專利名稱：一種土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著生物及信息技術(shù)的迅速發(fā)展，挖掘、克隆新基因、研究新基因的功能已成為功能基因組研究中的一項(xiàng)重要工作。構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)是功能基因組學(xué)研究的基本手段之一，其在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢(shì)，從而使它在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是研究工作中最常使用到的基因文庫(kù)。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤有機(jī)物質(zhì)分解和養(yǎng)分釋放、能量轉(zhuǎn)移等生物地化循環(huán)中扮演著重要角色，土壤微生物的功能多樣性也成為土壤生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。構(gòu)建土壤微生物的cDNA文庫(kù)則能夠?yàn)樯钊敕治鐾寥牢⑸锕δ芏鄻有裕ú煌h(huán)境條件下，土壤微生物中相關(guān)基因的表達(dá)、調(diào)控，以及此過(guò)程中的基因與基因、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作提供重要的基礎(chǔ)。然而，由于土壤中的微生物包括細(xì)菌、放線菌和真菌等，它們所轉(zhuǎn)錄的mRNA各不相同，常規(guī)的方法需要我們利用特定的試劑盒提取土壤總mRNA，包括帶poly㈧的(真菌和放線菌mRNA、少數(shù)細(xì)菌的一些mRNA)和不帶poly (A) 的(細(xì)菌mRNA)。在此基礎(chǔ)上，分別針對(duì)這兩種類型的mRNA，應(yīng)用不同試劑盒分離各種mRNA， 最后合并成用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建的土壤總mRNA。此法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且由于操作過(guò)程繁瑣容易出現(xiàn)RNA降解而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、簡(jiǎn)單、高效的土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，解決常規(guī)操作步驟復(fù)雜，RNA容易降解的問(wèn)題，此法對(duì)于開(kāi)展土壤微生物的功能多樣性研究十分必要。鑒于此，發(fā)明人前期發(fā)明了一種土壤微生物DNA和總RNA的提取方法(申請(qǐng)?zhí)?201010M8527. X)，通過(guò)此法并分離獲得土壤微生物總RNA，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、高效的土壤cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)單有效的土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，利用該法獲得的文庫(kù)的容量大。本發(fā)明的土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括土壤微生物總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄，5’端接頭連接，3’端接頭連接，PCR擴(kuò)增，以及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，其特征在于具體步驟包括如下
(1)土壤微生物總RNA獲得提取獲得土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA純化后備用；
(2)總RNA的逆轉(zhuǎn)錄總RNA采用I^rimeScriptRT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積的3M、pH=5. 2的醋酸鈉溶液，于_20°C 下沉淀12 h ；(3)cDNA5’端接頭連接純化后的cDNA用堿性磷酸酶進(jìn)行5’的去磷酸化反應(yīng)，去磷酸化的cDNA與5’接頭1進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積的的 3M、pH=5. 2 的醋酸鈉溶液，于 _20°C下沉淀 12h ；其中接頭 1 :5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCA GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經(jīng)磷酸化修飾；
(4)cDNA 3，端接頭連接連有5，接頭cDNA的3，端用T4多核苷激酶進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，磷酸化反應(yīng)后的cDNA與3，接頭2進(jìn)行連接；其中接頭2 5’ -CTAATACGACTCACTATAGG GCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’ ；
(5)PCR擴(kuò)增分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA用接頭的互補(bǔ)引物Pl: 5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，, P2 5' -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，進(jìn)行擴(kuò)增，具體的反應(yīng)參數(shù)為95°C 1 min，94°C 1 min、65°C 30sec、72°C 2 min 30sec 共 30 cycles, 72°C IOmin,擴(kuò)增后的產(chǎn)物再以相同的引物進(jìn)行二次擴(kuò)增；
