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合成編碼文庫(kù)的方法

文檔序號(hào):3556183閱讀:461來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):合成編碼文庫(kù)的方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2003年12月17日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/530854、2004年1月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/540681、2004年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/553,715和2004年7月16日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/588,672的優(yōu)先權(quán),這些專(zhuān)利的全部?jī)?nèi)容均在此引入作為參考。
背景技術(shù)
探索鑒定具有有用生物活性的化合物的更有效方法,導(dǎo)致發(fā)展了篩選大量不同化合物的方法,這些化合物存在于被稱(chēng)為組合文庫(kù)的集合中。這樣的文庫(kù)可含有105種或更多不同的化合物。有許多方法用于產(chǎn)生組合文庫(kù),并且已經(jīng)報(bào)道了肽、擬肽和有機(jī)小分子的組合合成。
組合方法應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)主要挑戰(zhàn)是非常復(fù)雜的文庫(kù)的合成和在所用篩選中有活性的分子的鑒定。通常知道文庫(kù)的復(fù)雜程度越高,即文庫(kù)中存在的不同結(jié)構(gòu)的數(shù)量越多,該文庫(kù)含有具有目標(biāo)活性的分子的可能性就越大。因此,文庫(kù)合成中使用的化學(xué)方法必須能夠在合理時(shí)間范圍內(nèi)生成大量化合物。但是對(duì)于給定的克式濃度和總濃度來(lái)說(shuō),提高文庫(kù)內(nèi)不同成員的數(shù)目降低了任何特定文庫(kù)成員的濃度。這使得從高復(fù)雜性文庫(kù)中鑒定活性分子變得復(fù)雜。
克服這些障礙的一種方法是發(fā)展編碼文庫(kù),特別是其中每個(gè)化合物均包含可擴(kuò)增標(biāo)簽的文庫(kù)。這樣的文庫(kù)包括DNA-編碼文庫(kù),其中用于識(shí)別文庫(kù)成員的DNA標(biāo)簽?zāi)軌蛴梅肿由飳W(xué)技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。但是,這些方法在產(chǎn)生很大文庫(kù)中的應(yīng)用尚未得到證明,顯然,為了實(shí)現(xiàn)該方法用于藥物發(fā)現(xiàn)的可能性,需要改進(jìn)產(chǎn)生這種文庫(kù)的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種合成包含編碼寡核苷酸標(biāo)簽的分子文庫(kù)的方法。該方法使用“分離-組合”策略,其中將含有起始物的溶液分成(“分離”)多個(gè)部分,該起始物包括連接有一編碼寡核苷酸的第一結(jié)構(gòu)單元(buildingblock)。在每個(gè)部分中,起始物與獨(dú)特的第二結(jié)構(gòu)單元和標(biāo)識(shí)該第二結(jié)構(gòu)單元的獨(dú)特的第二寡核苷酸反應(yīng)。這些反應(yīng)可以同時(shí)或相繼進(jìn)行,如果是相繼進(jìn)行,則任一反應(yīng)都可以在另一反應(yīng)之前。將每個(gè)部分中產(chǎn)生的二聚體分子合并(“組合”),然后再分為多個(gè)部分。這些部分中的每一個(gè)然后與獨(dú)特(每部分特異性)的第三結(jié)構(gòu)單元和編碼(標(biāo)識(shí))該結(jié)構(gòu)單元的獨(dú)特的第三寡核苷酸反應(yīng)。產(chǎn)物文庫(kù)中存在的獨(dú)特分子的數(shù)目是以下數(shù)值的函數(shù)(1)在合成的每一步使用的不同結(jié)構(gòu)單元的數(shù)目,和(2)組合和分離步驟的重復(fù)次數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種合成分子的方法,該分子包含或由與編碼寡核苷酸可操作連接的功能部分組成。該方法包括下列步驟(1)提供由包含n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分組成的起始化合物,其中n是1或大于1的整數(shù),其中該功能部分含有至少一個(gè)反應(yīng)基團(tuán),并且其中該功能部分與起始寡核苷酸可操作連接;(2)將該起始化合物與包含至少一個(gè)互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng),其中該至少一個(gè)互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)與步驟(1)的反應(yīng)基團(tuán)互補(bǔ),反應(yīng)條件適合所述反應(yīng)基團(tuán)與互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵;(3)將起始寡核苷酸與標(biāo)識(shí)步驟(b)的結(jié)構(gòu)單元的引入寡核苷酸反應(yīng),反應(yīng)條件適合所述引入寡核苷酸與起始寡核苷酸連接,并存在催化所述起始寡核苷酸與引入寡核苷酸連接的酶,從而產(chǎn)生包含功能部分或由該功能部分組成的分子,該功能部分含有n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼寡核苷酸可操作連接。如果步驟(3)的功能部分包含反應(yīng)基團(tuán),則步驟1-3可以重復(fù)一次或多次,從而形成循環(huán)1至i,其中i是2或大于2的整數(shù),循環(huán)s的步驟(3)的產(chǎn)物成為循環(huán)s+1的起始化合物,其中s是i-1或更小的整數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種合成化合物文庫(kù)的方法,其中化合物包含功能部分,該功能部分包含兩個(gè)或更多的結(jié)構(gòu)單元,并且與標(biāo)識(shí)該功能部分結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可操作連接。該方法包括下列步驟(1)提供包含m種起始化合物的溶液,其中m是1或大于1的整數(shù),其中起始化合物由包含n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分組成,其中n是1或大于1的整數(shù),該功能部分與識(shí)別該n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的起始寡核苷酸可操作連接;(2)將步驟(1)的溶液分成r個(gè)部分,其中r是2或大于2的整數(shù);(3)每個(gè)部分中的起始化合物與r個(gè)結(jié)構(gòu)單元之一反應(yīng),從而產(chǎn)生r個(gè)部分,包含由與起始寡核苷酸可操作連接的功能部分組成的化合物,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元;(4)每個(gè)部分中的起始寡核苷酸與一組r個(gè)不同引入寡核苷酸之一反應(yīng),反應(yīng)條件適合所述引入寡核苷酸與起始寡核苷酸進(jìn)行酶連接,并存在催化所述引入寡核苷酸與起始寡核苷酸連接的酶,從而產(chǎn)生r個(gè)等份,包含由與延長(zhǎng)的寡核苷酸可操作連接的功能部分組成的分子,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,該延長(zhǎng)的寡核苷酸編碼(標(biāo)識(shí))該n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元。任選地,該方法可進(jìn)一步包括步驟(5)重新組合步驟(4)產(chǎn)生的r個(gè)部分,從而產(chǎn)生包含由功能部分組成的化合物的溶液,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元并且與延長(zhǎng)的寡核苷酸可操作連接。步驟(1)至(5)可以進(jìn)行一次或多次,產(chǎn)生循環(huán)1至i,其中i是2或大于2的整數(shù)。在循環(huán)s+1中,其中s是i-1或更小的整數(shù),步驟(1)的含有m種起始化合物的溶液是循環(huán)s的步驟(5)的溶液。同樣,循環(huán)s+1的步驟(1)的起始化合物是循環(huán)s的步驟(5)的化合物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,在每一步驟中用常規(guī)化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)單元。結(jié)構(gòu)單元可以偶聯(lián)產(chǎn)生直鏈或分支聚合物或低聚物,如肽、擬肽和類(lèi)肽,或非低聚物分子,如包含連接有一個(gè)或多個(gè)其他化學(xué)部分的支架結(jié)構(gòu)的分子。例如,如果結(jié)構(gòu)單元是氨基酸殘基,則該結(jié)構(gòu)單元可以用標(biāo)準(zhǔn)肽合成方法偶聯(lián),如本領(lǐng)域公知的應(yīng)用適當(dāng)保護(hù)/脫保護(hù)策略的溶液相或固相合成。優(yōu)選地,結(jié)構(gòu)單元采用溶液相化學(xué)法偶聯(lián)。編碼寡核苷酸是單鏈或雙鏈寡核苷酸,優(yōu)選雙鏈寡核苷酸。編碼寡核苷酸優(yōu)選是每個(gè)結(jié)構(gòu)單元有4-12個(gè)堿基或堿基對(duì)的寡核苷酸;編碼寡核苷酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)溶液相或固相寡核苷酸合成法偶聯(lián),但是優(yōu)選利用溶液相酶法偶聯(lián)。例如,如果編碼寡核苷酸的序列包含用于用一種這樣的酶進(jìn)行連接的起始序列的話(huà),則該寡核苷酸可以利用拓?fù)洚悩?gòu)酶、連接酶或DNA聚合酶偶聯(lián)。編碼寡核苷酸的酶偶聯(lián)具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)比標(biāo)準(zhǔn)合成(非酶)偶聯(lián)更高的添加精確度;和(2)應(yīng)用更簡(jiǎn)單的保護(hù)/脫保護(hù)策略。
另一方面,本發(fā)明提供式I的化合物 其中X是包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分;Z是在其3’末端與B連接的寡核苷酸;Y是在其5’末端與C連接的寡核苷酸;A是與X形成共價(jià)鍵的官能團(tuán);B是與Z的3’-末端形成鍵的官能團(tuán);C是與Y的5’-末端形成鍵的官能團(tuán);D、F和E各自獨(dú)立地是雙功能連接基團(tuán);且S是原子或分子支架。這樣的化合物包括應(yīng)用本發(fā)明的方法合成的那些化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種化合物文庫(kù),其包含含有功能部分的化合物,該功能部分包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼該功能部分結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可操作連接。這樣的文庫(kù)可包含約102至約1012或更多種不同的成員,例如102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或更多不同的成員,即不同的分子結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,該化合物文庫(kù)包含各自獨(dú)立地為式I的化合物
其中X是包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分;Z是在其3’末端與B連接的寡核苷酸;Y是在其5’末端與C連接的寡核苷酸;A是與X形成共價(jià)鍵的官能團(tuán);B是與Z的3’-末端形成鍵的官能團(tuán);C是與Y的5’-末端形成鍵的官能團(tuán);D、F和E各自獨(dú)立地是雙功能連接基團(tuán);且S是原子或分子支架。這樣的文庫(kù)包括應(yīng)用本發(fā)明的方法合成的那些文庫(kù)。
另一方面,本發(fā)明提供一種鑒定與生物靶標(biāo)結(jié)合的化合物的方法,該方法包括以下步驟(a)使該生物靶標(biāo)接觸本發(fā)明的化合物文庫(kù),其中該化合物文庫(kù)包括含有功能部分的化合物,該功能部分包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼該功能部分結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可操作連接。該步驟在適合化合物文庫(kù)的至少一個(gè)成員與該靶標(biāo)結(jié)合的條件下進(jìn)行;(2)除去不與該靶標(biāo)結(jié)合的文庫(kù)成員;(3)擴(kuò)增能與該靶標(biāo)結(jié)合的化合物文庫(kù)至少一個(gè)成員的編碼寡核苷酸;(4)對(duì)步驟(3)的編碼寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序;和利用步驟(5)測(cè)定的序列確定能與該生物靶標(biāo)結(jié)合的化合物文庫(kù)成員的功能部分的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明在鑒定具有所需性質(zhì)的分子方面具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如,本發(fā)明的方法允許在寡核苷酸標(biāo)簽的存在下使用許多化學(xué)反應(yīng)來(lái)構(gòu)建分子。本發(fā)明的方法也提供了向這樣產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)中引入寡核苷酸標(biāo)簽的高保真度手段。另外,它們能夠合成每個(gè)成員具有高拷貝數(shù)的文庫(kù),從而允許對(duì)生物靶標(biāo)進(jìn)行多輪篩選,而在最后一輪后剩余足夠數(shù)量的分子用于寡核苷酸標(biāo)簽的擴(kuò)增和測(cè)序。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是雙鏈寡核苷酸的連接的示意圖,其中起始寡核苷酸具有與引入寡核苷酸的突出端互補(bǔ)的突出端。起始鏈顯示為游離的、與氨基己基連接體偶聯(lián)的或通過(guò)氨基己基連接體與苯丙氨酸殘基偶聯(lián)的。
圖2是使用夾板(splint)鏈進(jìn)行寡核苷酸連接的示意圖。在該實(shí)施方案中,夾板是12-mer的寡核苷酸,其序列與單鏈起始寡核苷酸和單鏈引入寡核苷酸互補(bǔ)。
圖3是當(dāng)起始寡核苷酸是具有共價(jià)連接鏈的雙鏈,并且引入寡核苷酸是雙鏈時(shí),起始寡核苷酸與引入寡核苷酸連接的示意圖。
圖4是使用聚合酶延長(zhǎng)寡核苷酸的示意圖。起始鏈表示為游離的、與氨基己基連接體偶聯(lián)的或通過(guò)氨基己基連接體與苯丙氨酸殘基偶聯(lián)的。
圖5是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的合成循環(huán)的示意圖。
圖6是應(yīng)用本發(fā)明的文庫(kù)進(jìn)行多輪篩選過(guò)程的示意圖。
圖7是實(shí)施例1所述循環(huán)1至5中每一個(gè)的產(chǎn)物以及在封閉引物連接后的產(chǎn)物的電泳凝膠。分子量標(biāo)準(zhǔn)顯示于泳道1,用于DNA定量的hyperladder的指定量顯示于泳道9至12中。
圖8是利用疊氮化物-炔環(huán)加成作用偶聯(lián)結(jié)構(gòu)單元的示意圖。
圖9和10說(shuō)明通過(guò)氯代三嗪上的親核芳族取代偶聯(lián)結(jié)構(gòu)單元。
圖11顯示適合在功能部分合成中使用的代表性氯代雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)。
圖12說(shuō)明應(yīng)用疊氮化物/炔環(huán)加成反應(yīng)環(huán)化直鏈肽。
圖13A是如實(shí)施例2所述在循環(huán)4之后產(chǎn)生的文庫(kù)的層析圖。
圖13B是如實(shí)施例2所述在循環(huán)4之后產(chǎn)生的文庫(kù)的質(zhì)譜圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及制備化合物和組合化合物文庫(kù)的方法,通過(guò)本發(fā)明的方法制備的化合物和文庫(kù),和利用該文庫(kù)鑒定具有所需性質(zhì)如所需生物活性的化合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及應(yīng)用這些方法鑒定的化合物。
已經(jīng)應(yīng)用了多種方法來(lái)產(chǎn)生和篩查組合化學(xué)文庫(kù)。例子包括將文庫(kù)的各成員彼此物理分離的方法,例如當(dāng)在多個(gè)反應(yīng)容器的每一個(gè)中合成單一化合物時(shí)。但是,這些文庫(kù)一般一次篩選一種化合物,或者最多一次篩選幾種化合物,因此不能獲得最有效的篩選過(guò)程。在另外一些方法中,在固體支持體上合成化合物。這樣的固體支持體包括芯片,其中特定化合物占據(jù)芯片或膜上的特定區(qū)域(“可定位的”)。在另外一些方法中,在珠上合成化合物,每個(gè)珠含有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
在篩查大文庫(kù)時(shí)遇到的兩個(gè)困難是(1)可以篩選的不同化合物的數(shù)量;和(2)在篩選中有活性的化合物的鑒定。在一種方法中,在篩選中有活性的化合物如下鑒定將原始文庫(kù)縮小為更小的部分或亞部,在每種情況下都選擇含有活性化合物的部分或亞部,并且進(jìn)一步再分,直到獲得含有一組化合物的足夠小的活性亞部,以致該亞部的所有成員能夠單獨(dú)合成,并且評(píng)價(jià)所需的活性。這是一項(xiàng)單調(diào)的、費(fèi)時(shí)的工作。
解析組合文庫(kù)篩查結(jié)果的另外一種方法是利用這樣的文庫(kù),其中該文庫(kù)的成員用識(shí)別標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記,即,該文庫(kù)中存在的每個(gè)標(biāo)簽都與該文庫(kù)中存在的不同化合物結(jié)構(gòu)相關(guān),因此該標(biāo)簽的識(shí)別指出了標(biāo)記分子的結(jié)構(gòu)。一種標(biāo)記文庫(kù)方法使用寡核苷酸標(biāo)簽,如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,573,905;5,708,153;5,723,598,6,060,596,公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO 93/06121;WO93/20242;WO 94/13623;WO 00/23458;WO 02/074929和WO02/103008,Brenner和Lerner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,5381-5383(1992);Nielsen和Janda(MethodsA Companion to Methods inEnzymology 6,361-371(1994);Nielsen,Brenner和Janda(J.Am.Chem.Soc.115,9812-9813(1993))所述,這些文獻(xiàn)均在此全文引用作為參考。這樣的標(biāo)簽可以利用如聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增,產(chǎn)生多個(gè)標(biāo)簽拷貝,并且通過(guò)測(cè)序鑒定該標(biāo)簽。標(biāo)簽的序列確定了結(jié)合分子的結(jié)構(gòu),這些分子可以以純的形式合成并且檢測(cè)。迄今為止,還沒(méi)有報(bào)道使用Lerner等人公開(kāi)的方法制備大文庫(kù)。本發(fā)明提供了產(chǎn)生DNA-編碼文庫(kù)的方法的改進(jìn),以及利用溶液相合成法合成功能部分的DNA編碼分子大(105個(gè)成員或更多)文庫(kù)的首批實(shí)例。
本發(fā)明提供了一種方法,該方法允許容易地合成寡核苷酸編碼的組合文庫(kù),并且提供向大分子集合的每個(gè)成員上添加這種寡核苷酸標(biāo)簽的有效、高保真的手段。
