(chǎn)的丁醇可從發(fā)酵培養(yǎng)基中利用本領(lǐng)域已知用于ABE發(fā)酵的方法分離(見例J(口Durre,4P/^.A//cra&》/.S/o"c/wo/.49:639-648(1998),Groot等人,尸ra固.腸c/縱27:61-75(1992),和其參考文獻)。例如,固體可通過離心,過濾,傾析等從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除。然后,丁醇可利用例如蒸餾,共沸蒸餾,液-液萃取,吸附,氣提,膜蒸發(fā),或全蒸發(fā)從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。實施例本發(fā)明進一步在下述實施例中被限定。應(yīng)理解這些實施例,顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的同時,僅僅作為例示的方式給出。從上述討論和這些實施例中,本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的本質(zhì)特征,并且在不偏離本發(fā)明的精神和范圍之下對本發(fā)明作出多種改變和修飾以適應(yīng)多種用途和條件。使用的縮略語的含義如下所述"min"表示分鐘,"h"表示小時,"sec"表示秒,》L"表示微升,"mL"表示毫升,"L"表示升,"nm,,表示納米,"mm,,表示毫米,"cm"表示厘米,")tim"表示微米,"mM"表示毫摩爾,"M"表示摩爾,"mmol"表示毫摩爾,'Vmole"表示微摩爾,"g"表示克,、g"表示微克,"mg"表示毫克,"rpm"表示轉(zhuǎn)每分鐘,"w/v"表示重量/體積,"OD"表示光學(xué)密度,"OD6。。"表示在600nm波長下測量的光學(xué)密度,"OD595"表示在595nm波長下測量的光學(xué)密度,"IC50"表示導(dǎo)致50%生長抑制的丁醇濃度,"GCMS"表示氣相色譜-質(zhì)語,"HPLC,,表示高效液相色語。一般方法用于實施例的標準重組DNA和分子克隆#支術(shù)是本領(lǐng)域7>知的,并且描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.禾口Maniatis,T.,M/ecw/arC7om'"g.'jZ^orator少Mw認/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989,byT.J.Silhavy,M.L.Bennan,和L.W.Enqmst,Expe廠/膨船w//1/GeweF認.ow,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1984,和Ausubel,F.M.等人,Cwr固f尸ratocoA〃7M^/ecw/ar說o/ogy,GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,N.Y.,1987。適合于細菌培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域公知的。適合于用于下述實施例的才支術(shù)可在A^"wfl/o/Mef/zoA/orGe"era/5""eno/ogy,PhillippGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.KriegandG.BriggsPhillips,eds.,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.,1994中或ThomasD.Brock:j8/她c/mo/ogyz」re^ooA。/7m/w欲/a/Mcra6z'o/og_y,SecondEdition,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA,1989中找到。用于細菌細胞的生長和維持的所有的試劑,限制性酶和材料除了另夕卜說明均獲自AldrichChemicals(Milwaukee,WI),BDDiagnosticSystems(Sparks,MD),LifeTechnologies(Rockville,MD),orSigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)。實施例1丁醇耐受微生物的分離本實施例的目的是分離丁醇耐受微生物。環(huán)境樣品獲自幾種廢水處理地點并且在搖瓶中包含1-丁醇的富集培養(yǎng)物中生長。丁醇耐受細菌菌才朱^皮分離并鑒定為屎腸3求菌fj5V^eracoccw《/aecz力m義環(huán)境污泥樣品獲自位于幾種E.I.duPontdeNemoursandCompany地點的廢水處理設(shè)備。