(6)cDNA文庫(kù)構(gòu)建二次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pMD-18 T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，獲得cDNA文庫(kù)。步驟(1)中利用DNA酶I去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總 RNA快速提取試劑盒和MicroSpin S-400 HR spin column進(jìn)行純化。本發(fā)明的構(gòu)建方法先將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈的cDNA，單鏈cDNA的5’端經(jīng)去磷酸化后與5’端磷酸化修飾的接頭1連接，再將5’端連有接頭的cDNA進(jìn)行磷酸化反應(yīng)， 反應(yīng)后的cDNA的3’端與接頭2連接，獲得5’、3’端分別連接有接頭的cDNA，采用與接頭部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得土壤微生物的雙鏈cDNA，將此雙鏈cDNA與克隆載體PMD-18T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，最終獲得土壤微生物的 cDNA文庫(kù)。所得的文庫(kù)含有1000個(gè)以上的單基因克隆，部分結(jié)果見(jiàn)圖3。反復(fù)試驗(yàn)證明， 此法構(gòu)建的土壤微生物cDNA文庫(kù)庫(kù)容量較大，可以用來(lái)篩選感興趣的目的基因，以及后續(xù)的基因、蛋白互作分析。目前構(gòu)建的cDNA文庫(kù)主要是對(duì)單一的植物、動(dòng)物或微生物進(jìn)行，本發(fā)明針對(duì)土壤中的所有微生物構(gòu)建cDNA文庫(kù)，文庫(kù)中基因信息來(lái)源更加豐富，具有下列顯著優(yōu)點(diǎn)
1.利用oliga dT和Random引物能夠一次性將包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物在內(nèi)的土壤微生物總RNA全部逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，避免了對(duì)細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物總RNA分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的繁瑣步驟。2.分別對(duì)土壤微生物的單鏈cDNA的5，和3，端連接接頭，PCR擴(kuò)增形成雙鏈cDNA， 從而獲得微生物雙鏈cDNA，一次性構(gòu)建細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物的雙鏈cDNA文庫(kù)。3.適合于不同來(lái)源的土壤微生物，具有廣普適用性。4.文庫(kù)中基因來(lái)源于細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物，因而信息來(lái)源更加豐富。5.構(gòu)建文庫(kù)的方法便捷、無(wú)需復(fù)雜的操作步驟。


圖1為不同作物土壤微生物總RNA的逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果，其中A 水稻，B 甘蔗，虛線框中的為土壤微生物總RNA逆轉(zhuǎn)錄后形成的單鏈cDNA ；
圖2為不同作物土壤微生物雙鏈cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中A 水稻，B 甘蔗，虛線框中的為土壤微生物總RNA逆轉(zhuǎn)錄后形成的單鏈cDNA ；圖3為不同作物土壤微生物的部分cDNA文庫(kù)，其中A 水稻，B:甘蔗。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括土壤微生物總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄，5’端接頭連接，3’端接頭連接，PCR擴(kuò)增，以及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。具體步驟如下
(1) 土壤微生物總RNA獲得土壤微生物總RNA的提取參照方長(zhǎng)旬等(一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，申請(qǐng)?zhí)?01010548527.X)的專利說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行。 按照該方法提取獲得的土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶(DNAase I，TaKaRa Biotechnology, Dalian)去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克公司)和MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)進(jìn)行純化。(2)總 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄總 RNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1 倍體積的3M醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C下沉淀12 h。(3) cDNA 5，端接頭連接:cDNA 用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase) (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進(jìn)行5，的去磷酸化反應(yīng)，去磷酸化的cDNA與5，接頭(5’ -CTAAT ACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經(jīng)磷酸化修飾)進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積的的3M醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C下沉淀12h。(4) cDNA 3，端接頭連接連有5，接頭的cDNA用T4多核苷激酶(T4 Polynucleotide Kinase) (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，磷酸化反應(yīng)后的 cDNA 與 3，接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，)進(jìn)行連接。(5)PCR擴(kuò)增分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA用接頭的互補(bǔ)引物(Pl 5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，，P2 :5，-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，)進(jìn)行擴(kuò)增，具體的反應(yīng)參數(shù)為95°C 1 min, (94°C 1 min, 65°C 30sec，72°C 2 min 30sec) 30 cycles, 72°C IOmin,擴(kuò)增后的產(chǎn)物再以相同的引物進(jìn)行二次擴(kuò)增。(6)cDNA文庫(kù)構(gòu)建二次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pMD_18 T載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，獲得cDNA文庫(kù)。實(shí)施例1
本發(fā)明的土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，具體步驟如下