本發(fā)明的方法包括合成雙功能分子的方法,該雙功能分子包含由結(jié)構(gòu)單元組成的第一部分(“功能部分”),和與第一部分可操作連接的第二部分,第二部分包含標(biāo)識(shí)第一部分的結(jié)構(gòu)的寡核苷酸標(biāo)簽,即該寡核苷酸標(biāo)簽指示在第一部分構(gòu)建中使用了哪些結(jié)構(gòu)單元,以及結(jié)構(gòu)單元連接的順序。通常,寡核苷酸標(biāo)簽提供的信息足以確定用來(lái)構(gòu)建活性部分的結(jié)構(gòu)單元。在某些實(shí)施方案中,寡核苷酸標(biāo)簽的序列足以確定功能部分中結(jié)構(gòu)單元的排列,例如,對(duì)于擬肽,為氨基酸序列。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“功能部分”是指包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的化學(xué)部分。優(yōu)選地,功能部分中的結(jié)構(gòu)單元不是核酸。功能部分可以是直鏈或支鏈或環(huán)形的聚合物或寡聚物或有機(jī)小分子。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)單元”是與其他化學(xué)結(jié)構(gòu)單位連接的,或者能夠與其他這樣的單位連接的化學(xué)結(jié)構(gòu)單位。當(dāng)功能部分是多聚的或寡聚的時(shí),結(jié)構(gòu)單元是聚合物或寡聚物的單體單元。結(jié)構(gòu)單元也可以包括支架結(jié)構(gòu)(“支架結(jié)構(gòu)單元”),支架結(jié)構(gòu)上連接有或者可以連接一個(gè)或多個(gè)其他的結(jié)構(gòu)(“周?chē)Y(jié)構(gòu)單元”)。
應(yīng)當(dāng)理解,此處使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)單元”是指存在于功能部分中的,也指以反應(yīng)性形式用于合成功能部分的化學(xué)結(jié)構(gòu)單位。在功能部分內(nèi),結(jié)構(gòu)單元不含由于將該結(jié)構(gòu)單元摻入功能部分中而丟失的結(jié)構(gòu)單元的任何部分。例如,在鍵形成反應(yīng)釋放小分子的情況中(見(jiàn)下文),存在于功能部分中的結(jié)構(gòu)單元是“結(jié)構(gòu)單元?dú)埢?,即,在貢獻(xiàn)釋放分子的原子丟失后在合成中使用的結(jié)構(gòu)單元的剩余部分。
結(jié)構(gòu)單元可以是互補(bǔ)的任何化學(xué)化合物,即結(jié)構(gòu)單元必須能夠一起反應(yīng),形成含有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的結(jié)構(gòu)。一般地說(shuō),使用的所有結(jié)構(gòu)單元都具有至少兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán),盡管也可能有一些使用的結(jié)構(gòu)單元(例如在寡聚功能部分中的最后一個(gè)結(jié)構(gòu)單元)各自只含有一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)。兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)單元上的反應(yīng)基團(tuán)應(yīng)當(dāng)互補(bǔ),即,能夠一起反應(yīng)形成共價(jià)鍵,任選地伴隨小分子如水、HCl、HF等的丟失。
為了本目的,如果兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)能夠一起反應(yīng)形成共價(jià)鍵,則它們互補(bǔ)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,鍵形成反應(yīng)在環(huán)境條件下快速發(fā)生,基本不形成副產(chǎn)物。優(yōu)選地,特定反應(yīng)基團(tuán)將與特定互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)正好一次。在一個(gè)實(shí)施方案中,兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元的互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)例如通過(guò)親核取代反應(yīng),形成共價(jià)鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中,一對(duì)互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)的一個(gè)成員是親電子基團(tuán),而另一個(gè)成員是親核基團(tuán)。
互補(bǔ)親電子和親核基團(tuán)包括在適當(dāng)條件下通過(guò)親核取代反應(yīng)形成共價(jià)鍵的任何兩個(gè)基團(tuán)。許多合適的鍵形成反應(yīng)在本領(lǐng)域中公知。參見(jiàn),例如,March,Advanced Organic Chemistry,第四版,New YorkJohnWiley and Sons(1992),第10-16章;Carey和Sundberg,Advanced OrganicChemistry,Part B,Plenum(1990),第1-11章;和Collman等,Principles andApplications of Organotransition Metal Chemistry,University ScienceBooks,Mill Valley,Calif.(1987),第13-20章;均在此全文引用作為參考。合適的親電子基團(tuán)的例子包括反應(yīng)性羰基,如酰氯基,酯基,包括羰基五氟苯酯和琥珀酰亞胺酯,酮基和醛基;反應(yīng)性磺?;?,如磺酰氯基,和反應(yīng)性膦酰基。其他親電子基團(tuán)包括末端環(huán)氧基、異氰酸酯基和烷基鹵。合適的親核基團(tuán)包括伯氨基、仲氨基、羥基和羧基。
合適的互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)在下面描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定可在本方法中使用的其他反應(yīng)基團(tuán)對(duì),此處提供的實(shí)例不是限制性的。
在第一個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)包括活化的羧基、反應(yīng)性磺?;蚍磻?yīng)性膦?;蛩鼈兊慕M合,和伯氨基或仲氨基。在該實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)在適當(dāng)條件下反應(yīng),形成酰胺、磺酰胺或磷酰胺鍵。
在第二個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)包括環(huán)氧基和伯氨基或仲氨基。含環(huán)氧化物的結(jié)構(gòu)單元與含胺的結(jié)構(gòu)單元在適當(dāng)條件下反應(yīng),形成碳-氮鍵,生成β-氨基醇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)包括吖丙啶基和伯氨基或仲氨基。在適當(dāng)條件下,含吖丙啶的結(jié)構(gòu)單元與含胺的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng),形成碳-氮鍵,生成1,2-二胺。在第三個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)包括異氰酸酯基和伯氨基或仲氨基。含異氰酸酯的結(jié)構(gòu)單元將與含胺的結(jié)構(gòu)單元在適當(dāng)條件下反應(yīng),形成碳-氮鍵,生成脲基。
在第四個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)包括異氰酸酯基和羥基。含異氰酸酯的結(jié)構(gòu)單元將與含羥基的結(jié)構(gòu)單元在適當(dāng)條件下反應(yīng),形成碳-氧鍵,生成氨基甲酸酯基。
在第五個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)包括氨基和含羰基的基團(tuán),如醛基或酮基。胺與這些基團(tuán)通過(guò)還原性胺化反應(yīng),形成新的碳-氮鍵。
在第六個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)包括磷葉立德基和醛基或酮基。含磷葉立德的結(jié)構(gòu)單元將與含醛或酮的結(jié)構(gòu)單元在適當(dāng)條件下反應(yīng),形成碳-碳雙鍵,生成烯。
在第七個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)通過(guò)環(huán)加成作用反應(yīng),形成環(huán)結(jié)構(gòu)。這樣的互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)的一個(gè)例子是炔和有機(jī)疊氮化物,它們?cè)谶m當(dāng)條件下反應(yīng),形成三唑環(huán)結(jié)構(gòu)。使用這種反應(yīng)連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元的一個(gè)例子在圖8中顯示。用于這樣的反應(yīng)的適當(dāng)條件在本領(lǐng)域中公知,包括WO 03/101972公開(kāi)的那些,該專(zhuān)利的全部?jī)?nèi)容在此引用作為參考。
在第八個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)是烷基鹵和親核基團(tuán),如氨基、羥基或羧基。這些基團(tuán)在適當(dāng)條件下反應(yīng),形成碳-氮(烷基鹵加胺)或碳-氧(烷基鹵加羥基或羧基)。
在第九個(gè)實(shí)施方案中,互補(bǔ)官能團(tuán)是鹵代雜芳基和親核基團(tuán),結(jié)構(gòu)單元在適當(dāng)條件下通過(guò)芳香親核取代連接。合適的鹵代雜芳基包括氯代嘧啶、三嗪和嘌呤,它們與親核物質(zhì)如胺在水溶液中在溫和條件下反應(yīng)。寡核苷酸標(biāo)記的三氯三嗪與胺反應(yīng)的代表性例子在圖9和10中顯示。合適的氯代雜芳基的例子在圖11中顯示。
應(yīng)當(dāng)理解,功能部分的合成可以通過(guò)一種特定類(lèi)型的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行,例如但不限于以上所述反應(yīng)中的一種,或者通過(guò)兩種或多種偶聯(lián)反應(yīng)如以上所述的兩種或多種偶聯(lián)反應(yīng)的組合進(jìn)行。例如,在一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)酰胺鍵形成(氨基和羧酸互補(bǔ)基團(tuán))和還原性胺化(氨基和醛或酮互補(bǔ)基團(tuán))的組合,結(jié)構(gòu)單元連接在一起??梢允褂萌魏闻悸?lián)化學(xué)方法,只要與寡核苷酸的存在相匹配。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中使用的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸標(biāo)簽在化學(xué)上比單鏈標(biāo)簽更強(qiáng),因此,容許較寬的反應(yīng)條件范圍,并且能夠采用用單鏈標(biāo)簽不可能進(jìn)行的鍵形成反應(yīng)。
除了反應(yīng)基團(tuán)或形成功能部分使用的基團(tuán)以外,結(jié)構(gòu)單元還可包含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)。一個(gè)或多個(gè)這樣的其他官能團(tuán)可以受到保護(hù),以阻止這些官能團(tuán)的不需要的反應(yīng)。用于多種官能團(tuán)的合適的保護(hù)基在本領(lǐng)域中公知(Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第二版,New YorkJohn Wiley and Sons(1991),在此引用作為參考)。特別有用的保護(hù)基包括叔丁基酯和醚、縮醛、三苯甲基醚和胺、乙?;?、三甲基硅烷基醚、三氯乙基醚和酯和氨基甲酸酯。
在一個(gè)實(shí)施方案中,每個(gè)結(jié)構(gòu)單元都含有兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán),這兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可以相同也可以不同。例如,在循環(huán)s中添加的每個(gè)結(jié)構(gòu)單元可以包含兩個(gè)相同的反應(yīng)基團(tuán),但是它們均與步驟s-1和s+1添加的結(jié)構(gòu)單元的反應(yīng)基團(tuán)互補(bǔ)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中,每個(gè)結(jié)構(gòu)單元都含有兩個(gè)自身互補(bǔ)的反應(yīng)基團(tuán)。例如,包含聚酰胺分子的文庫(kù)可以通過(guò)含有兩個(gè)伯氨基的結(jié)構(gòu)單元與含有兩個(gè)活化羧基的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)產(chǎn)生。產(chǎn)生的化合物沒(méi)有N-末端或C-末端,因?yàn)榻惶娴孽0坊哂邢喾吹姆较蛐浴;蛘撸埘0肺膸?kù)也可以用各自含有氨基和活化羧基的結(jié)構(gòu)單元產(chǎn)生。在該實(shí)施方案中,在循環(huán)的步驟n中添加的結(jié)構(gòu)單元具有游離的反應(yīng)基團(tuán),該反應(yīng)基團(tuán)與n-1結(jié)構(gòu)單元上可用的反應(yīng)基團(tuán)互補(bǔ),而優(yōu)選地,第n個(gè)結(jié)構(gòu)單元上的另一反應(yīng)基團(tuán)受到保護(hù)。例如,如果該文庫(kù)的成員從C向N方向合成,則添加的結(jié)構(gòu)單元將包含活化的羧基和受到保護(hù)的氨基。
功能部分可以是多聚或寡聚部分,如肽、擬肽、肽核酸或類(lèi)肽,或者它們可以是非聚合的小分子,例如具有包含中央支架的結(jié)構(gòu)和繞支架周?chē)帕械慕Y(jié)構(gòu)的分子。直鏈多聚或寡聚文庫(kù)通過(guò)使用具有兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元產(chǎn)生,而分支多聚或寡聚文庫(kù)通過(guò)使用具有三個(gè)或更多反應(yīng)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元產(chǎn)生,任選地與只具有兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元組合。這樣的分子可以表示為通式X1X2...Xn,其中每一個(gè)X都是含有n個(gè)單體單元的聚合物的單體單元,其中n是大于1的整數(shù)。對(duì)于寡聚或多聚化合物,末端結(jié)構(gòu)單元不需要含有兩個(gè)官能團(tuán)。例如,對(duì)于聚酰胺文庫(kù),C-末端結(jié)構(gòu)單元可包含氨基,但是羧基的存在是任選的。類(lèi)似地,N末端的結(jié)構(gòu)單元可包含羧基,但是不需要含有氨基。
分支寡聚或多聚化合物也可以合成,只要至少一個(gè)結(jié)構(gòu)單元包含三個(gè)可與其他結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)的官能團(tuán)。本發(fā)明的文庫(kù)可包含直鏈分子、支鏈分子或它們的組合。
也可以應(yīng)用如含有兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的支架結(jié)構(gòu)單元,與只具有一個(gè)可用反應(yīng)基團(tuán)的其他結(jié)構(gòu)單元組合,來(lái)構(gòu)建文庫(kù),例如在任何其他反應(yīng)基團(tuán)被保護(hù)或者不與該支架結(jié)構(gòu)單元中存在的其他反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中,例如,合成的分子可以表示為通式X(Y)n,其中X是支架結(jié)構(gòu)單元;每個(gè)Y都是與X連接的結(jié)構(gòu)單元,n是至少為2的整數(shù),優(yōu)選2至大約6的整數(shù)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,循環(huán)1的起始結(jié)構(gòu)單元是支架結(jié)構(gòu)單元。在通式X(Y)n的分子中,每個(gè)Y可以相同或不同,但是在典型文庫(kù)的大多數(shù)成員中,每個(gè)Y都將不同。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的文庫(kù)包含聚酰胺化合物。聚酰胺化合物可以由來(lái)源于任何氨基酸的結(jié)構(gòu)單元組成,這些氨基酸包括20個(gè)天然存在的α-氨基酸,如丙氨酸(Ala;A)、甘氨酸(Gly;G)、天冬酰胺(Asn;N)、天冬氨酸(Asp;D)、谷氨酸(Glu;E)、組氨酸(His;H)、亮氨酸(Leu;L)、賴(lài)氨酸(Lys;K)、苯丙氨酸(Phe;F)、酪氨酸(Tyr;Y)、蘇氨酸(Thr;T)、絲氨酸(Ser;S)、精氨酸(Arg;R)、纈氨酸(Val;V)、谷氨酰胺(Gln;Q)、異亮氨酸(Ile;I)、半胱氨酸(Cys;C)、甲硫氨酸(Met;M)、脯氨酸(Pro;P)和色氨酸(Trp;W),其中給出了每個(gè)氨基酸的三字母和單字母編碼。在它們的天然存在的形式中,上述每個(gè)氨基酸都以L(fǎng)-構(gòu)型存在,除非另外指出,此處即這樣假設(shè)。但是在本方法中,也可以使用這些氨基酸的D-構(gòu)型形式。這些D-氨基酸在此用小寫(xiě)三字母或單字母編碼表示,即,ala(a)、gly(g)、leu(l)、gln(q)、thr(t)、ser(s)等。結(jié)構(gòu)單元也可以來(lái)源于其他α-氨基酸,包括但不限于3-芳基丙氨酸,如萘基丙氨酸、苯基取代的苯丙氨酸,包括4-氟-、4-氯、4-溴和4-甲基苯丙氨酸;3-雜芳基丙氨酸,如3-吡啶基丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、3-喹啉基丙氨酸和3-咪唑基丙氨酸;鳥(niǎo)氨酸;瓜氨酸;高瓜氨酸;肌氨酸;高脯氨酸;高半胱氨酸;取代的脯氨酸,如羥脯氨酸和氟脯氨酸;脫氫脯氨酸;正亮氨酸;O-甲基酪氨酸;O-甲基絲氨酸;O-甲基蘇氨酸和3-環(huán)己基丙氨酸。上述每個(gè)氨基酸都可以以D-或L-構(gòu)型使用。
結(jié)構(gòu)單元也可以是非α-氨基酸的氨基酸,如α-氮雜氨基酸;β,γ,δ,ε-氨基酸,和N-取代的氨基酸,如N-取代的甘氨酸,其中N-取代基可以是例如取代的或未取代的烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。在一個(gè)實(shí)施方案中,N-取代基是來(lái)自天然存在的或非天然存在的α-氨基酸的側(cè)鏈。
結(jié)構(gòu)單元也可以是擬肽結(jié)構(gòu),如二肽、三肽、四肽或五肽模擬物。這樣的擬肽結(jié)構(gòu)單元優(yōu)選來(lái)源于氨?;衔?,使得將這些結(jié)構(gòu)單元添加到生長(zhǎng)的聚(氨酰)基上的化學(xué)與用于其他結(jié)構(gòu)單元的化學(xué)相同或相似。結(jié)構(gòu)單元也可以是能夠形成與肽鍵電子等排的鍵的分子,形成包含肽骨架修飾的擬肽功能部分,如ψ[CH2S]、ψ[CH2NH]、ψ[CSNH2]、ψ[NHCO]、ψ[COCH2]和ψ[(E)或(Z)CH=CH]。在以上使用的命名中,ψ表示不存在酰胺鍵。代替酰胺基的結(jié)構(gòu)在括號(hào)內(nèi)指出。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種合成化合物的方法,該化合物包含或由與編碼寡核苷酸可操作連接的功能部分組成。該方法包括下列步驟(1)提供由包含n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的起始功能部分組成的起始化合物,其中n是1或大于1的整數(shù),其中該起始功能部分含有至少一個(gè)反應(yīng)基團(tuán),并且其中該起始功能部分與編碼n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的起始寡核苷酸可操作連接;(2)將該起始化合物與包含至少一個(gè)互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng),其中該至少一個(gè)互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)與步驟(1)的反應(yīng)基團(tuán)互補(bǔ),反應(yīng)條件適合所述反應(yīng)基團(tuán)與互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵;(3)將起始寡核苷酸與引入寡核苷酸反應(yīng),反應(yīng)條件適合所述引入寡核苷酸與起始寡核苷酸連接,并存在催化所述起始寡核苷酸與引入寡核苷酸連接的酶,從而產(chǎn)生包含功能部分或由該功能部分組成的分子,該功能部分含有n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼寡核苷酸可操作連接。如果步驟(3)的功能部分包含反應(yīng)基團(tuán),則步驟1-3可以重復(fù)一次或多次,從而形成循環(huán)1至i,其中i是2或大于2的整數(shù),循環(huán)s-1的步驟(3)的產(chǎn)物成為循環(huán)s的步驟(1)的起始化合物,其中s是i或更小的整數(shù)。在每個(gè)循環(huán)中,一個(gè)結(jié)構(gòu)單元添加到生長(zhǎng)的功能部分上,并且編碼新結(jié)構(gòu)單元的一個(gè)寡核苷酸序列添加到生長(zhǎng)的編碼寡核苷酸上。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,每個(gè)單個(gè)結(jié)構(gòu)單元與不同的寡核苷酸相聯(lián),使得在特定循環(huán)中添加的寡核苷酸中的核苷酸序列標(biāo)識(shí)在同一循環(huán)中添加的結(jié)構(gòu)單元。