對每種樣品通過用在10mL最小富集培養(yǎng)基(也就是,lOmM辟L酸銨,50mM磷酸鉀緩沖液,pH7.0,2mMMgCl2,0.7mMCaCl2,50一MnCl2,1一FeCl3,1一ZnCl2,1.72(iMCuCl2,2.53CoCl2,2.42nMNa2Mo04,2pM鹽酸碌u胺素,0.5%葡萄糖,0.5%果糖,0.5%蔗糖和0.1%酵母提取物)中的1mL污泥樣品4妻種125-mL的screwcap錐形燒瓶而建立富集培養(yǎng)物。富集培養(yǎng)物在37。C震蕩培養(yǎng)。24h的培養(yǎng)之后,富集培養(yǎng)物以1:10稀釋為包含0.8%,1.2%或1.6%w/v的1-丁醇的新鮮培養(yǎng)基(SigmaChemicalCo.;分子生物等級(大于或等于99%純度))。培養(yǎng)在相同條件下繼續(xù)。具有允許顯著生長(例如,具有大約0.1的起始OD6(X),在24到48h內(nèi)增長到大約1.0的OD6oo的培養(yǎng)物)的最高水平的1-丁醇的培養(yǎng)物然后以1:10稀釋為包含更高水平的1_丁醇的新鮮培養(yǎng)基以選擇對1-丁醇提高的耐受。大多數(shù)富集培養(yǎng)物在1.2%的1-丁醇存在下生長,并且來自一些地點的富集培養(yǎng)物在1.6%的1-丁醇存在下生長。但是,沒有富集培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基中2.0%的1-丁醇存在下生長。311_丁醇抗性細菌的純化林如下分離自富集培養(yǎng)物。生長于包含1.2%或1.6%的富集培養(yǎng)物的細胞被連續(xù)稀釋,連續(xù)稀釋液平板接種于LurmBertani(LB)瓊脂培養(yǎng)基,改良的LB瓊脂(也就是,補充了0.5%蔗糖,0.5%葡萄糖,0.5%果糖,0.5%丙酮酸鈉,2mMMgCl2,0.7mMCaCl2,50nMMnCl2,lpMFeCl3,l^MZnCl2,1.72CuCl2,2.53(LiMCoCl2,2.42Na2Mo04和2鹽酸石危胺素的LB瓊脂)或具有2.0%DifcoAgarNoble的最小富集培養(yǎng)基(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD),所有培養(yǎng)基都沒有1-丁醇。然后從瓊脂培養(yǎng)基將集落接種到微量滴定板的孔中沒有1-丁醇的最小富集培養(yǎng)基中。每孔中的細胞在具有或不具有1-丁醇的分離的微量滴定板中再培養(yǎng)以鑒定1-丁醇-耐受分離物。用于攻擊分離物的1-丁醇的量在1.2%到3.0%w/v之間。幾種來自富集的分離物在37。C下在液體培養(yǎng)基中存在2.0%或更高的1-丁醇時顯示出生長。如下所述測定能夠在包含至少2.0%的1-丁醇的液體培養(yǎng)基中生長的分離的株的ICso值。在37°C下在不存在(對照)和存在1.2%到3.0%w/v的1-丁醇時監(jiān)測(通過OD60。)培養(yǎng)于S30L培養(yǎng)基(也就是,10mM硫酸銨,5mM磷酸鉀緩沖液,pH7.0,50mMMOPS,pH7.0,2mMMgCl2,0.7mMCaCl2,50pMMnCl2,1|liMFeCl3,1一ZnCl2,1.72一CuCl2,2.53一CoCl2,2.42一Na2Mo〇4,2inM鹽酸硫胺素,0.01M葡萄糖,和0.2%酵母提取物)中的分離物的生長,并且從生長曲線的對數(shù)部分計算每種培養(yǎng)物的倍增時間(倍增時間=0.693/生長率)。通過從100%減去生長百分比([對照瓶的倍增時間/樣品瓶的倍增時間]X100)確定樣品中由1-丁醇引起的生長抑制百分比。IC5q是引起50%的生長抑制的丁醇的濃度,并且通過將丁醇濃度對抑制百分比繪圖而測定。能夠在包含2.5%w/v的1-丁醇的固體培養(yǎng)基中在37°C下生長的代表性林的結(jié)果總結(jié)于表4。當(dāng)該抹在30°C培養(yǎng)時獲得更高的ICso值(數(shù)據(jù)未顯示)。通過對在從每種分離物提取的DNA中聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增16SrRNA基因而獲得的產(chǎn)物進行測序而筌定分離物。從每種1-丁醇耐受株抽提DNA。利用商業(yè)試劑盒處理每種分離物(UltracleanMicrobialGenomicDNAIsolationKit,獲自MoBioLaboratories,Inc,Carlsbad,CA,PartNo.12224-50)。分離物的16SrRNA基因利用具有如SEQIDNO:39給出的引物JCR14(ACGGGCGGTGTGTAC),和如SEQIDNO:40給出的JCR15(GCCAGCAGCCGCGGTA)的HotStarTaq(Qiagen,Valencia,CA;CatalogNo.203446)通過PCR進行擴增。PCR條件是在95°C15分鐘,然后在94。C45秒進行30循環(huán),55。C1分鐘,72°C1分鐘,然后72。C10分鐘。PCR產(chǎn)物進行純化并測序。每種序列用作GenBank的BLAST檢索的查詢序列以檢索最相類似的先前鑒定的16SrRNA基因序列。