(1)原料新鮮水稻根際土壤，來(lái)自福建福州(福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng))；
(2)土壤微生物總RNA的提取土壤微生物總RNA的提取參照方長(zhǎng)旬等(一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，申請(qǐng)?zhí)?01010548527.X)的專利說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行。按照該方法提取獲得的土壤微生物基因組DNA和總RNA，利用DNA酶(DNAase I， TaKaRa Biotechnology, Dalian)在 37°C溫育 IOmin 去除基因組 DNA 后獲得總 RNA，總 RNA 用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克公司)和MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)進(jìn)行過(guò)柱純化。(3)總 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄上述(2)中獲得的總 RNA采用 I^rimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。具體步驟為在反應(yīng)體系中加入2 μ 15XPrimeScript Buffer,0. 5 μ 1 PrimeScript RT Enzyme Mix 1,0.5 μ 1 Oligo dT Primer (50 μ Μ)，2 μ 1 Random 6 mers (100 μ Μ)禾口 500ng 總 RNA，并用 RNAase-free H2O補(bǔ)足至終體積10 μ 1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下37°C 15 min,85°C 5 sec。逆轉(zhuǎn)錄獲得的單鏈cDNA用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C 下沉淀12 h，后于4°C 14000rpm離心lOmin，離心獲得的沉淀用Iml 75%的乙醇，于4°C 14000rpm離心洗滌lOmin，重復(fù)兩次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用50ul無(wú)菌水溶解。取 3 μ 1此cDNA的溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1A，從圖IA可見(jiàn)水稻土壤微生物總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后形成單鏈cDNA，單鏈cDNA為彌散的條帶，片段大小主要集中在 0. 5 3 kb之間。(4) cDNA 5，端接頭連接上述(3)的 cDNA 先用 Alkaline Phosphatase (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進(jìn)行5，的去磷酸化反應(yīng)，具體步驟為在反應(yīng)體系中加入43ul cDNA, 5ul IOXAlkaline Phosphatase Buffer, 2ul Alkaline Phosphatase, 37 °C 反應(yīng) 30min，反應(yīng)液用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 :1)抽提1次，4°C 14000rpm離心 lOmin,上清用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C下沉淀60min，后于4°C 14000rpm離心lOmin，沉淀用Iml 75%的乙醇于4°C 14000rpm離心洗滌lOmin，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用IOul無(wú)菌水溶解。去磷酸化后的cDNA利用 DNA 連接酶與 5’ 接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經(jīng)磷酸化修飾)于16°C下連接12 h,連接產(chǎn)物用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(PH=5. 2)，于-20°C下沉淀1 后離心洗滌，用43ul的無(wú)菌水溶解沉淀。(5) cDNA 3，端接頭連接將(4)中連有5，接頭的cDNA加入2ul T4 Polynucleotide Kinase (TaKaRa Biotechnology, Dalian), 5ul 10XT4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer, 37°C反應(yīng)30min，反應(yīng)體系用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)抽提1次，4°C 14000rpm離心lOmin，上清用用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和 0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于-20°C下沉淀60min，沉淀用Iml 75%的乙醇，于 40C HOOOrpm離心洗滌lOmin，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用IOul無(wú)菌水溶解。磷酸化反應(yīng)后的 cDNA 利用 DNA 連接酶與 3，接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCG GGCAGGT-3，)于 16°C下連接 12 h。(6)PCR擴(kuò)增取Iul上述(5)分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA，用接頭的互補(bǔ)引物(Pl :5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，，P2 :5，-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 IOXBuffer 5 μ 1, dNTP (IOmM) 2 μ 1，上述引物 Pl，P2 (10 μ Μ)各 2 μ 1，Taq DNA聚合酶(5U/yl) 0. 3μ 1, cDNA 1 μ 1，無(wú)菌水37. 7 μ 1，共50 μ 1。具體的反應(yīng)參數(shù)為 95°C 1 min, (94°C 1 min, 65°C 30sec，72°C 2 min 30sec) 30 cycles, 72°C lOmin。擴(kuò)增后取Iul作為模板按上述反應(yīng)參數(shù)繼續(xù)二次擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)為20，二次擴(kuò)增結(jié)束后取3μ 1 于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2Α，從圖2Α可見(jiàn)單鏈cDNA經(jīng)擴(kuò)增得到的雙鏈 cDNA也為彌散的條帶，片段大小也主要在0. 5 3 kb之間，濃度較單鏈cDNA大，通過(guò)電泳結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用此方法獲得的土壤微生物的雙鏈cDNA濃度高，片段豐富。(7) cDNA文庫(kù)的構(gòu)建將(6)中PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pMD_18 T載體進(jìn)行連接后 42°C熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，獲得水稻土壤微生物cDNA文庫(kù)，部分結(jié)果見(jiàn)圖 3A，圖3A中LB瓊脂平板上的每一個(gè)白斑含有水稻土壤微生物的一個(gè)cDNA，即為水稻土壤微生物的一個(gè)cDNA克隆。實(shí)施例2