結(jié)構(gòu)單元的偶聯(lián)和寡核苷酸的連接通常在相似濃度的起始材料和試劑中發(fā)生。例如,為了使結(jié)構(gòu)單元有效偶聯(lián),優(yōu)選約為微摩爾至毫摩爾例如約10μM至約10mM的反應(yīng)物濃度。
在某些實(shí)施方案中,該方法在步驟(2)之后進(jìn)一步包括清除任何未反應(yīng)的起始功能部分的步驟。清除特定循環(huán)中任何未反應(yīng)的起始功能部分防止了該循環(huán)的起始功能部分與后一循環(huán)中添加的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)。這樣的反應(yīng)可導(dǎo)致產(chǎn)生丟失了一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分,可能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于特定寡核苷酸序列的一系列功能部分結(jié)構(gòu)。這種清除可以通過(guò)任何剩余的起始功能部分與可與步驟(2)的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的化合物進(jìn)行反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地,清除化合物與步驟(2)的反應(yīng)基團(tuán)快速反應(yīng),并且不含能夠與后一循環(huán)中添加的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)的另外的反應(yīng)基團(tuán)。例如,在步驟(2)的反應(yīng)基團(tuán)是氨基的化合物合成中,適合的清除化合物是N-羥基琥珀酰亞胺酯,如乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。
在另一實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種制備化合物文庫(kù)的方法,其中每個(gè)化合物都包含功能部分,該功能部分包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元?dú)埢?,并且與寡核苷酸可操作連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,每個(gè)分子中存在的寡核苷酸提供了足以鑒別該分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)單元和任選地結(jié)構(gòu)單元添加順序的信息。在該實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法包括一種合成化合物文庫(kù)的方法,其中該化合物包含功能部分,該功能部分包括兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與標(biāo)識(shí)該功能部分結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可操作連接。該方法包括步驟(1)提供包含m種起始化合物的溶液,其中m是1或大于1的整數(shù),其中起始化合物由包含n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分組成,其中n是1或大于1的整數(shù),該功能部分與標(biāo)識(shí)該n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的起始寡核苷酸可操作連接;(2)將步驟(1)的溶液分配到至少r個(gè)反應(yīng)容器中,其中r是2或大于2的整數(shù);(3)將每個(gè)部分與r個(gè)結(jié)構(gòu)單元之一反應(yīng),從而產(chǎn)生r個(gè)等份,包含由功能部分組成的化合物,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與起始寡核苷酸可操作連接;(4)將步驟(3)的r個(gè)部分中的每一個(gè)與一組r個(gè)不同引入寡核苷酸之一反應(yīng),反應(yīng)條件適合所述引入寡核苷酸與起始寡核苷酸發(fā)生酶連接,從而產(chǎn)生r個(gè)部分,包含由功能部分組成的分子,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼該n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元的延長(zhǎng)的寡核苷酸可操作連接。任選地,該方法可進(jìn)一步包括步驟(5)重新組合步驟(4)中產(chǎn)生的r個(gè)部分,從而產(chǎn)生包含由功能部分組成的分子的溶液,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼該n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元的延長(zhǎng)的寡核苷酸可操作連接。步驟(1)至(5)可以進(jìn)行一次或多次,以產(chǎn)生循環(huán)1至i,其中i是2或大于2的整數(shù)。在循環(huán)s+1中,其中s是i-1或更小的整數(shù),步驟(1)的含有m種起始化合物的溶液是循環(huán)s的步驟(5)的溶液。同樣,循環(huán)s+1的步驟(1)的起始化合物是循環(huán)s的步驟(4)的產(chǎn)物。
優(yōu)選地,在文庫(kù)合成的每個(gè)循環(huán)中將步驟(2)的溶液分成r個(gè)部分。在該實(shí)施方案中,每個(gè)部分與獨(dú)特結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)。
在本發(fā)明的方法中,結(jié)構(gòu)單元和引入寡核苷酸的添加順序不是關(guān)鍵,分子合成的步驟(2)和(3),和文庫(kù)合成中的步驟(3)和(4)可以顛倒,即在添加新結(jié)構(gòu)單元之前,引入寡核苷酸可以與起始寡核苷酸連接。在某些實(shí)施方案中,可以同時(shí)進(jìn)行這兩個(gè)步驟。
在某些實(shí)施方案中,該方法在步驟(2)之后進(jìn)一步包括清除任何未反應(yīng)的起始功能部分的步驟。清除特定循環(huán)中任何未反應(yīng)的起始功能部分防止了該循環(huán)的起始功能部分與后一循環(huán)中添加的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)。這樣的反應(yīng)可導(dǎo)致產(chǎn)生丟失了一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分,可能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于特定寡核苷酸序列的一系列功能部分結(jié)構(gòu)。這種清除可以通過(guò)任何剩余的起始功能部分與可與步驟(2)的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的化合物進(jìn)行反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地,清除化合物與步驟(2)的反應(yīng)基團(tuán)快速反應(yīng),并且不含能夠與后一循環(huán)中添加的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)的另外的反應(yīng)基團(tuán)。例如,在步驟(2)的反應(yīng)基團(tuán)是氨基的化合物合成中,適合的清除化合物是N-羥基琥珀酰亞胺酯,如乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。
在一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)評(píng)價(jià)候選結(jié)構(gòu)單元與適當(dāng)互補(bǔ)官能團(tuán)在用于合成文庫(kù)的條件下反應(yīng)的能力,從一組候選結(jié)構(gòu)單元中選擇文庫(kù)合成中使用的結(jié)構(gòu)單元。然后可以選擇在這些條件下顯示適當(dāng)反應(yīng)性的結(jié)構(gòu)單元,用于引入文庫(kù)中。任選地可以純化特定循環(huán)的產(chǎn)物。當(dāng)循環(huán)是中間循環(huán)時(shí),即,最終循環(huán)之前的任何循環(huán)時(shí),這些產(chǎn)物是中間產(chǎn)物,可以在下一循環(huán)開(kāi)始前純化。如果該循環(huán)是最后一次循環(huán),則該循環(huán)的產(chǎn)物是終產(chǎn)物,可以在該化合物的任何應(yīng)用前純化。該純化步驟可以例如除去未反應(yīng)的或過(guò)量的反應(yīng)物和用于寡核苷酸連接的酶??梢允褂眠m合將產(chǎn)物與溶液中存在的其他物質(zhì)進(jìn)行分離的任何方法,包括液相色譜,如高效液相色譜(HPLC),和用合適的共溶劑如乙醇沉淀。合適的純化方法依賴(lài)于產(chǎn)物的性質(zhì)和用于合成的溶劑系統(tǒng)。
反應(yīng)優(yōu)選地在水溶液如緩沖水溶液中進(jìn)行,但是也可以在與結(jié)構(gòu)單元、寡核苷酸、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的溶解性質(zhì)和用于催化寡核苷酸連接的酶相匹配的混合水/有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行。
應(yīng)當(dāng)理解,上述方法中特定循環(huán)產(chǎn)生的化合物的理論數(shù)目是該循環(huán)中使用的不同起始化合物的數(shù)目m與循環(huán)中添加的不同結(jié)構(gòu)單元的數(shù)目r的積。循環(huán)中產(chǎn)生的不同化合物的實(shí)際數(shù)目可以高達(dá)r和m的積(r×m),但是如果某些結(jié)構(gòu)單元與某些其他結(jié)構(gòu)單元的反應(yīng)性有差異的話(huà),則可能較低。例如,向特定起始化合物上添加特定結(jié)構(gòu)單元的動(dòng)力學(xué)可能是,在合成循環(huán)的時(shí)間尺度上,可能產(chǎn)生很少的反應(yīng)產(chǎn)物,甚至不產(chǎn)生產(chǎn)物。
在某些實(shí)施方案中,在循環(huán)1之前、最后一次循環(huán)之后或任意兩次循環(huán)之間加入通用結(jié)構(gòu)單元。例如,當(dāng)功能部分是聚酰胺時(shí),可以在最后一次循環(huán)后加入通用N-末端加帽結(jié)構(gòu)單元。也可以在任意兩個(gè)循環(huán)之間引入通用結(jié)構(gòu)單元,例如添加官能團(tuán),如炔基或疊氮基,它們可以在文庫(kù)合成后例如通過(guò)環(huán)化用來(lái)修飾功能部分。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“可操作連接”是指兩個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)以一種方式連接在一起,使得它們經(jīng)受預(yù)期的各種操作后仍保持連接。一般來(lái)說(shuō),功能部分和編碼寡核苷酸通過(guò)合適的連接基團(tuán)共價(jià)連接。該連接基團(tuán)是具有寡核苷酸連接部位和功能部分連接部位的二價(jià)部分。例如,當(dāng)功能部分是聚酰胺化合物時(shí),該聚酰胺化合物可以與連接基團(tuán)在其N(xiāo)-末端、C-末端或通過(guò)一個(gè)側(cè)鏈上的官能團(tuán)連接。該連接基團(tuán)足以通過(guò)至少一個(gè)原子,優(yōu)選一個(gè)以上原子,如至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)原子,分隔聚酰胺化合物和寡核苷酸。優(yōu)選地,該連接基團(tuán)具有充分的柔性,可使聚酰胺化合物與靶分子以不依賴(lài)于該寡核苷酸的方式結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中,連接基團(tuán)與聚酰胺化合物的N-末端和寡核苷酸的5’-磷酸基連接。例如,連接基團(tuán)可以來(lái)源于在一個(gè)末端上含有活化羧基而在另一末端上含有活化酯的連接基團(tuán)前體。連接基團(tuán)前體與N-末端氮原子的反應(yīng)將形成一個(gè)酰胺鍵,將該連接基團(tuán)與聚酰胺化合物或N-末端結(jié)構(gòu)單元連接在一起,而連接基團(tuán)前體與寡核苷酸的5’-羥基的反應(yīng)將導(dǎo)致寡核苷酸與連接基團(tuán)通過(guò)酯鍵連接。連接基團(tuán)可包括,例如聚亞甲基鏈,如-(CH2)n-鏈,或聚(乙二醇)鏈,如-(CH2CH2O)n鏈,其中在兩種情況中,n都是1至約20的整數(shù)。優(yōu)選地,n為2至約12,更優(yōu)選約4至約10。在一個(gè)實(shí)施方案中,連接基團(tuán)包括環(huán)己基(-(CH2)6-)。
當(dāng)結(jié)構(gòu)單元是氨基酸殘基時(shí),得到的功能部分是聚酰胺。可以利用用于形成酰胺鍵的任何合適的化學(xué)方法將氨基酸偶聯(lián)。優(yōu)選地,氨基酸結(jié)構(gòu)單元的偶聯(lián)在與寡核苷酸的酶連接相匹配的條件下進(jìn)行,例如在中性或接近中性的pH和水溶液中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中,聚酰胺化合物以C-末端到N-末端的方向合成。在該實(shí)施方案中,第一個(gè),或者C-末端的結(jié)構(gòu)單元在其羧基處與寡核苷酸通過(guò)合適的連接基團(tuán)連接。第一個(gè)結(jié)構(gòu)單元與第二個(gè)結(jié)構(gòu)單元反應(yīng),第二個(gè)結(jié)構(gòu)單元優(yōu)選具有活化的羧基和受到保護(hù)的氨基??梢允褂眠m合溶液相酰胺鍵形成的任何活化/保護(hù)基團(tuán)策略。例如,合適的活化羧基類(lèi)型包括酰氟(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,360,928,在此全文引用作為參考)、對(duì)稱(chēng)酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺酯。如本領(lǐng)域所知,通過(guò)與合適的活化化合物反應(yīng),酰基也可以原位活化。合適的活化化合物包括二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、正丙烷-膦酸酐(PPA)、N,N-二(2-氧-3- 唑烷基)亞氨基-磷酰氯(BOP-Cl)、溴-三-吡咯烷基磷六氟磷酸(PyBrop)、二苯基磷?;B氮化物(DPPA)、Castro′s試劑(BOP,PyBop)、O-苯并三唑基-N,N,N′,N′-四甲基脲鹽(HBTU)、二乙基磷酰氰(DEPCN)、2,5-聯(lián)苯基-2,3-二氫-3-氧-4-羥基-噻吩二氧化物(Steglich′s試劑;HOTDO)、1,1′-羰基-二咪唑(CDI)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉氯(DMT-MM)。偶聯(lián)試劑可以單獨(dú)使用或者與添加劑如N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)、N-羥基-苯并三唑(HOBt)、N-羥基苯并三嗪(HOOBt)、N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)、N-羥基氮雜苯并三唑(HOAt)、氮雜苯并三唑基-四甲基脲鹽(HATU,HAPyU)或2-羥基吡啶組合使用。在某些實(shí)施方案中,文庫(kù)的合成需要使用兩個(gè)或多個(gè)活化策略,以能夠使用結(jié)構(gòu)上多樣化的一組結(jié)構(gòu)單元。對(duì)于每個(gè)結(jié)構(gòu)單元,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定合適的活化策略。
N末端保護(hù)基可以是與該方法的條件相匹配的任何保護(hù)基,例如,適合溶液相合成條件的保護(hù)基。一種優(yōu)選的保護(hù)基是芴甲氧羰基(“Fmoc”)。氨?;Y(jié)構(gòu)單元側(cè)鏈上的任何潛在反應(yīng)性官能團(tuán)也可能需要適當(dāng)保護(hù)。優(yōu)選地,側(cè)鏈保護(hù)基與N末端保護(hù)基正交,即,在不同于除去N末端保護(hù)基所需條件的條件下除去該側(cè)鏈保護(hù)基。合適的側(cè)鏈保護(hù)基包括硝基藜蘆基,它可以用來(lái)既保護(hù)側(cè)鏈羧基又保護(hù)側(cè)鏈氨基。另外一種合適的側(cè)鏈胺保護(hù)基是N-戊-4-烯酰基。
結(jié)構(gòu)單元可以在摻入功能部分后修飾,例如,通過(guò)涉及一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元上的官能團(tuán)的適當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行。結(jié)構(gòu)單元修飾可以在添加最后一個(gè)結(jié)構(gòu)單元后發(fā)生,或者在功能部分合成的任一中間點(diǎn)發(fā)生,例如,在合成過(guò)程的任一循環(huán)后發(fā)生。當(dāng)合成本發(fā)明的雙功能分子文庫(kù)時(shí),可以對(duì)整個(gè)文庫(kù)或文庫(kù)的一部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)單元修飾,從而提高文庫(kù)的復(fù)雜程度。合適的結(jié)構(gòu)單元修飾反應(yīng)包括可以在與功能部分和編碼寡核苷酸相匹配的條件下進(jìn)行的那些反應(yīng)。這樣的反應(yīng)的例子包括氨基或羥基的酰化和磺化、氨基的烷基化、羧基的酯化或硫酯化、羧基的酰胺化、烯的環(huán)氧化和本領(lǐng)域公知的其他反應(yīng)。當(dāng)功能部分包括含有炔或疊氮官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元時(shí),可以利用疊氮/炔的環(huán)加成反應(yīng)衍生化該結(jié)構(gòu)單元。例如,包含炔的結(jié)構(gòu)單元可與有機(jī)疊氮化物反應(yīng),或者包含疊氮的結(jié)構(gòu)單元可與炔反應(yīng),在任一種情況下都形成三唑。結(jié)構(gòu)單元修飾反應(yīng)可以在添加最后一個(gè)結(jié)構(gòu)單元后發(fā)生,或者在合成過(guò)程的中間點(diǎn)處發(fā)生,并且能夠用來(lái)向功能部分上添加多種化學(xué)結(jié)構(gòu),包括碳水化合物、金屬結(jié)合部分和用于靶向某些生物分子或組織類(lèi)型的結(jié)構(gòu)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,功能部分包含一系列直鏈結(jié)構(gòu)單元,該直鏈系列利用適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)環(huán)化。例如,如果直鏈排列的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元包括巰基,則巰基可以氧化形成二硫鍵,從而環(huán)化該直鏈系列。例如,功能部分可以是包含兩個(gè)或多個(gè)L或D-半胱氨酸和/或L或D-高半胱氨酸部分的寡肽。結(jié)構(gòu)單元也可以包含能夠一起反應(yīng)環(huán)化直鏈系列的其他官能團(tuán),如羧基和氨基或羥基。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,直鏈系列中的一個(gè)結(jié)構(gòu)單元包含炔基,而直鍵系列中的另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元包含疊氮基??梢哉T導(dǎo)疊氮基和炔基通過(guò)環(huán)加成作用反應(yīng),導(dǎo)致形成大環(huán)結(jié)構(gòu)。在圖9所示的實(shí)施例中,功能部分是在C末端包含炔丙基甘氨酸結(jié)構(gòu)單元而在N末端包含疊氮基乙酰基的多肽。炔基與疊氮基在適當(dāng)條件下的反應(yīng)導(dǎo)致環(huán)狀化合物的形成,包括大環(huán)內(nèi)的三唑結(jié)構(gòu)。對(duì)于文庫(kù)的情況,在一個(gè)實(shí)施方案中,文庫(kù)的每個(gè)成員都包含含炔和疊氮基的結(jié)構(gòu)單元,并且可以以這種方式環(huán)化。在第二個(gè)實(shí)施方案中,文庫(kù)的所有成員都包含含炔和疊氮基的結(jié)構(gòu)單元,但是只有文庫(kù)的一部分環(huán)化。在第三個(gè)實(shí)施方案中,只有某些功能部分包含含炔和疊氮基的結(jié)構(gòu)單元,并且只有這些分子環(huán)化。在上述第二個(gè)和第三個(gè)實(shí)施方案中,該文庫(kù)在環(huán)加成反應(yīng)后既包含環(huán)狀功能部分也包含直鏈功能部分。