命名為PN0110(SEQIDNO:41)的分離抹的rRNA基因序列匹配于^應(yīng)碌'^T五"^racocc^/aeczwmJ已知的rRNA序列(見表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實施例2利用連續(xù)培養(yǎng)的丁醇耐受細菌抹的分離本實施例的目的是分離丁醇耐受細菌林。環(huán)境樣品獲自幾種廢水處理地點并且在恒化生物反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)中存在1-丁醇的情況下生長。幾種1-丁醇耐受細菌林被分離并鑒定為不同種的腸球菌。Appilikon發(fā)酵罐(AppilikonInc.,Clinton,NJ)用作厭氧恒化器。這種生物反應(yīng)器系統(tǒng)由l-L碟形底(dishedbottom)反應(yīng)器,控制器ADI1032P100,以及具有海船和渦輪機葉輪(marineandturbineimpeller)的攪拌器單元組成。具有適當(dāng)傳感器的生物控制器ADI1030Z510300020用于監(jiān)控PH,溶解氧,和溫度。ColeParmer泵和泵頭(ColeParmerInstrumentCo.,VernonHills,IL)用于添加酸和堿以維持培養(yǎng)基在PH7.0。利用循環(huán)水浴將溫度保持在37°C。培養(yǎng)基(S20培養(yǎng)基)由5mM磷酸鉀緩沖液,pH7.0,10mM的石克酸銨,0.1%酵母提取物,0.1%caseaminoacids,100mMMOPS,2mMMgCl2,0.7mMCaCl2,0.05mMMnCl2,0.001mMZnCl2,0.002mM鹽酸碌u胺素,1.72|uMCuCl2,2.53pMCoCl2,2.42|uMNa2Mo04,25mM葡萄糖,12.5mM蔗糖,和12.5mM果糖組成,并且500mL體積的培養(yǎng)基用于本生物反應(yīng)器中。生物反應(yīng)器利用0.1到1.0mL/分鐘和50rpm的攪拌器速度進行操作。用獲自幾種E丄duPontdeNemoursandCompany地點的不同廢水處理設(shè)備的幾種廢水污泥樣品的混合物接種生物反應(yīng)器。分批模式操作短期之后,生物反應(yīng)器以連續(xù)補料才莫式操作。1-丁醇作為流入的培養(yǎng)基的部分而被添加到生物反應(yīng)器中。當(dāng)生物反應(yīng)器從分批模式轉(zhuǎn)換到連續(xù)補料模式時,1-丁醇在生物反應(yīng)器中的水平是0%,并且然后1-丁醇在生物反應(yīng)器中逐漸增加到2.5%。培養(yǎng)基的流率在0.1到1.0mL/分鐘的范圍內(nèi)。通過測量在600nm的光學(xué)密度監(jiān)測生物反應(yīng)器中的細胞密度。利用具有5973質(zhì)量檢測器的HP6890氣相色鐠儀(AgilentTechnologies,Inc,Wilmington,DE)的GCMS測定補料和流出物中的1-丁醇。GC柱是DB畫WAX,30mx0.32mmIDx0.25)nm柱(J&WScientific,Inc.,Folsom,CA)??蛇x的,樣品被過濾(AcrodiscCRPTFE0.2濾器)并且通過利用具有ShodexSH-G保護柱的ShodexSHlOll柱(8mmIDx300mmlength;ShokoAmericaInc.,ColoradoSprings,CO)的HPLC而分析。柱溫度是50°C并且利用0.5mL/分鐘的流率。為了沖企測,利用在210nm的光度檢測器和折射率檢測器。樣品注射體積是10pL。起始調(diào)整期之后,通過補料進入生物反應(yīng)器的1-丁醇的量逐漸增加使得培養(yǎng)基中最終的1_丁醇濃度達到2.5%w/v。在相同的時期,生物反應(yīng)器流出物中的葡萄糖量被監(jiān)測。提高補料中的1-丁醇量導(dǎo)致細胞密度的降低和伴隨的葡萄糖利用的降低。連續(xù)的培養(yǎng)導(dǎo)致細胞密度和葡萄糖利用在適應(yīng)更高水平的1-丁醇之后再次提高。例如,提高1-丁醇到1.6%導(dǎo)致細胞密度降低到小于1.5OD6Q()并具有葡萄糖利用的相應(yīng)降低。但是,連續(xù)培養(yǎng)導(dǎo)致細胞密度提高到2.3OD6oo并具有葡萄糖消耗的相應(yīng)提高。厭氧生物反應(yīng)器中微生物聚生體的系統(tǒng)發(fā)育的特征筌定和來自生物反應(yīng)器的1-丁醇抗性細菌的純株的分離如下實施。在不同時間取自生物反應(yīng)器的細胞樣品和取自生物反應(yīng)器廢水罐(wastejug)的細胞樣品被連續(xù)稀釋,并且連續(xù)稀釋液平板接種于沒有1-丁醇的S20瓊脂培養(yǎng)基上(具有1.6%DifcoTM瓊脂,Noble-凝固劑的S20培養(yǎng)基)。然后從S20瓊脂培養(yǎng)基將集落接種到方孔微量滴定板(BeckmanCoulterInc,Fullerton,CA;目錄號No.069681)的孔中沒有1-丁醇的1.2mL的S20培養(yǎng)基中。