(1)取新鮮的甘蔗根際土壤來(lái)自福建福州(福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗園)；，土壤微生物總 RNA的提取參照方長(zhǎng)旬等(一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，申請(qǐng)?zhí)?201010548527. X)的專利說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行。按照該方法提取獲得的土壤微生物基因組 DNA和總 RNA，利用 DNA 酶(DNAase I，TaKaRa Biotechnology, Dalian)在 37°C溫育 IOmin 去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克公司)MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)進(jìn)行過(guò)柱純化。(3)總 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄上述(2)中獲得的總 RNA采用 I^rimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。具體步驟為在反應(yīng)體系中加入2 μ 1 5XPrimeScript Buffer,0. 5 μ 1 PrimeScript RT Enzyme Mix 1,0.5 μ 1 Oligo dT Primer (50 μ Μ)，2 μ 1 Random 6 mers (100 μ Μ)禾口 500ng 總 RNA，并用 RNAase-free H2O補(bǔ)足至終體積10 μ 1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下37°C 15 min,85°C 5 sec。逆轉(zhuǎn)錄獲得的單鏈cDNA用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C 下沉淀12 h，后于4°C 14000rpm離心lOmin，離心獲得的沉淀用Iml 75%的乙醇，于4°C 14000rpm離心洗滌lOmin，重復(fù)兩次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用50ul無(wú)菌水溶解。取 3μ 1此cDNA的溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1B，從圖IB可見(jiàn)甘蔗土壤微生物總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后形成單鏈cDNA，單鏈cDNA為彌散的條帶，片段大小主要集中在 0.5 3 kb之間。(4) cDNA 5，端接頭連接上述(3)的 cDNA 先用 Alkaline Phosphatase (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進(jìn)行5，的去磷酸化反應(yīng)，具體步驟為在反應(yīng)體系中加入43ul cDNA, 5ul IOXAlkaline Phosphatase Buffer, 2ul Alkaline Phosphatase, 37 °C 反應(yīng) 30min，反應(yīng)液用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 :1)抽提1次，4°C 14000rpm離心 lOmin,上清用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C下沉淀60min，后于4°C 14000rpm離心lOmin，沉淀用Iml 75%的乙醇于4°C 14000rpm離心洗滌lOmin，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用IOul無(wú)菌水溶解。去磷酸化后的cDNA利用 DNA 連接酶與 5’ 接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經(jīng)磷酸化修飾)于16°C下連接12 h,連接產(chǎn)物用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(PH=5. 2)，于-20°C下沉淀1 后離心洗滌，用43ul的無(wú)菌水溶解沉淀。(5) cDNA 3，端接頭連接將(4)中連有5，接頭的cDNA加入2ul T4 Polynucleotide Kinase (TaKaRa Biotechnology, Dalian), 5ul 10XT4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer, 37°C反應(yīng)30min，反應(yīng)體系用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 :1)抽提1次，4°C 14000rpm離心lOmin，上清用用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和 0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于-20°C下沉淀60min，沉淀用Iml 75%的乙醇，于 40C HOOOrpm離心洗滌lOmin，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用IOul無(wú)菌水溶解。磷酸化反應(yīng)后的 cDNA 利用 DNA 連接酶與 3，接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCG GGCAGGT-3，)于 16°C下連接 12 h。(6) PCR擴(kuò)增取Iul上述(5)分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA，用接頭的互補(bǔ)引物(Pl :5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，，P2 :5，-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 IOXBuffer 5 μ 1, dNTP (IOmM) 2 μ 1，上述引物 Pl，P2 (10 μ Μ)各 2 μ 1，Taq DNA聚合酶(5U/yl) 0. 