利用酶法連接寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中,起始結(jié)構(gòu)單元與起始寡核苷酸可操作連接。在第二結(jié)構(gòu)單元與起始結(jié)構(gòu)單元偶聯(lián)之前或之后,標(biāo)識(shí)第二結(jié)構(gòu)單元的第二寡核苷酸序列與起始寡核苷酸連接。用于連接起始寡核苷酸序列和引入寡核苷酸序列的方法在圖1和圖2中描述。在圖1中,起始寡核苷酸是雙鏈,一條鏈包含與第二寡核苷酸的一個(gè)末端互補(bǔ)的突出端序列,并且使第二寡核苷酸接觸起始寡核苷酸。優(yōu)選地,起始寡核苷酸的突出序列和第二寡核苷酸的互補(bǔ)序列都為至少約4個(gè)堿基;更優(yōu)選地兩個(gè)序列長(zhǎng)度相同??梢杂煤线m的酶將起始寡核苷酸和第二寡核苷酸連接起來(lái)。如果起始寡核苷酸在一條鏈(“頂鏈”)的5’末端與第一結(jié)構(gòu)單元連接,則與該頂鏈互補(bǔ)的鏈(“底鏈”)將在其5’末端包含突出端序列,第二寡核苷酸將在其5’末端包含互補(bǔ)序列。在第二寡核苷酸連接后,可以添加與第二寡核苷酸的序列互補(bǔ)的一條鏈,其位于突出端互補(bǔ)序列的3’方向,并且包含另外的突出端序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中,寡核苷酸如圖2所示延長(zhǎng)。定位與生長(zhǎng)的功能部分結(jié)合的寡核苷酸和引入寡核苷酸,用于利用“夾板”序列連接,該序列包括與起始寡核苷酸的3’末端互補(bǔ)的區(qū)域和與引入寡核苷酸的5’末端互補(bǔ)的區(qū)域。夾板使寡核苷酸的5’末端靠近引入寡核苷酸的3’末端,并且利用酶連接完成連接。在圖2所示的實(shí)施例中,起始寡核苷酸由16個(gè)核堿基組成,夾板與3’末端的6個(gè)堿基互補(bǔ)。引入寡核苷酸由12個(gè)核堿基組成,夾板與5’末端的6個(gè)堿基互補(bǔ)。夾板的長(zhǎng)度和互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度不是關(guān)鍵的。但是,互補(bǔ)區(qū)應(yīng)當(dāng)足夠長(zhǎng),以便在連接條件下能夠形成穩(wěn)定的二聚體,而不是在終分子中產(chǎn)生過(guò)大的編碼核苷酸?;パa(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度優(yōu)選為約4個(gè)堿基至約12個(gè)堿基,更優(yōu)選約5個(gè)堿基至約10個(gè)堿基,最優(yōu)選約5個(gè)堿基至約8個(gè)堿基。
在一個(gè)實(shí)施方案中,起始寡核苷酸是雙鏈,且兩條鏈共價(jià)連接。共價(jià)連接兩條鏈的一種手段如圖3所示,其中利用連接部分連接兩條鏈和功能部分。該連接部分可以是任何化學(xué)結(jié)構(gòu),其包含適合與結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)的第一官能團(tuán),適合與寡核苷酸的3’-末端反應(yīng)的第二官能團(tuán),和適合與寡核苷酸的5’-末端反應(yīng)的第三官能團(tuán)。優(yōu)選地,第二和第三官能團(tuán)的定向使兩條寡核苷酸鏈為相對(duì)的方向,這可使兩條鏈雜交。例如,連接部分可以具有通式結(jié)構(gòu)(I)
其中A是能夠與結(jié)構(gòu)單元形成共價(jià)鍵的官能團(tuán),B是能夠與寡核苷酸的5’-末端形成鍵的官能團(tuán),C是能夠與寡核苷酸的3’-末端形成鍵的官能團(tuán)。D、F和E是將官能團(tuán)A、C和B與S連接的化學(xué)基團(tuán),S為核心原子或支架。優(yōu)選地,D、E和F各自獨(dú)立地為原子鏈,如亞烷基鏈或低聚(乙二醇)鏈,D、E和F可以相同或不同,并且優(yōu)選地有效地使兩個(gè)寡核苷酸雜交及功能部分合成。在一個(gè)實(shí)施方案中,三價(jià)連接體具有結(jié)構(gòu) 在該實(shí)施方案中,NH基可用于連接結(jié)構(gòu)單元,而末端磷酸基可用于連接寡核苷酸。
在起始寡核苷酸是雙鏈的實(shí)施方案中,引入寡核苷酸也是雙鏈。如圖3所示,起始寡核苷酸的一條鏈可以比另一條長(zhǎng),提供突出端序列。在該實(shí)施方案中,引入寡核苷酸包括與起始寡核苷酸的突出端序列互補(bǔ)的突出端序列。兩個(gè)互補(bǔ)突出端序列的雜交使引入寡核苷酸進(jìn)入與起始寡核苷酸連接的位置。這種連接可以用DNA或RNA連接酶酶促進(jìn)行。引入寡核苷酸和起始寡核苷酸的突出端序列優(yōu)選地長(zhǎng)度相同,并且由兩個(gè)或多個(gè)核苷酸,優(yōu)選地2個(gè)至約10個(gè)核苷酸,更優(yōu)選2個(gè)至約6個(gè)核苷酸組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,引入寡核苷酸是在每一末端都有一個(gè)突出端序列的雙鏈寡核苷酸。在一個(gè)末端處的突出端序列與起始寡核苷酸的突出端序列互補(bǔ),而在引入寡核苷酸與起始寡核苷酸連接后,在另一末端處的突出端序列成為下一循環(huán)的起始寡核苷酸的突出端序列。在一個(gè)實(shí)施方案中,三個(gè)突出端序列長(zhǎng)度均為2至6個(gè)核苷酸,引入寡核苷酸的編碼序列長(zhǎng)度為3至10個(gè)核苷酸,優(yōu)選3至6個(gè)核苷酸。在一個(gè)特定實(shí)施方案中,突出端序列的長(zhǎng)度均為2個(gè)核苷酸,編碼序列的長(zhǎng)度為5個(gè)核苷酸。
在圖4所示的實(shí)施方案中,引入鏈在其3’末端具有與起始寡核苷酸的3’末端互補(bǔ)的區(qū)域,在兩條鏈的5’末端留有突出端。5’末端可以利用如DNA聚合酶如vent聚合酶補(bǔ)平,產(chǎn)生雙鏈的延長(zhǎng)寡核苷酸。該寡核苷酸的底鏈可以除去,并利用相同的方法向頂鏈的3’末端添加另外的序列。
連續(xù)添加識(shí)別每個(gè)連續(xù)結(jié)構(gòu)單元的寡核苷酸導(dǎo)致形成編碼寡核苷酸標(biāo)簽。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中,連續(xù)寡核苷酸標(biāo)簽可以通過(guò)酶連接偶聯(lián),產(chǎn)生編碼寡核苷酸。
酶催化的寡核苷酸連接可以用具有連接核酸片段能力的任何酶進(jìn)行。酶的例子包括連接酶、聚合酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中,應(yīng)用DNA連接酶(EC 6.5.1.1)、DNA聚合酶(EC 2.7.7.7)、RNA聚合酶(EC 2.7.7.6)或拓?fù)洚悩?gòu)酶(EC 5.99.1.2)連接寡核苷酸。每個(gè)EC類(lèi)別中所含的酶可見(jiàn)于如Bairoch(2000)Nucleic Acids Research 28304-5所述。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,在本發(fā)明方法中使用的寡核苷酸是寡脫氧核苷酸,用來(lái)催化寡核苷酸連接的酶是DNA連接酶。為了在連接酶存在下發(fā)生連接,即為了在兩個(gè)寡核苷酸之間形成磷酸二酯鍵,一個(gè)寡核苷酸必須具有游離的5’磷酸基,而另一個(gè)寡核苷酸必須具有游離的3’羥基。可以在本發(fā)明的方法中使用的DNA連接酶的例子包括T4DNA連接酶、Taq DNA連接酶、T4RNA連接酶、DNA連接酶(大腸桿菌)(均獲自如New England Biolabs,MA)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,用于連接的各種酶在特定條件如溫度、緩沖液濃度、pH和時(shí)間下具有最佳活性。這些條件中的每一個(gè)都可以調(diào)節(jié),例如根據(jù)制造商說(shuō)明進(jìn)行調(diào)節(jié),以獲得寡核苷酸標(biāo)簽的最佳連接。
引入寡核苷酸可以是任何需要的長(zhǎng)度,但優(yōu)選長(zhǎng)度為至少三個(gè)核堿基。更優(yōu)選地,引入寡核苷酸的長(zhǎng)度為4個(gè)或更多的核堿基。在一個(gè)實(shí)施方案中,引入寡核苷酸的長(zhǎng)度為3至約12個(gè)核堿基。本發(fā)明文庫(kù)中的分子的寡核苷酸優(yōu)選具有共同的末端序列,如本領(lǐng)域所知,該序列可以用作PCR的引物。這種共同末端序列可以在文庫(kù)合成的最后一個(gè)循環(huán)中引入作為引入寡核苷酸的末端,或者可以在文庫(kù)合成后添加,例如利用此處公開(kāi)的酶連接方法添加。
本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案如圖5所示。該過(guò)程開(kāi)始于在5’末端與連接體連接的合成DNA序列,該連接體終止于氨基。在步驟1中,在Tris緩沖液中在夾板DNA鏈、DNA連接酶和二硫蘇糖醇的存在下,該起始DNA序列與引入DNA序列連接。產(chǎn)生標(biāo)記DNA序列,該序列然后可以直接用于下一步驟中,或者在進(jìn)行下一步驟之前例如利用HPLC或乙醇沉淀純化。在步驟2中,標(biāo)記DNA與保護(hù)的活化氨基酸反應(yīng),在該實(shí)施例中,與Fmoc-保護(hù)的氨基酸氟化物反應(yīng),產(chǎn)生保護(hù)的氨基酸-DNA偶聯(lián)物。在步驟3中,例如在哌啶的存在下將保護(hù)的氨基酸-DNA偶聯(lián)物脫保護(hù),任選地例如通過(guò)HPLC或乙醇沉淀純化產(chǎn)生的脫保護(hù)的偶聯(lián)物。脫保護(hù)的偶聯(lián)物是第一合成循環(huán)的產(chǎn)物,并且成為第二循環(huán)的起始材料,第二循環(huán)向脫保護(hù)偶聯(lián)物的游離氨基上添加第二氨基酸殘基。
在利用PCR擴(kuò)增所選分子的編碼寡核苷酸的實(shí)施方案中,該編碼寡核苷酸優(yōu)選地包括PCR引物序列。例如,在合成的第一循環(huán)之前,起始寡核苷酸中可以包含PCR引物序列,或者可以與第一引入寡核苷酸一起包含。編碼寡核苷酸在編碼序列之后也可以包含加帽P(pán)CR引物序列。在文庫(kù)合成的最后一個(gè)循環(huán)后,該加帽序列可以與編碼寡核苷酸連接,或者可以包含在最后一個(gè)循環(huán)的引入寡核苷酸中。在引入寡核苷酸包含PCR引物序列的情況中,這些引入寡核苷酸優(yōu)選地明顯長(zhǎng)于在其他循環(huán)中添加的引入寡核苷酸,因?yàn)樗鼈兗劝幋a序列也包含PCR引物序列。
對(duì)于在添加最后的結(jié)構(gòu)單元和最后的引入寡核苷酸后添加加帽序列的情況,如此處所述的文庫(kù)的合成包括將加帽序列與編碼寡核苷酸連接的步驟,使基本所有文庫(kù)成員的寡核苷酸部分終止于包含PCR引物序列的序列中。適合在本發(fā)明的文庫(kù)中使用的PCR引物序列在本領(lǐng)域中公知;合適的引物和方法例如描述在Innis等人,編,PCR ProtocolsAGuide to Methods and Applications,San DiegoAcademic Press(1990)中,其內(nèi)容在此全文引用作為參考。優(yōu)選地,通過(guò)與作為最后合成循環(huán)的產(chǎn)物的組合組分連接,添加該加帽序列。加帽序列可以用文庫(kù)構(gòu)建中使用的酶法添加。
如上所述,作為本發(fā)明方法一部分的寡核苷酸標(biāo)簽的核苷酸序列可以用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定。
寡核苷酸標(biāo)簽由標(biāo)識(shí)構(gòu)成如此處所述功能部分的結(jié)構(gòu)單元的多核苷酸組成。寡核苷酸標(biāo)簽的核酸序列通過(guò)對(duì)寡核苷酸標(biāo)簽進(jìn)行如下PCR反應(yīng)來(lái)測(cè)定。適當(dāng)樣品與PCR引物對(duì)接觸,該引物對(duì)的每個(gè)成員具有預(yù)先選擇的核苷酸序列。該P(yáng)CR引物對(duì)通過(guò)與編碼寡核苷酸標(biāo)簽上的PCR引物結(jié)合部位雜交,能夠啟動(dòng)引物延伸反應(yīng)。該P(yáng)CR引物結(jié)合部位優(yōu)選地設(shè)計(jì)在編碼寡核苷酸標(biāo)簽內(nèi)部。例如,PCR引物結(jié)合部位可以摻入起始寡核苷酸標(biāo)簽內(nèi),而第二PCR引物結(jié)合部位可以位于最終寡核苷酸標(biāo)簽內(nèi)?;蛘撸诙CR引物結(jié)合部位可以摻入如此處所述的加帽序列中。在優(yōu)選實(shí)施方案中,該P(yáng)CR引物結(jié)合部位的長(zhǎng)度至少為約5、7、10、13、15、17、20、22或25個(gè)核苷酸。
通過(guò)將PCR引物對(duì),優(yōu)選預(yù)定量的該引物對(duì),與編碼寡核苷酸標(biāo)簽的核酸,優(yōu)選預(yù)定量的該核酸,在PCR緩沖液中混合,形成PCR反應(yīng)混合物,進(jìn)行PCR反應(yīng)。將該混合物熱循環(huán)一定的循環(huán)數(shù),該循環(huán)數(shù)一般預(yù)先確定,足以形成PCR反應(yīng)產(chǎn)物。足夠量的產(chǎn)物是能夠以足以進(jìn)行DNA序列測(cè)定的量分離的產(chǎn)物。
PCR一般通過(guò)熱循環(huán)進(jìn)行,即在一個(gè)溫度范圍內(nèi)重復(fù)地提高和降低PCR反應(yīng)混合物的溫度,該范圍的下限為約30℃至約55℃,上限為約90℃至約100℃。提高和降低可以是連續(xù)的,但優(yōu)選是階段的,在有利于多核苷酸合成、變性和雜交的各個(gè)溫度下具有相對(duì)溫度穩(wěn)定的時(shí)間段。
PCR反應(yīng)用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行。通常在緩沖的水溶液即PCR緩沖液中發(fā)生,優(yōu)選為pH 7-9。優(yōu)選含有摩爾過(guò)量的引物。為了提高該方法的效率,優(yōu)選較大的摩爾過(guò)量。
PCR緩沖液還含有脫氧核糖核苷酸三磷酸(多核苷酸合成底物)dATP、dCTP、dGTP和dTTP,和聚合酶,一般是熱穩(wěn)定的聚合酶,都是足以進(jìn)行引物延伸(多核苷酸合成)反應(yīng)的量。得到的溶液(PCR混合物)加熱至約90℃-100℃約1-10分鐘,優(yōu)選1-4分鐘。該加熱階段之后將溶液冷卻至54℃,該溫度是引物雜交優(yōu)選的。合成反應(yīng)可以在一定溫度下發(fā)生,該溫度的范圍從室溫到高于該溫度聚合酶(誘導(dǎo)劑)即不再有效作用的溫度。因此,例如,如果使用DNA聚合酶,則溫度通常不高于約40℃。重復(fù)該熱循環(huán),直到產(chǎn)生所需量的PCR產(chǎn)物。一種典型的PCR緩沖液每100微升緩沖液含有下列試劑50mM KCl;10mMTris-HCl pH 8.3;1.5mM MgCl2;0.001%(wt/vol)明膠,200μM dATP;200μM dTTP;200μM dCTP;200μM dGTP;和2.5單位棲熱水生菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶I。
用于延伸引物序列的合適的酶包括例如大腸桿菌DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、其他可以使用的DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶,和其他酶,包括熱穩(wěn)定的酶,其有利于以適當(dāng)?shù)姆绞浇M合核苷酸,形成與每條核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。合成通常開(kāi)始于每個(gè)引物的3′末端,并沿著模板鏈以5′方向前進(jìn),直到合成終止,產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的分子。
新合成的DNA鏈與其互補(bǔ)鏈形成雙鏈分子,該雙鏈分子可以在分析方法的后續(xù)步驟中使用。
PCR擴(kuò)增方法在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,192、4,683,202、4,800,159和4,965,188中詳細(xì)描述,并且至少在PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNA Amplification,H.Erlich,ed.,Stockton Press,NewYork(1989);和PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications,Innis等人,編,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中詳細(xì)描述。上述所有文獻(xiàn)的內(nèi)容在此引用作為參考。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”用于引物、探針和將要通過(guò)引物延伸合成的核酸片段或區(qū)段時(shí),定義為由兩個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選三個(gè)以上脫氧核糖核苷酸組成的分子。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“引物”是指從核酸限制性消化物中純化的或合成產(chǎn)生的多核苷酸,當(dāng)置于誘導(dǎo)合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的條件下時(shí),即在核苷酸和聚合試劑如DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等的存在下,以及在合適的溫度和pH下,它能夠作為核酸合成的起點(diǎn)。為了效率最高,引物優(yōu)選是單鏈,但是也可以是雙鏈形式。如果是雙鏈,則在用來(lái)制備延伸產(chǎn)物之前首先處理該引物,使它與互補(bǔ)鏈分開(kāi)。優(yōu)選地,引物是一種聚脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長(zhǎng),以在聚合試劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度取決于許多因素,包括溫度和引物來(lái)源。
此處所用的引物選擇為與所要擴(kuò)增的每個(gè)特定序列的不同鏈“基本”互補(bǔ)。意思是引物必須充分互補(bǔ),以便與相應(yīng)的模板鏈非隨機(jī)地雜交。因此,引物序列可能反映或者可能不反映模板的準(zhǔn)確序列。
多核苷酸引物可以用任何合適的方法制備,例如Narang等人,(1979)Meth.Enzymol.,6890;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,356,270,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,458,066,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,416,988,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,293,652;和Brown等人,(1979)Meth.Enzymol.,68109所述的磷酸三酯或磷酸二酯法。上述所有文獻(xiàn)的內(nèi)容在此引用作為參考。
一旦擴(kuò)增出編碼寡核苷酸標(biāo)簽,即可應(yīng)用核酸序列分析確定該標(biāo)簽的序列,并最終確定選擇的分子的組成,核酸序列分析是用于測(cè)定核苷酸序列的眾所周知的方法。核酸序列分析通過(guò)以下方法的組合進(jìn)行(a)基于探針鏈與其互補(bǔ)靶標(biāo)雜交或變性的生理化學(xué)技術(shù),和(b)與聚合酶的酶反應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及可以用本發(fā)明的方法制備的化合物,和這樣的化合物的集合,其作為分離的物質(zhì)或組合形成化學(xué)結(jié)構(gòu)文庫(kù)。本發(fā)明的化合物包括下式的化合物
其中X是包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分,Z是在其3’末端與B連接的寡核苷酸,Y是在其5’末端與C連接的寡核苷酸。A是與X形成共價(jià)鍵的官能團(tuán),B是與Z的3’-末端形成鍵的官能團(tuán),C是與Y的5’-末端形成鍵的官能團(tuán)。D、F和E是將官能團(tuán)A、C和B與S連接的化學(xué)基團(tuán),S是核心原子或支架。優(yōu)選地,D、E和F各自獨(dú)立地是原子鏈,如亞烷基鏈或低聚(乙二醇)鏈,D、E和F可以相同或不同,優(yōu)選地有效地使兩個(gè)寡核苷酸雜交以及功能部分合成。
優(yōu)選地,Y和Z基本互補(bǔ),并且在化合物中定向,從而能夠在合適條件下發(fā)生Watson-Crick堿基配對(duì)和雙鏈體形成。Y和Z的長(zhǎng)度相同或不同。優(yōu)選地,Y和Z的長(zhǎng)度相同,或者Y和Z之一比另一個(gè)長(zhǎng)1至10個(gè)堿基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,Y和Z各自為10個(gè)或更多堿基的長(zhǎng)度,并且具有10個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)的互補(bǔ)區(qū)。更優(yōu)選地,Y和Z在其全長(zhǎng)上基本互補(bǔ),即它們每十個(gè)堿基對(duì)具有不超過(guò)1個(gè)錯(cuò)配。最優(yōu)選地,Y和Z在其全長(zhǎng)上互補(bǔ),即,除了Y或Z上的任何突出端區(qū)域之外,這些鏈通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)雜交,在它們的全長(zhǎng)上沒(méi)有錯(cuò)配。