方孔微量滴定板用粘合蓋密封(BeckmanCoulterInc.;目錄號No.538619)并且在37°C振蕩培養(yǎng)直到72h。通過將來自每個方孔的200L培養(yǎng)物分配到"U-底,,微量滴定板(VWRScientificProducts,WestChester,PA;目錄號No.62409-052)的相應(yīng)孔中,利用方孔微量滴定板制備主平板。每孔中的細胞然后再培養(yǎng)入具有或不具有1-丁醇的U-底微量滴定板(BDDiagnosticSystems;目錄號No.353077)的孔中的200L的S20培養(yǎng)基以筌定1-丁醇耐受分離物。分離物分別用2.0%和3.0%w/v的1-丁醇攻擊。通過在1-丁醇存在下的生長而測定丁醇耐受,所述生長通過在微量滴定板讀數(shù)器上(HTS7000PlusBioAssayReader,PerkinElmerLifeandAnalyticalSciencesInc.,Wellesley,MA)測量在595nm(OD595)下光學(xué)密度的提高而測定。在37°C振蕩生長48h之后具有ODs95讀數(shù)在0.1到0.8范圍的分離物4皮選擇進行進一步的耐受測試??蛇x的,來自主培養(yǎng)板的分離物利用Nunc-TSP可轉(zhuǎn)移固相篩選系統(tǒng)(NalgeneNuncInternational,Napersville,IL;目錄號No.445497)復(fù)制鋪板于包含高達3.4%1-丁醇的S20瓊脂。耐受分離物通過在37。C生長24到72h之后被鑒定。幾種分離物,包括表5列出的那些,顯示出在2.5%或更高的1-丁醇下在固體培養(yǎng)基上的生長。分離抹的ICs。值在37。C對1-丁醇,2-丁醇,異丁醇,2-丁酮(也稱作曱基乙基酮(MEK))和乙醇按照實施例1所述方法測定。結(jié)果總結(jié)于表5.基于對每種化合物測定的IC5。值和在對1-丁醇和對每種其他測試化合物的耐受性所見的相關(guān)性,鑒定的耐受林期望生長于包含3.9%w/v2-丁醇,2.7%w/v異丁醇,5.0。/ow/v2-丁酮,或9.0%w/v乙醇的固體培養(yǎng)基上。通過對16SrRNA基因測序鑒定分離物,如實施例1所述。每種分離物的16SrRNA的SEQID,種系型,和分離物命名也在表5中給出。利用連續(xù)培養(yǎng)從環(huán)境樣品中分離的丁醇耐受細菌抹<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>權(quán)利要求1.分離丁醇耐受微生物的方法,所述方法包括a)提供包含微生物聚生體的微生物樣品;b)將微生物聚生體與包含可發(fā)酵碳源的生長培養(yǎng)基接觸,直到微生物聚生體成員正在生長;c)將步驟(b)的生長的微生物聚生體與丁醇接觸;和d)分離步驟(c)的存活的成員,其中丁醇耐受微生物被分離。1.分離丁醇耐受微生物的方法,所述方法包括a)提供包含微生物聚生體的微生物樣,b)將微生物聚生體與包含可發(fā)酵碳源到微生物聚生體成員正在生長;c)將步驟(b)的生長的微生物聚生體與丁醇接觸;和d)分離步驟(c)的存活的成員,其中丁醇耐受微生物被分離。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中步驟(b)生長的聚生體是生長于對數(shù)期。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法于固體培養(yǎng)基上。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法次。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法大約0.8%w/v到大約3.0%w/v。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中步驟(d)的分離包括以下步驟i)在不存在丁醇時在液體培養(yǎng)基中生長步驟(d)的存活成員;由此存活成員繁殖;ii)在存在丁醇時生長步驟(i)的細胞;和iii)收集在存在丁醇時生長的步驟(ii)的細胞,其中丁醇耐受微生物被分離。8.根據(jù)權(quán)利要求l的方法,其中可發(fā)酵碳源選自蔗糖、果糖、葡萄糖、丁酸、戊酸及其混合物。9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中丁醇主要是1-丁醇。其中丁醇主要是2-丁醇。其中丁醇主要是異丁醇。其中聚生體在厭氧條件下生長。其中聚生體在微需氧條件下生長。其中聚生體在需氧條件下生長。其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37°C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少2.5%w/v的1-丁醇耐受。16.