3μ 1, cDNA 1 μ 1，無(wú)菌水37. 7 μ 1，共50 μ 1。具體的反應(yīng)參數(shù)為 95°C 1 min, (94°C 1 min, 65°C 30sec，72°C 2 min 30sec) 30 cycles, 72°C lOmin。擴(kuò)增后取Iul作為模板按上述反應(yīng)參數(shù)繼續(xù)二次擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)為20，二次擴(kuò)增結(jié)束后取3μ 1 于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2Β，從圖2Β可見(jiàn)單鏈cDNA經(jīng)擴(kuò)增得到的雙鏈 cDNA也為彌散的條帶，片段大小也主要在0. 5 3 kb之間，濃度也較單鏈cDNA大，通過(guò)電泳結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用此方法獲得的土壤微生物的雙鏈cDNA濃度高，片段豐富。
(7) cDNA文庫(kù)的構(gòu)建將(6)中PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pMD_18 T載體進(jìn)行連接后 42°C熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得甘蔗土壤微生物cDNA文庫(kù)圖3B，圖中 LB瓊脂平板上的每一個(gè)白斑含有甘蔗土壤微生物的一個(gè)cDNA，即為甘蔗土壤微生物的一個(gè)cDNA克隆。
權(quán)利要求
1.一種土壤微生物CDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括土壤微生物總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄，5’ 端接頭連接，3’端接頭連接，PCR擴(kuò)增，以及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，其特征在于具體步驟包括如下(1)土壤微生物總RNA獲得提取獲得土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA純化后備用；(2)總RNA的逆轉(zhuǎn)錄總RNA采用I^rimeScriptRT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積的3M、pH=5. 2的醋酸鈉溶液，于_20°C 下沉淀12 h ；(3)cDNA5’端接頭連接純化后的cDNA用堿性磷酸酶進(jìn)行5’的去磷酸化反應(yīng)，去磷酸化的cDNA與5’接頭1進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物用2. 5倍體積的無(wú)水乙醇和0. 1倍體積的的 3M、pH=5. 2 的醋酸鈉溶液，于 _20°C下沉淀 12h ；其中接頭 1 :5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCA GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經(jīng)磷酸化修飾；(4)cDNA 3，端接頭連接連有5，接頭cDNA的3，端用T4多核苷激酶進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，磷酸化反應(yīng)后的cDNA與3，接頭2進(jìn)行連接；其中接頭2 : 5’ -CTAATACGACTCACTATAGG GCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’ ；(5)PCR擴(kuò)增分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA用接頭的互補(bǔ)引物Pl: 5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，, P2 5' -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，進(jìn)行擴(kuò)增，具體的反應(yīng)參數(shù)為95°C 1 min，94°C 1 min、65°C 30sec、72°C 2 min 30sec 共 30 cycles, 72°C IOmin,擴(kuò)增后的產(chǎn)物再以相同的引物進(jìn)行二次擴(kuò)增；(6)cDNA文庫(kù)構(gòu)建二次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pMD-18 T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，獲得cDNA文庫(kù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(1)中利用DNA酶I去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒和 MicroSpin S-400 HR spin column 進(jìn)行純化。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種土壤微生物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，本發(fā)明的構(gòu)建方法先將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈的cDNA，單鏈cDNA的5’端經(jīng)去磷酸化后與5’端磷酸化修飾的接頭1連接，再將5’端連有接頭的cDNA進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)后的cDNA的3’端與接頭2連接，獲得5’、3’端分別連接有接頭的cDNA，采用與接頭部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得土壤微生物的雙鏈cDNA，將此雙鏈cDNA與克隆載體pMD-18T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，最終獲得土壤微生物的cDNA文庫(kù)。本發(fā)明構(gòu)建的土壤微生物cDNA文庫(kù)庫(kù)容量較大，可以用來(lái)篩選感興趣的目的基因，以及后續(xù)的基因、蛋白互作分析。
文檔編號(hào)C40B40/08GK102418151SQ20111027788
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者方長(zhǎng)旬, 林文雄, 林瑞余, 許鐵城, 黃力坤 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)