S可以是單一原子或分子支架。例如,S可以是碳原子、硼原子、氮原子或磷原子,或多原子支架,如磷酸基或環(huán)基,如環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、芳基或雜芳基。在一個(gè)實(shí)施方案中,連接體是如下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)
其中n、m和p各自獨(dú)立地是1至約20的整數(shù),優(yōu)選2至8,更優(yōu)選3至6。在一個(gè)特定實(shí)施方案中,連接體具有以下所示的結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的文庫(kù)包括由功能部分組成的分子,該功能部分由結(jié)構(gòu)單元組成,其中每個(gè)功能部分都與編碼寡核苷酸可操作連接。編碼寡核苷酸的核苷酸序列指示功能部分中存在的結(jié)構(gòu)單元,在一些實(shí)施方案中,指示結(jié)構(gòu)單元的連接性或排列。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn),用來(lái)構(gòu)建功能部分及用來(lái)構(gòu)建寡核苷酸標(biāo)簽的方法可以在相同的反應(yīng)介質(zhì)中,優(yōu)選地在水性介質(zhì)中進(jìn)行,從而與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比簡(jiǎn)化了制備文庫(kù)的方法。在寡核苷酸連接步驟和結(jié)構(gòu)單元添加步驟都可以在水性介質(zhì)中進(jìn)行的某些實(shí)施方案中,每個(gè)反應(yīng)都具有不同的最適pH。在這些實(shí)施方案中,結(jié)構(gòu)單元添加反應(yīng)可以在合適的含水緩沖液中在合適的pH和溫度下進(jìn)行。然后緩沖液可以用提供適于寡核苷酸連接之pH的含水緩沖液替換。
本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們能夠用來(lái)制備含有大量化合物的文庫(kù)。利用公知方法如聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)擴(kuò)增編碼寡核苷酸序列的能力意味著,即使回收的拷貝較少,也能夠鑒定選擇的分子。這允許實(shí)際應(yīng)用極大的文庫(kù),其由于高度復(fù)雜性,要么包含相對(duì)較少拷貝的任何特定文庫(kù)成員,要么需要使用極大的體積。例如,由108個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)組成,其中每個(gè)結(jié)構(gòu)具有1×1012個(gè)拷貝(約1皮摩爾)的文庫(kù),需要約100L的1μM有效濃度的溶液。對(duì)于相同的文庫(kù),如果每個(gè)成員有1,000,000個(gè)拷貝,則在1μM有效濃度下需要的體積為100μL。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,文庫(kù)包含約103至約1015個(gè)拷貝的每個(gè)文庫(kù)成員。假定文庫(kù)成員之間的合成效率有差異,則不同文庫(kù)成員在任何特定文庫(kù)中可能具有不同的拷貝數(shù)。因此,盡管文庫(kù)中理論存在的每個(gè)成員的拷貝數(shù)可能相同,但是任何特定文庫(kù)成員的實(shí)際拷貝數(shù)與任何其他成員的拷貝數(shù)無(wú)關(guān)。更優(yōu)選地,本發(fā)明的化合物文庫(kù)包括至少約105、106或107個(gè)拷貝的每個(gè)文庫(kù)成員,或基本上所有文庫(kù)成員。“基本上所有”文庫(kù)成員含意是至少約85%的文庫(kù)成員,優(yōu)選至少約90%,更優(yōu)選至少約95%的文庫(kù)成員。
優(yōu)選地,文庫(kù)包含足夠拷貝數(shù)的每個(gè)成員,可對(duì)生物靶標(biāo)進(jìn)行多輪(即兩輪或兩輪以上)選擇,在最后一輪選擇后剩余足夠數(shù)量的結(jié)合分子,使剩余的分子的寡核苷酸標(biāo)簽?zāi)軌驍U(kuò)增,因此能夠識(shí)別結(jié)合分子的功能部分。這種選擇方法的示意圖在圖6中顯示,其中1和2代表文庫(kù)成員,B是靶分子,X是與B可操作連接的部分,使得能夠從選擇介質(zhì)中除去B。在該實(shí)例中,化合物1與B結(jié)合,而化合物2不與B結(jié)合。如第1輪所示,該選擇過(guò)程包括(I)在適合化合物1與B結(jié)合的條件下使包含化合物1和2的文庫(kù)接觸B-X;(II)除去未結(jié)合的化合物2,(III)從B上解離化合物1,并從反應(yīng)介質(zhì)中除去BX。第1輪的結(jié)果是相對(duì)于化合物2富含化合物1的分子集合。后續(xù)使用步驟I-III的幾輪導(dǎo)致化合物1相對(duì)于化合物2的進(jìn)一步富集。盡管圖6顯示了3輪選擇,但是實(shí)際上可以使用任何輪數(shù),例如1至10輪,以實(shí)現(xiàn)所需的結(jié)合分子相對(duì)于非結(jié)合分子的富集。
在圖6所示的實(shí)施方案中,在任何選擇輪數(shù)之后剩余的化合物沒(méi)有擴(kuò)增(更多拷貝的合成)。這樣的擴(kuò)增可以產(chǎn)生與選擇后剩余的化合物的相對(duì)量不一致的化合物的混合物。這種不一致是由于這一事實(shí),即某些化合物可能比其他化合物更容易合成,因此可能在選擇后以與其存在不成比例的方式擴(kuò)增。例如,如果化合物2比化合物1更容易合成,則第2輪后剩余的分子的擴(kuò)增將導(dǎo)致化合物2相對(duì)于化合物1的不成比例擴(kuò)增,獲得的化合物的混合物具有更低的(如果有的話(huà))化合物1相對(duì)于化合物2的富集。
在一個(gè)實(shí)施方案中,利用任何公知的固定技術(shù)將靶標(biāo)固定在固體支持體上。固體支持體可以是,例如層析柱或膜中所含的水不溶性基質(zhì)。編碼文庫(kù)可以加到層析柱中所含的水不溶性基質(zhì)上。然后洗柱,除去非特異性結(jié)合物。然后通過(guò)改變pH、鹽濃度、有機(jī)溶劑濃度或其他方法,如與已知配體競(jìng)爭(zhēng)靶標(biāo),使與靶標(biāo)結(jié)合的化合物解離。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中,靶標(biāo)在溶液中游離,與編碼文庫(kù)溫育。通過(guò)大小分離步驟,如凝膠過(guò)濾或超濾,選擇性分離與靶標(biāo)(在此也稱(chēng)作“配體”)結(jié)合的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中,編碼化合物與靶生物分子的混合物通過(guò)大小排阻層析柱(凝膠過(guò)濾),從未結(jié)合的化合物中分離任何配體-靶標(biāo)復(fù)合物。將該配體-靶標(biāo)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到反相層析柱上,將配體與靶標(biāo)解離。解離的配體然后通過(guò)PCR擴(kuò)增和編碼寡核苷酸的序列分析進(jìn)行分析。在靶標(biāo)的固定可導(dǎo)致活性喪失的情況下,該方法特別有利。
一旦通過(guò)上述方法鑒定了單一配體,即可以應(yīng)用各種水平的分析獲得結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的信息,并指導(dǎo)配體親和力、特異性和生物活性的進(jìn)一步優(yōu)化。對(duì)于來(lái)源于同一支架的配體,可以利用三維分子模建鑒定這些配體共同的顯著結(jié)構(gòu)特征,從而產(chǎn)生可能在靶生物分子上共同部位結(jié)合的小分子配體家族。
可以應(yīng)用多種篩選方法獲得對(duì)一個(gè)靶標(biāo)具有高親和力而對(duì)于另一個(gè)密切相關(guān)的靶標(biāo)具有顯著較弱親和力的配體。一種篩選策略是在平行實(shí)驗(yàn)中鑒定兩個(gè)生物分子的配體,接著通過(guò)交叉參考對(duì)比排除共同的配體。在該方法中,每個(gè)生物分子的配體都可以如以上所述單獨(dú)鑒定。該方法與固定的靶生物分子和在溶液中游離的靶生物分子都匹配。
對(duì)于固定的靶生物分子,另外一種策略是增加一個(gè)預(yù)選步驟,以從文庫(kù)中排除與非靶生物分子結(jié)合的所有配體。例如,第一生物分子可以如上所述與文庫(kù)接觸。然后從形成的任何第一生物分子-配體復(fù)合物中分離不與第一生物分子結(jié)合的化合物。然后第二生物分子接觸不與第一生物分子結(jié)合的化合物。與第二生物分子結(jié)合的化合物可以如上所述鑒定,它們對(duì)于第二生物分子比對(duì)于第一生物分子具有顯著較高的親和力。
也可以使用通過(guò)上述方法鑒定的具有未知功能的生物分子的配體,來(lái)確定該生物分子的生物功能。這是有利的,因?yàn)楸M管新的基因序列不斷鑒定,但是這些序列編碼的蛋白質(zhì)的功能和這些蛋白質(zhì)作為新藥發(fā)現(xiàn)及開(kāi)發(fā)靶標(biāo)的有效性難以確定,并且可能是應(yīng)用基因組信息治療疾病的最大障礙。通過(guò)本發(fā)明所述方法獲得的靶標(biāo)特異性配體可以在全細(xì)胞生物測(cè)定或適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中應(yīng)用,用于理解靶蛋白質(zhì)的功能和靶蛋白質(zhì)用于治療性干預(yù)的有效性。該方法也可證實(shí)靶標(biāo)特別適合小分子藥物發(fā)現(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的文庫(kù)中的一種或多種化合物鑒定為特定生物分子的配體。然后可以在體外試驗(yàn)中評(píng)價(jià)這些化合物與生物分子結(jié)合的能力。優(yōu)選地,合成結(jié)合化合物的功能部分,其不含寡核苷酸標(biāo)簽或連接體部分,并且評(píng)價(jià)這些功能部分與生物分子結(jié)合的能力。
也可以用體外無(wú)細(xì)胞或基于細(xì)胞的試驗(yàn)評(píng)價(jià)功能部分與生物分子結(jié)合對(duì)生物分子功能的影響。對(duì)于具有已知功能的生物分子,試驗(yàn)可以包括比較在存在及不存在配體的情況下生物分子的活性,例如,通過(guò)直接測(cè)定活性,如酶活性,或者通過(guò)間接測(cè)定,例如該生物分子影響的細(xì)胞功能。如果該生物分子具有未知的功能,則表達(dá)該生物分子的細(xì)胞可以接觸配體,并且評(píng)價(jià)該配體對(duì)該細(xì)胞的生存力、功能、表型和/或基因表達(dá)的影響。這樣的體外試驗(yàn)可以是,例如,細(xì)胞死亡測(cè)定、細(xì)胞增殖測(cè)定或病毒復(fù)制試驗(yàn)。例如,如果該生物分子是病毒表達(dá)的蛋白質(zhì),則感染病毒的細(xì)胞可以與該蛋白質(zhì)的配體接觸。然后可以評(píng)價(jià)該配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合對(duì)病毒生存力的影響。
利用本發(fā)明的方法鑒定的配體也可以在體內(nèi)模型中或在人體內(nèi)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如,配體可以在產(chǎn)生該生物分子的動(dòng)物或生物體中進(jìn)行評(píng)價(jià)??梢詼y(cè)定動(dòng)物或生物體在健康狀態(tài)(例如疾病進(jìn)展)上產(chǎn)生的任何變化。
對(duì)于一種未知功能的生物分子,如蛋白質(zhì)或核酸分子,與生物分子結(jié)合的配體對(duì)產(chǎn)生該生物分子的細(xì)胞或生物體的影響可以提供關(guān)于該生物分子生物功能的信息。例如,觀察到特定細(xì)胞過(guò)程在配體存在下受到抑制,指示該過(guò)程至少部分依賴(lài)于該生物分子的功能。
利用本發(fā)明的方法鑒定的配體也可以用作與與它們結(jié)合的生物分子的親和試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中,利用這樣的配體實(shí)現(xiàn)生物分子的親和純化,例如,通過(guò)利用連接有一種或多種這樣的配體的固相對(duì)含有該生物分子的溶液進(jìn)行層析。
通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明,這些實(shí)施例不應(yīng)視為限制。在本申請(qǐng)全文中引用的所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利和公布的專(zhuān)利申請(qǐng)以及附圖和序列表的內(nèi)容,都在此引用作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1具有大約105個(gè)成員的文庫(kù)的合成和表征含有大約105個(gè)不同成員的文庫(kù)的合成使用下列試劑完成化合物1 脫氧核糖核苷酸的單字母密碼A=腺苷C=胞苷G=鳥(niǎo)苷T=胸苷結(jié)構(gòu)單元前體
寡核苷酸標(biāo)簽
序列 標(biāo)簽編號(hào)5’-PO4-GCAACGAAG(SEQ ID NO1)1.1ACCGTTGCT-PO3-5’(SEQ ID NO2)5’-PO3-GCGTACAAG(SEQ ID NO3)1.2ACCGCATGT-PO3-5’(SEQ ID NO4)5’-PO3-GCTCTGTAG(SEQ ID NO5)1.3ACCGAGACA-PO3-5’(SEQ ID NO6)5’-PO3-GTGCCATAG(SEQ ID NO7)1.4ACCACGGTA-PO3-5’(SEQ ID NO8)5’-PO3-GTTGACCAG(SEQ ID NO9)1.5ACCAACTGG-PO3-5’(SEQ ID NO10)5’-PO3-CGACTTGAC(SEQ ID NO11) 1.6CAAGTCGCA-PO3-5’(SEQ ID NO12)5’-PO3-CGTAGTCAG(SEQ ID NO13) 1.7ACGCATCAG-PO3-5’(SEQ ID NO14)5’-PO3-CCAGCATAG(SEQ ID NO15) 1.8ACGGTCGTA-PO3-5’(SEQ ID NO16)5’-PO3-CCTACAGAG(SEQ ID NO17) 1.9ACGGATGTC-PO3-5’(SEQ ID NO18)5’-PO3-CTGAACGAG(SEQ ID NO19) 1.10CGTTCAGCA-PO3-5’(SEQ ID NO20)5’-PO3-CTCCAGTAG(SEQ ID NO21) 1.11ACGAGGTCA-PO3-5’(SEQ ID NO22)5’-PO3-TAGGTCCAG(SEQ ID NO23) 1.12ACATCCAGG-PO3-5’(SEQ ID NO24)5’-PO3-GCGTGTTGT(SEQ ID NO25) 2.1
TCCGCACAA-PO3-5’(SEQ ID NO26)5’-PO3-GCTTGGAGT(SEQ ID NO27)2.2TCCGAACCT-PO3-5’(SEQ ID NO28)5’-PO3-GTCAAGCGT(SEQ ID NO29)2.3TCCAGTTCG-PO3-5’(SEQ ID NO30)5’-PO3-CAAGAGCGT(SEQ ID NO31)2.4TCGTTCTCG-PO3-5’(SEQ ID NO32)5’-PO3-CAGTTCGGT(SEQ ID NO33)2.5TCGTCAAGC-PO3-5’(SEQ ID NO34)5’-PO3-CGAAGGAGT(SEQ ID NO35)2.6TCGCTTCCT-PO3-5’(SEQ ID NO36)5’-PO3-CGGTGTTGT(SEQ ID NO37)2.7TCGCCACAA-PO3-5’(SEQ ID NO38)5’-PO3-CGTTGCTGT(SEQ ID NO39)2.8TCGCAACGA-PO3-5’(SEQ ID NO40)5’-PO3-CCGATCTGT(SEQ ID NO41)2.9TCGGCTAGA-PO3-5’(SEQ ID NO42)5’-PO3-CCTTCTCGT(SEQ ID NO43)2.10TCGGAAGAG-PO3-5’(SEQ ID NO44)5’-PO3-TGAGTCCGT(SEQ ID NO45)2.11TCACTCAGG-PO3-5’(SEQ ID NO46)5’-PO3-TGCTACGGT(SEQ ID NO47)2.12TCAGATTGC-PO3-5’(SEQ ID NO48)5’-PO3-GTGCGTTGA(SEQ ID NO49)3.1CACACGCAA-PO3-5’(SEQ ID NO50)5’-PO3-GTTGGCAGA(SEQ ID NO51)3.2
CACAACCGT-PO3-5’(SEQ ID NO52)5’-PO3-CCTGTAGGA(SEQ ID NO53)3.3CAGGACATC-PO3-5’(SEQ ID NO54)5’-PO3-CTGCGTAGA(SEQ ID NO55)3.4CAGACGCAT-PO3-5’(SEQ ID NO56)5’-PO3-CTTACGCGA(SEQ ID NO57)3.5CAGAATGCG-PO3-5’(SEQ ID NO58)5’-PO3-TGGTCACGA(SEQ ID NO59)3.6CAACCAGTG-PO3-5’(SEQ ID NO60)5’-PO3-TCAGAGCGA(SEQ ID NO61)3.7CAAGTCTCG-PO3-5’(SEQ ID NO62)5’-PO3-TTGCTCGGA(SEQ ID NO63)3.8CAAACGAGC-PO3-5’(SEQ ID NO64)5’-PO3-GCAGTTGGA(SEQ ID NO65)3.9CACGTCAAC-PO3-5’(SEQ ID NO66)5’-PO3-GCCTGAAGA(SEQ ID NO67)3.10CACGGACTT-PO3-5’(SEQ ID NO68)5’-PO3-GTAGCCAGA(SEQ ID NO69)3.11CACATCGGT-PO3-5’(SEQ ID NO70)5’-PO3-GTCGCTTGA(SEQ ID NO71)3.12CACAGCGAA-PO3-5’(SEQ ID NO72)5’-PO3-GCCTAAGTT(SEQ ID NO73)4.1CTCGGATTC-PO3-5’(SEQ ID NO74)5’-PO3-GTAGTGCTT(SEQ ID NO75)4.2CTCATCACG-PO3-5’(SEQ ID NO76)5’-PO3-GTCGAAGTT(SEQ ID NO77)4.3CTCAGCTTC-PO3-5’(SEQ ID NO78)
5’-PO3-GTTTCGGTT(SEQ ID NO79) 4.4CTCAAAGCC-PO3-5’(SEQ ID NO80)5’-PO3-CAGCGTTTT(SEQ ID NO81) 4.5CTGTCGCAA-PO3-5’(SEQ ID NO82)5’-PO3-CATACGCTT(SEQ ID NO83) 4.6CTGTATGCG-PO3-5’(SEQ ID NO84)5’-PO3-CGATCTGTT(SEQ ID NO85) 4.7CTGCTAGAC-PO3-5’(SEQ ID NO86)5’-PO3-CGCTTTGTT(SEQ ID NO87) 4.8CTGCGAAAC-PO3-5’(SEQ ID NO88)5’-PO3-CCACAGTTT(SEQ ID NO89) 4.9CTGGTGTCA-PO3-5’(SEQ ID NO90)5’-PO3-CCTGAAGTT(SEQ ID NO91) 4.10CTGGACTTC-PO3-5’(SEQ ID NO92)5’-PO3-CTGACGATT(SEQ ID NO93) 4.11CTGACTGCT-PO3-5’(SEQ ID NO94)5’-PO3-CTCCACTTT(SEQ ID NO95) 4.12CTGAGGTGA-PO3-5’(SEQ ID NO96)5’-PO3-ACCAGAGCC(SEQ ID NO97) 5.1AATGGTCTC-PO3-5’(SEQ ID NO98)5’-PO3-ATCCGCACC(SEQ ID NO99) 5.2AATAGGCGT-PO3-5’(SEQ ID NO100)5’-PO3-GACGACACC(SEQ ID NO101)5.3AACTGCTGT-PO3-5’(SEQ ID NO102)5’-PO3-GGATGGACC(SEQ ID NO103)5.4AACCTACCT-PO3-5’(SEQ ID NO104)
5’-PO3-GCAGAAGCC(SEQ ID NO105)5.5AACGTCTTC-PO3-5’(SEQ ID NO106)5’-PO3-GCCATGTCC(SEQ ID NO107)5.6AACGGTACA-PO3-5’(SEQ ID NO108)5’-PO3-GTCTGCTCC(SEQ ID NO109)5.7AACAGACGA-PO3-5’(SEQ ID NO110)5’-PO3-CGACAGACC(SEQ ID NO111)5.8AAGCTGTCT-PO3-5’(SEQ ID NO112)5’-PO3-CGCTACTCC(SEQ ID NO113)5.9AAGCGATGA-PO3-5’(SEQ ID NO114)5’-PO3-CCACAGACC(SEQ ID NO115)5.10AAGGTGTCT-PO3-5’(SEQ ID NO116)5’-PO3-CCTCTCTCC(SEQ ID NO117)5.11AAGGAGAGA-PO3-5’(SEQ ID NO118)5’-PO3-CTCGTAGCC(SEQ ID NO119)5.12AAGAGCATC-PO3-5’(SEQ ID NO120)1X連接酶緩沖液50mM Tris,pH 7.5;10mM二硫蘇糖醇;10mMMgCl2;2.5mM ATP;50mM NaCl。