根據(jù)權(quán)利要求l的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37°C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少3.9%w/v的2-丁醇耐受。17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37。C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少2.7%w/v的異丁醇耐受。18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37。C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少5.0%w/v的2-丁酮耐受。19.根據(jù)權(quán)利要求l的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37。C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少9.0%w/v的乙醇耐受。20.根據(jù)權(quán)利要求l的方法,其中微生物樣品是環(huán)境樣品。21.根據(jù)權(quán)利要求l的方法,其中丁醇耐受微生物是腸球菌種。22.通過權(quán)利要求l的方法分離的丁醇耐受微生物。23.根據(jù)權(quán)利要求22的丁醇耐受微生物,其中微生物是腸球菌屬的細菌。24.分離丁醇耐受腸球菌的方法,所述方法包括a)提供包含微生物聚生體的微生物樣品;b)為腸球菌的存在在包含下述成分的生長培養(yǎng)基中富集微生物聚生體i)可發(fā)酵碳源;和ii)竟爭物生長抑制劑;以產(chǎn)生腸球菌富集的培養(yǎng)物,其中腸球菌富集的培養(yǎng)物的成員正在生長;c)使步驟(b)的生長的腸球菌富集的培養(yǎng)物與丁醇接觸;和d)分離步驟(c)的存活的成員,其中丁醇耐受腸球菌被分離。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(c)的生長的腸球菌生長于對數(shù)期。26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中微生物樣品是環(huán)境樣品。27.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(c)之后聚生體成員平板接種于固體培養(yǎng)基上。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法,其中固體培養(yǎng)基包含丁醇。29.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中竟爭物生長抑制劑選自膽汁、疊氮化物及其混合物。30.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(c)的接觸重復(fù)一次或多次。31.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(c)的接觸是與大約0.8。/。w/v到大約3.0%w/v的濃度的丁醇接觸。32.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(d)的分離包括以下步驟i)在不存在丁醇時在液體培養(yǎng)基中生長步驟(d)的存活成員,由此存活成員繁殖;ii)在存在丁醇時生長步驟(i)的細胞;和iii)收集在存在丁醇時生長的步驟(ii)的細胞,其中丁醇耐受微生物被分離。33.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中可發(fā)酵碳源選自蔗糖、果糖、葡萄糖、丁酸、戊酸及其混合物。34.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中丁醇主要是1-丁醇。35.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中丁醇主要是2-丁醇。36.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中丁醇主要是異丁醇。37.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37°C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少2.5%w/v的1-丁醇耐受。38.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37。C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少3.9%w/v的2-丁醇耐受。39.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37。