10X連接酶緩沖液500mM Tris,pH 7.5;100mM二硫蘇糖醇;100mM MgCl2;25mM ATP;500mM NaCl。
循環(huán)1向12個(gè)PCR管的每一個(gè)中加入50μL 1mM化合物1的水溶液;75μL 0.80mM標(biāo)簽1.1-1.12之一的溶液;15μL 10X連接酶緩沖液和10μL去離子水。將這些管加熱到95℃1分鐘,然后冷卻到16℃10分鐘。向每個(gè)管中加入在50μl 1X連接酶緩沖液中的5,000單位的T4DNA連接酶(2.5μL,2,000,000單位/mL溶液(New England Biolabs,目錄號(hào)M0202)),獲得的溶液在16℃下溫育16小時(shí)。
連接后,將樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml Eppendorf管中,用20μL 5M NaCl水溶液和500μL冷(-20℃)乙醇處理,在-20℃下保持1小時(shí)。離心后,棄去上清液,用70%乙醇水溶液在-20℃下洗滌沉淀物。然后將每個(gè)沉淀物溶解于150μL 150mM硼酸鈉緩沖液,pH 9.4中。
在DMF中制備以分別0.25M的濃度含有結(jié)構(gòu)單元前體BB1至BB12之一、N,N-二異丙基乙醇胺和O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸的貯存液,并在室溫下攪拌20分鐘。向上述每個(gè)沉淀溶液中添加結(jié)構(gòu)單元前體溶液,提供相對(duì)于連接體10倍過(guò)量的結(jié)構(gòu)單元前體。攪拌獲得的溶液。20分鐘后向反應(yīng)混合物中加入另外10個(gè)當(dāng)量的結(jié)構(gòu)單元前體,40分鐘后加入另外10個(gè)當(dāng)量。DMF在反應(yīng)混合物中的終濃度為22%。然后在4℃下攪拌反應(yīng)溶液過(guò)夜。使用50mM乙酸四乙銨水溶液(pH=7.5)和乙腈,和2-46%乙腈的梯度,通過(guò)RP-HPLC在14分鐘內(nèi)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)展。當(dāng)約95%的起始材料(連接體)酰化時(shí)終止反應(yīng)。?;蠛喜⒎磻?yīng)混合物,凍干至干燥。然后通過(guò)HPLC純化凍干的物質(zhì),合并對(duì)應(yīng)于文庫(kù)的級(jí)分(?;a(chǎn)物),并凍干。
該文庫(kù)溶解于2.5ml 0.01M磷酸鈉緩沖液(pH=8.2)中,向其中加入0.1ml哌啶(4%v/v)。加入哌啶產(chǎn)生在混合時(shí)不溶解的混濁。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌50分鐘,然后離心(14,000rpm)混濁的溶液,用200μl移液管除去上清液,將沉淀物重懸浮于0.1ml水中。含水洗液與上清液混合,棄去沉淀。通過(guò)加入過(guò)量的冰冷的乙醇使乙醇在反應(yīng)液中的終濃度為70%v/v,從溶液中沉淀脫保護(hù)的文庫(kù)。離心含水乙醇混合物,產(chǎn)生含有該文庫(kù)的白色沉淀物。用冷70%乙醇水溶液洗滌沉淀物一次。除去溶劑后,使沉淀物風(fēng)干(約5分鐘),除去痕量的乙醇,然后在循環(huán)2中使用。在第1輪中使用的標(biāo)簽和相應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元前體在下面的表1中列出。
表1
循環(huán)2-5對(duì)于其中每一個(gè)循環(huán),將前一循環(huán)產(chǎn)生的混合的溶液分成12等份,每份50μl,置于PCR管中。向每管中加入含有不同標(biāo)簽的溶液,除循環(huán)3-5省略循環(huán)1所述的HPLC純化步驟之外,如循環(huán)1所述進(jìn)行連接、純化和?;S糜谘h(huán)2-5的標(biāo)簽與結(jié)構(gòu)單元前體的對(duì)應(yīng)關(guān)系在表2中給出。
利用以上對(duì)于標(biāo)簽連接所述的方法,將循環(huán)5的產(chǎn)物與以下所示的封閉引物連接。
5’-PO3-GGCACATTGATTTGGGAGTCAGTGTAACTAAACCCTCAGT-PO3-5’
表2
結(jié)果上述合成過(guò)程具有產(chǎn)生含有125(約249,000)個(gè)不同結(jié)構(gòu)的文庫(kù)的能力。通過(guò)對(duì)每一循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,監(jiān)測(cè)文庫(kù)的合成。5個(gè)循環(huán)中每一個(gè)的結(jié)果和封閉引物連接后的最終文庫(kù)在圖7中顯示。標(biāo)為“headpiece”的化合物是化合物1。該圖顯示每個(gè)循環(huán)導(dǎo)致預(yù)期的分子量增加,每一循環(huán)的產(chǎn)物在分子量上基本均勻。
實(shí)施例2具有大約108個(gè)成員的文庫(kù)的合成和表征含有大約108個(gè)不同成員的文庫(kù)的合成使用下列試劑實(shí)現(xiàn)化合物2
脫氧核糖核苷酸的單字母密碼A=腺苷C=胞苷G=鳥(niǎo)苷T=胸苷結(jié)構(gòu)單元前體





表3循環(huán)1中使用的寡核苷酸標(biāo)簽
表4循環(huán)2中使用的寡核苷酸標(biāo)簽
表5.循環(huán)3中使用的寡核苷酸標(biāo)簽
表6.循環(huán)4中使用的寡核苷酸標(biāo)簽
表7用于循環(huán)1-4的結(jié)構(gòu)單元和寡核苷酸標(biāo)簽之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系
1X連接酶緩沖液50mM Tris,pH 7.5;10mM二硫蘇糖醇;10mMMgCl2;2mM ATP;50mM NaCl。
10X連接酶緩沖液500mM Tris,pH 7.5;100mM二硫蘇糖醇;100mM MgCl2;20mM ATP;500mM NaCl。
水溶性間隔基與化合物2的連接將化合物2在硼酸鈉緩沖液(150mM,pH 9.4)中的溶液(60mL,1mM)冷卻到4℃,向其中加入在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(16mL,0.15M)中的40當(dāng)量的N-Fmoc-15-氨基-4,7,10,13-四氧雜硬脂酸(S-Ado),接著加入40當(dāng)量的4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉氯化物水合物(DMTMM)的水溶液(9.6mL,0.25M)?;旌衔镌?℃下輕輕搖動(dòng)2小時(shí),之后加入40當(dāng)量的S-Ado和DMTMM,并在4℃下再搖動(dòng)16小時(shí)。
酰化后,加入0.1X體積的5M NaCl水溶液和2.5X體積的冷(-20℃)乙醇,使該混合物在-20℃下靜置至少1小時(shí)。然后在4℃下以14,000rpm離心該混合物15分鐘,獲得白色沉淀物,用冷EtOH洗滌,然后在凍干機(jī)中室溫干燥30分鐘。將固體溶解在40mL水中,使用WatersXterra RP18柱通過(guò)反相HPLC純化。使用50mM乙酸三乙銨緩沖液pH7.5和99%乙腈/1%水溶液,利用二元流動(dòng)相梯度分布洗脫產(chǎn)物。通過(guò)凍干濃縮純化的物質(zhì),將獲得的殘余物溶解于5mL水中。向溶液中加入0.1X體積的哌啶,在室溫下輕輕搖動(dòng)混合物45分鐘。然后如上所述通過(guò)乙醇沉淀純化產(chǎn)物,并且離心分離。將獲得的沉淀物用冷EtOH洗滌兩次,通過(guò)凍干干燥,獲得純化的化合物3。
循環(huán)1向96孔板的每個(gè)孔中加入12.5μL 4mM化合物3的水溶液;100μL如表3所示的寡核苷酸標(biāo)簽1.1至1.96之一的1mM溶液(化合物3與標(biāo)簽的摩爾比為1∶2)。將板加熱至95℃1分鐘,然后冷卻至16℃10分鐘。向每孔中加入10μL 10X連接酶緩沖液、30單位T4DNA連接酶(1μL 30單位/μL溶液(FermentasLife Science,目錄號(hào)EL0013))、76.5μl水,獲得的溶液在16℃下溫育16小時(shí)。
連接反應(yīng)后,向每孔中直接加入20μL 5M NaCl水溶液,然后加入500μL冷(-20℃)乙醇,在-20℃下保持1小時(shí)。在Beckman CoulterAllegra 6R離心機(jī)上,使用Beckman Microplus Carriers,以3200g將板離心1小時(shí)。通過(guò)將板倒置小心除去上清液,用70%冷乙醇水溶液在-20℃下洗滌沉淀物。每種沉淀物然后溶解于硼酸鈉緩沖液(50μL,150mM,pH 9.4)中至濃度為1mM,并冷卻至4℃。
向每種溶液中加入在DMF中的40當(dāng)量的96種結(jié)構(gòu)單元前體之一(13μL,0.15M),然后加入40當(dāng)量的DMT-MM水溶液(8μL,0.25M),溶液在4℃下輕輕搖動(dòng)。2小時(shí)后,加入另外40當(dāng)量的各種結(jié)構(gòu)單元前體之一和DMTMM,溶液在4℃下輕輕搖動(dòng)16小時(shí)。酰化后,向每種溶液中加入在DMF中的10當(dāng)量乙酸-N-羥基-琥珀酰亞胺酯(2μL,0.25M),輕輕搖動(dòng)10分鐘。
?;?,合并96個(gè)反應(yīng)混合物,加入0.1倍體積的5M NaCl水溶液和2.5倍體積的冷無(wú)水乙醇,使溶液在-20℃下靜置至少1小時(shí)。然后離心該混合物。離心后,用微量移液器除去盡可能多的上清液,用冷乙醇洗滌沉淀物,再次離心。用200μL移液管除去上清液。向管中加入70%冷乙醇,獲得的混合物在4℃下離心5分鐘。
棄去上清液,剩余的乙醇通過(guò)在室溫下凍干10分鐘除去。然后將沉淀物溶解在2mL水中,并使用Waters Xterra RP18柱通過(guò)反相HPLC純化。使用50mM乙酸三乙銨水緩沖液pH 7.5和99%乙腈/1%水溶液,利用二元流動(dòng)相梯度分布洗脫文庫(kù)。收集、合并和凍干含有該文庫(kù)的級(jí)分。將獲得的殘余物溶解在2.5mL水中,加入250μL哌啶。輕輕搖動(dòng)溶液45分鐘,然后如前所述用乙醇沉淀。獲得的沉淀物通過(guò)凍干干燥,然后溶解在硼酸鈉緩沖液(4.8mL,150mM,pH 9.4)中至濃度為1mM。
將溶液冷卻至4℃,加入在DMF中的40當(dāng)量的每種N-Fmoc-炔丙基甘氨酸(1.2mL,0.15M)和DMT-MM水溶液(7.7mL,0.25M)?;旌衔镌?℃下輕輕搖動(dòng)2小時(shí),之后加入另外40當(dāng)量的N-Fmoc-炔丙基甘氨酸和DMT-MM,溶液再搖動(dòng)16小時(shí)。稍后如上所述通過(guò)EtOH沉淀和反相HPLC純化該混合物,并且如前所述用哌啶處理除去N-Fmoc基團(tuán)。在通過(guò)EtOH沉淀進(jìn)行最終純化后,通過(guò)凍干干燥獲得的沉淀物,并進(jìn)入合成的下一循環(huán)。
循環(huán)2-4對(duì)于這些循環(huán)中的每一個(gè),將來(lái)自前一循環(huán)的干燥沉淀物溶解在水中,并且根據(jù)文庫(kù)DNA成分的消光系數(shù),通過(guò)分光光度法測(cè)定文庫(kù)的濃度,其中化合物2的初始消光系數(shù)為131,500L/(mole.cm)。用水調(diào)節(jié)文庫(kù)的濃度,使后續(xù)連接反應(yīng)中的終濃度為0.25mM。然后將文庫(kù)在96孔板中分成96個(gè)等份。向每個(gè)孔中加入含有不同標(biāo)簽的溶液(文庫(kù)與標(biāo)簽的摩爾比為1∶2),如循環(huán)1所述進(jìn)行連接。循環(huán)2、3、4中使用的寡核苷酸標(biāo)簽分別在表4、5、6中列出。對(duì)于循環(huán)1-4中的每一個(gè),標(biāo)簽與結(jié)構(gòu)單元前體之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系在表7中提供。如以上對(duì)于循環(huán)1所述,通過(guò)加入乙醇沉淀文庫(kù),并將其溶解在硼酸鈉緩沖液(150mM,pH 9.4)中至濃度為1mM。隨后的?;图兓缪h(huán)1所述進(jìn)行,不同之處在于循環(huán)3中省略了HPLC純化。
利用以上對(duì)于標(biāo)簽連接所述的方法,將循環(huán)4的產(chǎn)物與以下所示的封閉引物連接。
5’-PO3-CAG AAG ACA GAC AAG CTT CAC CTG C (SEQ IDNO889)5’-PO3-GCA GGT GAA GCT TGT CTG TCT TCT GAA (SEQ IDNO890)結(jié)果上述合成程序能夠產(chǎn)生含有964(約108)個(gè)不同結(jié)構(gòu)的文庫(kù)。通過(guò)對(duì)每一循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳和LC/MS,監(jiān)測(cè)文庫(kù)的合成。完成后,用幾種方法分析文庫(kù)。圖13a是循環(huán)4后,但在封閉引物連接前的文庫(kù)的層析圖;圖13b是同一合成階段的文庫(kù)的質(zhì)譜圖。平均分子量通過(guò)負(fù)離子LC/MS分析測(cè)定。離子信號(hào)用ProMass軟件解析。該結(jié)果與預(yù)測(cè)的該文庫(kù)的平均質(zhì)量一致。
通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析文庫(kù)的DNA成分,顯示文庫(kù)物質(zhì)中的大多數(shù)對(duì)應(yīng)于正確大小的連接產(chǎn)物。對(duì)從文庫(kù)采樣獲得的PCR產(chǎn)物的分子克隆進(jìn)行DNA序列分析,顯示DNA連接高保真度地發(fā)生,并且接近于完成。
文庫(kù)環(huán)化在循環(huán)4結(jié)束時(shí),在通常的?;瘲l件下,用疊氮基乙酸將文庫(kù)的一部分在N-末端加帽。將通過(guò)EtOH沉淀純化的產(chǎn)物溶解在磷酸鈉緩沖液(150mM,pH 8)中至濃度為1mM,并加入各為4當(dāng)量的CuSO4水溶液(200mM)、抗壞血酸水溶液(200mM)和以下所示化合物的DMF溶液(200mM)。反應(yīng)混合物然后在室溫下輕輕搖動(dòng)2小時(shí)。
為了測(cè)定環(huán)化程度,從文庫(kù)環(huán)化反應(yīng)中取出5μL等份,用如實(shí)施例4所述制備的熒光標(biāo)記的疊氮化物或炔(1μL 100mM DMF貯存液)處理。16小時(shí)后,根據(jù)500nm下的HPLC分析,炔或疊氮化物標(biāo)記都未摻入文庫(kù)中。該結(jié)果表示該文庫(kù)不再含有能夠環(huán)加成的疊氮基或炔基,因此該文庫(kù)一定已經(jīng)通過(guò)環(huán)化或分子間反應(yīng)與自身發(fā)生了反應(yīng)。如前所述通過(guò)反相HPLC純化環(huán)化的文庫(kù)。用未環(huán)化的文庫(kù)進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示上述熒光標(biāo)記完全摻入。
實(shí)施例4用于環(huán)化測(cè)定的熒光標(biāo)記的制備在單獨(dú)的管中,炔丙基甘氨酸或2-氨基-3-苯丙基疊氮(各8μmol)與FAM-OSu(Molecular Probes Inc.)(1.2當(dāng)量)在pH 9.4的硼酸鹽緩沖液(250μL)中混合。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行3小時(shí),然后凍干過(guò)夜。經(jīng)HPLC純化獲得定量產(chǎn)率的需要的熒光炔和疊氮化物。

實(shí)施例5利用疊氮/炔環(huán)加成反應(yīng)環(huán)化各化合物疊氮基乙酰基-Gly-Pro-Phe-Pra-NH2的制備利用0.3mmol Rink-酰胺樹(shù)脂,以Fmoc-保護(hù)的氨基酸和HATU為活化劑,用標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)合成指定的序列(Pra=C-炔丙基甘氨酸)。使用疊氮基乙酸對(duì)該四肽加帽。用20%TFA/DCM從樹(shù)脂上切割肽4小時(shí)。經(jīng)RP HPLC純化獲得為白色固體的產(chǎn)物(75mg,51%)。1H HMR(DMSO-d6,400MHz)8.4-7.8(m,3H),7.4-7.1(m,7H),4.6-4.4(m,1H),4.4-4.2(m,2H),4.0-3.9(m,2H),3.74(dd,1H,J=6Hz,17Hz),3.5-3.3(m,2H),3.07(dt,1H,J=5Hz,14Hz),2.92(dd,1H,J=5Hz,16Hz),2.86(t,1H,J=2Hz),2.85-2.75(m,1H),2.6-2.4(m,2H),2.2-1.6(m,4H)。IR(mull)2900,2100,1450,1300cm-1。ESIMS 497.4([M+H],100%),993.4([2M+H],50%)。具有離子源破碎的ESIMS519.3([M+Na],100%),491.3(100%),480.1([M-NH2],90%),452.2([M-NH2-CO],20%),424.2(20%),385.1([M-Pra],50%),357.1([M-Pra-CO],40%),238.0([M-Pra-Phe],100%)。
疊氮基乙酰基-Gly-Pro-Phe-Pra-NH2的環(huán)化 疊氮基乙?;?31mg,0.62mmol)溶解在MeCN(30mL)中。加入二異丙基乙胺(DIEA,1mL)和Cu(MeCN)4PF6(1mg)。攪拌1.5小時(shí)后,蒸發(fā)溶液,將獲得的殘余物回收在20%MeCN/H2O中。離心除去不溶性鹽后,對(duì)溶液進(jìn)行制備型反相用LC。需要的環(huán)肽分離為白色固體(10mg,32%)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)8.28(t,1H,J=5Hz),7.77(s,1H),7.2-6.9(m,9H),4.98(m,2H),4.48(m,1H),4.28(m,1H),4.1-3.9(m,2H),3.63(dd,1H,J=5Hz,16Hz),3.33(m,2H),3.0(m,3H),2.48(dd,1H,J=11Hz,14Hz),1.75(m,1H0,1.55(m,1H),1.32(m,1H),1.05(m,1H)。IR(mull)2900,1475,1400cm-1。ESIMS 497.2([M+H],100%),993.2([2M+H],30%),1015.2([2M+Na],15%)。具有離子源破碎的ESIMS535.2(70%),519.3([M+Na],100%),497.2([M+H],80%),480.1([M-NH2],30%),452.2([M-NH2-CO],40%),208.1(60%)。
疊氮基乙?;?Gly-Pro-Phe-Pra-Gly-OH的制備利用0.3mmol甘氨酸-Wang樹(shù)脂,以Fmoc-保護(hù)的氨基酸和HATU為活化劑,合成指定的序列。在最后的偶聯(lián)步驟中使用疊氮基乙酸對(duì)該五肽加帽。用50%TFA/DCM切割該肽2小時(shí)。經(jīng)RP HPLC純化獲得為白色固體的肽(83mg;50%)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)8.4-7.9(m,4H),7.2(m,5H),4.7-4.2(m,3H),4.0-3.7(m,4H),3.5-3.3(m,2H),3.1(m,1H),2.91(dd,1H,J=4Hz,16Hz),2.84(t,1H,J=2.5Hz),2.78(m,1H),2.6-2.4(m,2H),2.2-1.6(m,4H)。IR(mull)2900,2100,1450,1350cm-1。ESIMS 555.3([M+H],100%)。具有離子源破碎的ESIMS577.1([M+Na],90%),555.3([M+H],80%),480.1([M-Gly],100%),385.1([M-Gly-Pra],70%),357.1([M-Gly-Pra-CO],40%),238.0([M-Gly-Pra-Phe],80%)。
疊氮基乙?;?Gly-Pro-Phe-Pra-Gly-OH的環(huán)化將肽(32mg,0.058mmol)溶解于MeCN(60mL)中。加入二異丙基乙胺(1mL)和Cu(MeCN)4PF6(1mg),攪拌溶液2小時(shí)。蒸發(fā)溶劑,對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行RP HPLC以除去二聚體和三聚體。環(huán)狀單體分離為無(wú)色玻璃狀(6mg,20%)。ESIMS 555.6([M+H],100%),1109.3([2M+H],20%),1131.2([2M+Na],15%)。具有離子源破碎的ESIMS555.3([M+H],100%),480.4([M-Gly],30%),452.2([M-Gly-CO],25%),424.5([M-Gly-2CO],10%,只在環(huán)形結(jié)構(gòu)中才有可能)。
直鏈肽與DNA的偶聯(lián)化合物2(45nmol)溶解在45μL硼酸鈉緩沖液(pH 9.4;150mM)中。在4℃下加入直鏈肽(18μL在DMF中的100mM貯存液;180nmol;40當(dāng)量),然后加入DMT-MM(3.6μL500mM在水中的貯存液;180nmol;40當(dāng)量)。攪拌2小時(shí)后,LCMS顯示完全反應(yīng),經(jīng)乙醇沉淀分離產(chǎn)物。ESIMS 1823.0([M-3H]/3,20%),1367.2([M-4H]/4,20%),1093.7([M-5H]/5,40%),911.4([M-6H]/6,100%)。
環(huán)肽與DNA的偶聯(lián)化合物2(20nmol)溶解在20μL硼酸鈉緩沖液(pH 9.4,150mM)中。在4℃下加入直鏈肽(8μL 100mM在DMF中的貯存液;80nmol;40當(dāng)量),然后加入DMT-MM(1.6μL 500mM在水中的貯存液;80nmol;40當(dāng)量)。攪拌2小時(shí)后,LCMS顯示完全反應(yīng),經(jīng)乙醇沉淀分離產(chǎn)物。ESIMS 1823.0([M-3H]/3,20%),1367.2([M-4H]/4,20%),1093.7([M-5H]/5,40%),911.4([M-6H]/6,100%)。
DNA-連接的肽的環(huán)化直鏈肽-DNA偶聯(lián)物(10nmol)溶解在pH 8的磷酸鈉緩沖液(10μL,150mm)中。在室溫下加入各為4當(dāng)量的CuSO4、抗壞血酸和Sharpless配體(0.2μL 200mM貯存液)。反應(yīng)進(jìn)行過(guò)夜。RP HPLC顯示沒(méi)有直鏈肽-DNA,產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)肽-DNA共洗脫。未見(jiàn)痕量二聚體或其他寡聚體。
4.48分鐘時(shí)洗脫 4.27分鐘時(shí)洗脫LC條件Targa C18,2.1×40mm,10-40%MeCN在40mM TEAA水溶液中,8分鐘實(shí)施例6芳香親核取代反應(yīng)應(yīng)用于功能部分的合成用氰尿酰氯對(duì)化合物3進(jìn)行芳基化的一般程序化合物2以1mM的溶液溶解在pH 9.4硼酸鈉緩沖液中。將溶液冷卻至4℃,然后以MeCN中的500mM溶液加入20當(dāng)量的氰尿酰氯。2小時(shí)后,經(jīng)LCMS證實(shí)反應(yīng)完全,獲得的二氯三嗪-DNA偶聯(lián)物經(jīng)乙醇沉淀分離。
二氯三嗪-DNA的胺取代程序二氯三嗪-DNA偶聯(lián)物以1mM的濃度溶解在pH 9.5硼酸鹽緩沖液中。在室溫下以DMF溶液加入40當(dāng)量的脂肪族胺。該反應(yīng)后進(jìn)行LCMS,通常在2小時(shí)后完成。獲得的烷基氨基-一氯三嗪-DNA偶聯(lián)物經(jīng)乙醇沉淀分離。
一氯三嗪-DNA的胺取代程序烷基氨基-一氯三嗪-DNA偶聯(lián)物以1mM的濃度溶解在pH 9.5硼酸鹽緩沖液中。在42℃下以DMF溶液加入40當(dāng)量的第二種脂肪族胺。該反應(yīng)后進(jìn)行LCMS,通常在2小時(shí)后完成。獲得的二氨基三嗪-DNA偶聯(lián)物經(jīng)乙醇沉淀分離。
實(shí)施例7還原性胺化反應(yīng)應(yīng)用于功能部分的合成含仲胺的DNA-連接體與醛結(jié)構(gòu)單元還原性胺化的一般程序化合物2與N-末端脯氨酸殘基偶聯(lián)。獲得的化合物以1mM的濃度溶解在磷酸鈉緩沖液(50μL,150mM,pH 5.5)中。向該溶液中加入各為40當(dāng)量的DMF中的醛結(jié)構(gòu)單元(8μL,0.25M)和DMF中的氰基硼氫化鈉(8μL,0.25M),將溶液在80℃下加熱2小時(shí)。烷基化后,通過(guò)乙醇沉淀純化該溶液。
含醛的DNA-連接體與胺結(jié)構(gòu)單元還原性胺化的一般程序與含醛基的結(jié)構(gòu)單元偶聯(lián)的化合物2以1mM的濃度溶解在磷酸鈉緩沖液(50μL,250mM,pH 5.5)中。向該溶液中加入各為40當(dāng)量的DMF中的胺結(jié)構(gòu)單元(8μL,0.25M)和DMF中的氰基硼氫化鈉(8μL,0.25M),將溶液在80℃下加熱2小時(shí)。烷基化后,通過(guò)乙醇沉淀純化該溶液。
實(shí)施例8類(lèi)肽構(gòu)建反應(yīng)應(yīng)用于功能部分的合成在DNA-連接體上進(jìn)行類(lèi)肽合成的一般程序 化合物2以1mM的濃度溶解在硼酸鈉緩沖液(50μL,150mM,pH9.4)中,冷卻到4℃。向該溶液中加入40當(dāng)量的DMF中的N-羥基琥珀酰亞氨基溴乙酸酯(13μL,0.15M),該溶液在4℃下輕輕搖動(dòng)2小時(shí)。?;?,DNA-連接體經(jīng)乙醇沉淀純化,以1mM的濃度再溶解在硼酸鈉緩沖液(50μL,150mM,pH 9.4)中,并冷卻到4℃。向該溶液中加入40當(dāng)量的DMF中的胺結(jié)構(gòu)單元(13μL,0.15M),溶液在4℃下輕輕搖動(dòng)16小時(shí)。烷化后,DNA-連接體經(jīng)乙醇沉淀純化,以1mM的濃度再溶解在硼酸鈉緩沖液(50μL,150mM,pH 9.4)中,并冷卻到4℃。通過(guò)分步加入N-羥基琥珀酰亞氨基溴乙酸酯,接著加入胺結(jié)構(gòu)單元,繼續(xù)類(lèi)肽合成。
實(shí)施例9疊氮化物-炔環(huán)加成反應(yīng)應(yīng)用于功能部分合成一般程序含炔的DNA偶聯(lián)物以約1mM的濃度溶解在pH 8.0的磷酸鹽緩沖液。在室溫下向該混合物中加入10當(dāng)量的有機(jī)疊氮化物和各為5當(dāng)量的硫酸銅(II)、抗壞血酸和配體(三-((1-芐基三唑-4-基)甲基)胺。該反應(yīng)后進(jìn)行LCMS,通常在1-2小時(shí)后完成。獲得的三唑-DNA偶聯(lián)物可通過(guò)乙醇沉淀分離。
實(shí)施例10從編碼文庫(kù)內(nèi)鑒定Abl激酶的配體為了鑒定對(duì)治療目標(biāo)具有確定性質(zhì)的單一化合物,在DNA-編碼文庫(kù)中相對(duì)于不需要的文庫(kù)成員富集目標(biāo)分子的能力是極為重要的。為了證明這種富集能力,合成了rhAbl激酶(GenBank U07563)的已知結(jié)合分子(描述于Shah等人,Science 305,399-401(2004),在此引用作為參考)。利用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法將該化合物通過(guò)前面實(shí)施例中所述的連接體連接到雙鏈DNA寡核苷酸上,產(chǎn)生與通過(guò)實(shí)施例1和2所述方法產(chǎn)生的產(chǎn)物(與寡核苷酸連接的功能部分)相類(lèi)似的分子。通常如實(shí)施例2所述產(chǎn)生的文庫(kù)和DNA-連接的Abl激酶結(jié)合分子設(shè)計(jì)為具有獨(dú)特的DNA序列,使兩種物質(zhì)都能進(jìn)行qPCR分析。DNA-連接的Abl激酶結(jié)合分子與文庫(kù)以1∶1000的比例混合。該混合物用rhAble激酶平衡,該酶在固相上捕獲,洗滌除去未結(jié)合的文庫(kù)成員,洗脫結(jié)合的分子。洗脫物中文庫(kù)分子與DNA-連接的Abl激酶抑制劑的比例為1∶1,表示DNA-連接的Abl-激酶結(jié)合分子獲得500倍以上的富集,與文庫(kù)分子相比1000-倍過(guò)量。
等同方案本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到,或者僅應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠確定此處所述的本發(fā)明的特定實(shí)施方案的許多等同方案。這些等同方案包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。
序列表<110>普雷西斯藥品公司等<120>合成編碼文庫(kù)的方法<130>PPI-156PC<150>60/530854<151>2003-12-17<150>60/540681<151>2004-01-30<150>60/553715<151>2004-03-15<150>60/588672<151>2004-07-16<160>890<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>1gcaacgaag9<210>2<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>2tcgttgcca9<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>3gcgtacaag9<210>4<211>9
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>4tgtacgcca9<210>5<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>5gctctgtag9<210>6<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>6acagagcca9<210>7<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>7gtgccatag9<210>8<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>8atggcacca9<210>9<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>9gttgaccag9<210>10<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>10ggtcaacca9<210>11<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>11cgacttgac9<210>12<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>12acgctgaac9<210>13<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>13cgtagtcag9<210>14<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>14gactacgca9<210>15
<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>15ccagcatag9<210>16<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>16atgctggca9<210>17<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>17cctacagag9<210>18<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>18ctgtaggca9<210>19<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>19ctgaacgag9<210>20<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>20acgacttgc9<210>21<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>21ctccagtag9<210>22<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>22actggagca9<210>23<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>23taggtccag9<210>24<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>24ggacctaca9<210>25<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>25gcgtgttgt9<210>26
<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>26aacacgcct9<210>27<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>27gcttggagt9<210>28<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>28tccaagcct9<210>29<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>29gtcaagcgt9<210>30<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>157aaatcgatgt gtgcgaggag 20<210>158
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>158cctcgcacac atcgatttgg 20<210>159<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>159aaatcgatgt ggaacacgag 20<210>160<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>160cgtgttccac atcgatttgg 20<210>161<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>161aaatcgatgt gcttgtcgag 20<210>162<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>162cgacaagcac atcgatttgg 20<210>163<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>163aaatcgatgt gttccggtag 20<210>164<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>164accggaacac atcgatttgg 20<210>165<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>165aaatcgatgt gtgcgagcag 20<210>166<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>166gctcgcacac atcgatttgg 20<210>167<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>167aaatcgatgt ggtcaggtag 20<210>168<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>169aaatcgatgt ggcctgttag20<210>170<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>170aacaggccac atcgatttgg20<210>171<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>176tctcgcacac atcgatttgg 20<210>177<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>181aaatcgatgt gtggaacgag 20<210>182<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>182cgttccacac atcgatttgg 20<210>183<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>185aaatcgatgt gtggaaccag 20<210>186<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>187aaatcgatgt gttaggcgag 20<210>188<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>196tcctgaccac atcgatttgg 20<210>197<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>197aaatcgatgt ggtagccgag 20<210>198<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>198cggctaccac atcgatttgg 20<210>199<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>247aaatcgatgt gctatcgcag 20<210>248<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>250gctttcgcac atcgatttgg 20<210>251<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>253aaatcgatgt gtctggcaag 20<210>254<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>254tgccagacac atcgatttgg 20<210>255<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>255aaatcgatgt ggatggtcag 20<210>256<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>257aaatcgatgt ggttgcacag 20<210>258<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>259aaatcgatgt gggcatcgag 20<210>260<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>262ggaggcacac atcgatttgg 20<210>263<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>263aaatcgatgt gtgcctcaag 20<210>264<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>264tgaggcacac atcgatttgg 20<210>265<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>265aaatcgatgt gggcatccag 20<210>266<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>266ggatgcccac atcgatttgg 20<210>267<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>271aaatcgatgt ggacggatag 20<210>272<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>272atccgtccac atcgatttgg 20<210>273<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>373cggacctgt9<210>374<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>796cctctcctc9<210>797<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>797cactgactt9<210>798<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>798gtcagtgtc9<210>799<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>806cactagctc9<210>807
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<223>合成構(gòu)建體<400>822cgtctgttc9<210>823<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>823gagtgcctt9<210>824<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>824ggcactctc9<210>825<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>825acagacctt9<210>826<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>826ggtctgttc9<210>827<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>827cgagctttt9<210>828<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>834agagacctc9<210>835<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>835gccagattt9<210>836<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>836atctggctc9<210>837<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>837gagaccttt9<210>838<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>838aggtctctc9<210>839<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>839cacacagtt9<210>840