C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少2.7%w/v的異丁醇耐受。40.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37°C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少5.0%w/v的2-丁酮耐受。41.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中步驟(d)的存活成員當(dāng)在37°C生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少9.0yow/v的2-乙醇耐受。42.通過權(quán)利要求24的方法分離的丁醇耐受腸球菌。43.權(quán)利要求42的丁醇耐受腸球菌,其當(dāng)生長于固體培養(yǎng)基上時對于至少2.5%w/v的丁醇耐受。44.根據(jù)權(quán)利要求42的丁醇耐受腸球菌,其中腸球菌具有下述特征i)為兼性厭氧生物;和ii)為革蘭氏陽性;和iii)為不能動的;iv)具有球形或卵形細胞形態(tài)學(xué);和v)具有啟動在6.5。/。氯化鈉肉湯和PH9.6肉湯中生長的能力;和vi)包含選自SEQIDNO:41,SEQIDNO:42,SEQIDNO:43,和SEQIDNO:44的16SrRNA基因序列。45.具有下述特征的丁醇耐受腸球菌i)為兼性厭氧性生物;和ii)為革蘭氏陽性;和hi)為不能動的;和iv)具有球形或卵形細胞形態(tài)學(xué);和v)具有啟動在6.5%氯化鈉肉湯中和在PH9.6的肉湯中生長的能力;和vi)當(dāng)生長于固體培養(yǎng)基上時,對至少2.5。/。w/v丁醇耐受。46.根據(jù)權(quán)利要求45的丁醇耐受腸球菌,其包含選自SEQIDNO:41,SEQIDNO:42,SEQIDNO:43,和SEQIDNO:44的16SrRNA基因序列。47.選自下組的丁醇耐受腸球菌ATCC—PTA-7478(屎腸球菌PNOllO),ATCCPTA-7479(鵓雞腸球菌PN0048),ATCCPTA-7477(糞腸球菌PN0197-10)和ATCCPTA-7480(屎腸球菌PN0133)。48.生產(chǎn)丁醇的方法,所述方法包括a)提供包含編碼丁醇生物合成途徑的遺傳構(gòu)建體的腸球菌,其具有下述特征i)為兼性厭氧生物;和ii)為革蘭氏陽性;和in)為不能動的;iv)具有球形或卵形細胞形態(tài)學(xué);和v)具有啟動在6.5%氯化鈉肉湯和PH9.6肉湯中生長的能力;和vi)當(dāng)生長于固體培養(yǎng)基上時對至少2.5%w/v丁醇耐受,b)在生產(chǎn)丁醇的條件下生長步驟(a)的腸球菌。49.生產(chǎn)丁醇的方法,所述方法包括a)提供權(quán)利要求24的方法分離的包含編碼丁醇生物合成途徑的遺傳構(gòu)建體的腸球菌,和b)在生產(chǎn)丁醇的條件下生長步驟(a)的腸球菌。50.根據(jù)權(quán)利要求48或49的方法,其中丁醇主要是1-丁醇。51.根據(jù)權(quán)利要求48或49的方法,其中丁醇主要是2-丁醇。52.根據(jù)權(quán)利要求48或49的方法,其中丁醇主要是異丁醇。53.根據(jù)權(quán)利要求48或49的方法,其中腸球菌選自ATCC一PTA-7478(屎腸球菌PN0110),ATCCPTA-7479(鵓雞腸球菌PN0048),ATCCPTA-7477(糞腸球菌PN0197-10)和ATCCPTA-7480(屎腸^求菌PN0133)。54.用于生產(chǎn)丁醇的丁醇耐受腸球菌。55.用于生產(chǎn)2-丁酮的2-丁酮耐受腸球菌。56.生產(chǎn)2-丁酮的方法,所述方法包括a)提供包含編碼2-丁酮生物合成途徑的遺傳構(gòu)建體的腸球菌,其具有下述特征i)為兼性厭氧生物;和ii)為革蘭氏陽性;和iii)為不能動的;iv)具有球形或卵形細胞形態(tài)學(xué);和v)具有啟動在6.5%氯化鈉肉湯和PH9.6肉湯中生長的能力;和vi)當(dāng)生長于固體培養(yǎng)基上時對至少2.5%w/v丁醇耐受,和b)在生產(chǎn)2-丁酮的條件下生長步驟(a)的腸球菌。57.生產(chǎn)2-丁酮的方法,所述方法包括a)提供通過權(quán)利要求24的方法分離的包含編碼丁醇生物合成途徑的遺傳構(gòu)建體的腸球菌;和b)在生產(chǎn)2-丁酮的條件下生長步驟(a)的腸球菌。全文摘要分離了具有對丁醇的增強的耐受性的腸球菌細菌。該細菌對于發(fā)酵生產(chǎn)丁醇是有用的。還提供了分離丁醇耐受腸球菌的新方法。文檔編號C12N1/36GK101437936SQ200780016310公開日2009年5月20日申請日期2007年5月4日優(yōu)先權(quán)日2006年5月5日發(fā)明者M·G·布拉穆奇,M·辛格,N·塞德科瓦,V·納加拉彥申請人:納幕爾杜邦公司