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<223>合成構(gòu)建體<400>841cctcttctt9<210>842<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>842gaagaggtc9<210>843<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>843tagagcgtt9<210>844<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>844cgctctatc9<210>845<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>845gcacctttt9<210>846<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成構(gòu)建體<400>847ggcttgttt9<210>848<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>848acaagcctc9<210>849<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>849gacgcgatt9<210>850<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>850tcgcgtctc9<210>851
<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>851cgagctgtt9<210>852<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>852cagctcgtc9<210>853<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>853tagagcctt9<210>854<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>854ggctctatc9<210>855<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>855catccgttt9<210>856<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>856acggatgtc9<210>857<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>857ggtctcgtt9<210>858<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>858cgagacctc9<210>859<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>859gccagagtt9<210>860<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>860ctctggctc9<210>861<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>861gagaccgtt9
<210>862<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>862cggtctctc9<210>863<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>863cgagctatt9<210>864<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>864tagctcgtc9<210>865<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>865gcaagtgtt9<210>866<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>866cacttgctc9<210>867<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>867ggtctcctt9<210>868<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>868ggagacctc9<210>869<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>869gccagactt9<210>870<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>870gtctggctc9<210>871<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>871ggtctcatt9<210>872<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>872tgagacctc9<210>873
<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>873gagaccatt9<210>874<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>874tggtctctc9<210>875<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>875ccttcagtt9<210>876<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>876ctgaaggtc9<210>877<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>877gcacctgtt9<210>878<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>878caggtgctc9<210>879<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>879aaaggcgtt9<210>880<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>880cgccttttc9<210>881<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>881cagatcgtt9<210>882<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>882cgatctgtc9<210>883<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>883cataggctt9<210>884
<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>884gcctatgtc9<210>885<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>885ccttcactt9<210>886<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>886gtgaaggtc9<210>887<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>887gcacctctt9<210>888<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>888gaggtgctc9<210>889<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>889cagaagacag acaagcttca cctgc25<210>890<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>890gcaggtgaag cttgtctgtc ttctgaa 2權(quán)利要求
1.一種合成包含與編碼寡核苷酸可操作連接的功能部分的分子的方法,該方法包括以下步驟(a)提供由包含n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的起始功能部分組成的起始化合物,其中n是1或大于1的整數(shù),其中該起始功能部分包含至少一個(gè)反應(yīng)基團(tuán),并且與起始寡核苷酸可操作連接;(b)將該起始化合物與包含至少一個(gè)互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元反應(yīng),其中該至少一個(gè)互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)與步驟(a)的反應(yīng)基團(tuán)互補(bǔ),反應(yīng)條件適合所述互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵;(c)將所述起始寡核苷酸與標(biāo)識(shí)步驟(b)的結(jié)構(gòu)單元的引入寡核苷酸反應(yīng),反應(yīng)條件適合所述引入寡核苷酸與起始寡核苷酸連接形成編碼寡核苷酸,并存在催化起始寡核苷酸與引入寡核苷酸連接的酶;從而產(chǎn)生包含功能部分的分子,該功能部分含有n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼寡核苷酸可操作連接。
2.權(quán)利要求1的方法,其中步驟(c)的功能部分包含反應(yīng)基團(tuán),重復(fù)步驟(a)至(c)一次或多次,從而形成循環(huán)1至i,其中i是2或大于2的整數(shù),其中循環(huán)s的步驟(c)的產(chǎn)物是循環(huán)s+1的起始化合物,其中s是i-1或更小的整數(shù)。
3.權(quán)利要求1的方法,其中步驟(c)在步驟(b)之前,或者步驟(b)在步驟(c)之前。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述結(jié)構(gòu)單元的至少一個(gè)是氨基酸或活化的氨基酸。
5.權(quán)利要求1的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自氨基、羧基、磺?;?、膦?;?、環(huán)氧基、吖丙啶基和異氰酸酯基。
6.權(quán)利要求1的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自羥基、羧基、磺酰基、膦?;?、環(huán)氧基、吖丙啶基和異氰酸酯基。
7.權(quán)利要求1的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自氨基和醛基或酮基。
8.權(quán)利要求7的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)與互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)在還原條件下進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自磷葉立德基和醛基或酮基。
10.權(quán)利要求1的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)通過(guò)環(huán)加成作用反應(yīng),形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
11.權(quán)利要求10的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自炔和疊氮基。
12.權(quán)利要求10的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自鹵代雜芳基和親核基團(tuán)。
13.權(quán)利要求12的方法,其中所述鹵代雜芳基選自氯代嘧啶、氯代三嗪和氯代嘌呤。
14.權(quán)利要求12的方法,其中所述親核基團(tuán)是氨基。
15.權(quán)利要求1的方法,其中所述酶選自DNA連接酶、RNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶。
16.權(quán)利要求1的方法,其中所述起始寡核苷酸是雙鏈或單鏈的。
17.權(quán)利要求16的方法,其中所述起始寡核苷酸包含PCR引物序列。
18.權(quán)利要求16的方法,其中所述起始寡核苷酸是單鏈的,且引入寡核苷酸是單鏈的;或者起始寡核苷酸是雙鏈的,且引入寡核苷酸是雙鏈的。
19.權(quán)利要求18的方法,其中起始功能部分和起始寡核苷酸通過(guò)連接部分連接。
20.權(quán)利要求19的方法,其中所述起始寡核苷酸是雙鏈的,所述連接部分與起始功能部分和與起始寡核苷酸的兩條鏈共價(jià)偶聯(lián)。
21.權(quán)利要求1的方法,其中所述引入寡核苷酸為3到10個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
22.權(quán)利要求2的方法,其中循環(huán)i的引入寡核苷酸包含PCR封閉引物。
23.權(quán)利要求2的方法,其在循環(huán)i中進(jìn)一步包括以下步驟(d)將包含封閉PCR引物序列的寡核苷酸與編碼寡核苷酸連接。
24.權(quán)利要求23的方法,其中在催化所述連接的酶的存在下,將包含封閉PCR引物序列的寡核苷酸與編碼寡核苷酸連接。
25.權(quán)利要求2的方法,其在循環(huán)i后進(jìn)一步包括以下步驟(e)環(huán)化所述功能部分。
26.權(quán)利要求25的方法,其中所述功能部分包含炔基和疊氮基,且將該化合物在適合炔基和疊氮基環(huán)加成作用形成三唑基的條件下處理,從而環(huán)化該功能部分。
27.一種合成化合物文庫(kù)的方法,其中化合物包含功能部分,該功能部分包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元并且與標(biāo)識(shí)該功能部分結(jié)構(gòu)的起始寡核苷酸可操作連接,該方法包括下列步驟(a)提供包含m種起始化合物的溶液,其中m是1或大于1的整數(shù),其中起始化合物由包含n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分組成,其中n是1或大于1的整數(shù),該功能部分與標(biāo)識(shí)該n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的起始寡核苷酸可操作連接;(b)將步驟(a)的溶液分配到r個(gè)反應(yīng)容器中,其中r是2或大于2的整數(shù),從而產(chǎn)生r個(gè)等份的溶液;(c)將每個(gè)反應(yīng)容器中的起始化合物與r個(gè)結(jié)構(gòu)單元之一反應(yīng),從而產(chǎn)生r個(gè)等份,該等份包含由功能部分組成的化合物,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與起始寡核苷酸可操作連接;和(d)在適合引入寡核苷酸與起始寡核苷酸發(fā)生酶連接的條件下,在催化引入寡核苷酸與起始寡核苷酸連接的酶的存在下,將每個(gè)等份中的起始寡核苷酸與一組r個(gè)不同引入寡核苷酸之一反應(yīng);從而產(chǎn)生r個(gè)等份,這些等份包含由功能部分組成的分子,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼該n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元的延長(zhǎng)的寡核苷酸可操作連接。
28.權(quán)利要求27的方法,其進(jìn)一步包括以下步驟(e)組合所述r個(gè)等份中的兩個(gè)或多個(gè)等份,從而產(chǎn)生包含由功能部分組成的分子的溶液,該功能部分包含n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與編碼該n+1個(gè)結(jié)構(gòu)單元的延長(zhǎng)的寡核苷酸可操作連接。
29.權(quán)利要求28的方法,其中混合r個(gè)等份。
30.權(quán)利要求28的方法,其中步驟(a)至(e)進(jìn)行一次或多次,產(chǎn)生循環(huán)1至i,其中i是2或大于2的整數(shù),其中在循環(huán)s+1中,其中s是i-1或更小的整數(shù),步驟(a)的含m種起始化合物的溶液是循環(huán)s的步驟(e)的溶液。
31.權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的方法,其中在循環(huán)1至i的至少一個(gè)中,步驟(d)在步驟(c)之前。
32.權(quán)利要求28的方法,其中至少一個(gè)結(jié)構(gòu)單元是氨基酸。
33.權(quán)利要求7的方法,其中所述酶是DNA連接酶、RNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶。
34.權(quán)利要求28的方法,其中所述起始寡核苷酸是雙鏈寡核苷酸。
35.權(quán)利要求34的方法,其中所述引入寡核苷酸是雙鏈寡核苷酸。
36.權(quán)利要求28的方法,其中所述起始化合物包含連接體部分,該連接體部分包含適合與結(jié)構(gòu)單元鍵合的第一官能團(tuán)、適合與寡核苷酸的5’末端鍵合的第二官能團(tuán),和適合與寡核苷酸的3’末端鍵合的第三官能團(tuán)。
37.權(quán)利要求36的方法,其中所述連接體部分具有結(jié)構(gòu) 其中A是適合與結(jié)構(gòu)單元鍵合的官能團(tuán);B是適合與寡核苷酸的5’末端鍵合的官能團(tuán);C是適合與寡核苷酸的3’末端鍵合的官能團(tuán);S是原子或支架;D是將A與S相連接的化學(xué)結(jié)構(gòu);E是將B與S相連接的化學(xué)結(jié)構(gòu);且F是將C與S相連接的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
38.權(quán)利要求37的方法,其中A是氨基;B是磷酸基;且C是磷酸基。
39.權(quán)利要求37的方法,其中D、E和F各自獨(dú)立地為亞烷基或低聚(乙二醇)基。
40.權(quán)利要求37的方法,其中S是碳原子、氮原子、磷原子、硼原子、磷酸基、環(huán)基或多環(huán)基。
41.權(quán)利要求40的方法,其中連接體部分具有結(jié)構(gòu) 其中n、m和p各自獨(dú)立地為1至約20的整數(shù)。
42.權(quán)利要求41的方法,其中n、m和p各自獨(dú)立地為2至8的整數(shù)。
43.權(quán)利要求42的方法,其中n、m和p各自獨(dú)立地為3至6的整數(shù)。
44.權(quán)利要求41的方法,其中連接體部分具有結(jié)構(gòu)
45.權(quán)利要求27的方法,其中所述起始化合物的每一個(gè)都包含反應(yīng)基團(tuán),并且其中所述r個(gè)結(jié)構(gòu)單元的每一個(gè)都包含與所述反應(yīng)基團(tuán)互補(bǔ)的互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)。
46.權(quán)利要求45的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自氨基、羧基、磺?;㈧Ⅴ;?、環(huán)氧基、吖丙啶基和異氰酸酯基。
47.權(quán)利要求45的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自羥基、羧基、磺酰基、膦?;h(huán)氧基、吖丙啶基團(tuán)和異氰酸酯基。
48.權(quán)利要求45的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自氨基和醛基或酮基。
49.權(quán)利要求45的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)與互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)之間的反應(yīng)在還原條件下進(jìn)行。
50.權(quán)利要求45的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自磷葉立德基和醛基或酮基。
51.權(quán)利要求45的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)通過(guò)環(huán)加成作用反應(yīng),形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
52.權(quán)利要求51的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)選自炔和疊氮基。
53.權(quán)利要求45的方法,其中所述反應(yīng)基團(tuán)和互補(bǔ)官能團(tuán)選自鹵代雜芳基和親核基團(tuán)。
54.權(quán)利要求53的方法,其中所述鹵代雜芳基選自氯代嘧啶、氯代三嗪和氯代嘌呤。
55.權(quán)利要求53的方法,其中所述親核基團(tuán)是氨基。
56.權(quán)利要求28的方法,其在循環(huán)i后進(jìn)一步包括以下步驟(f)環(huán)化一個(gè)或多個(gè)功能部分。
57.權(quán)利要求56的方法,其中步驟(f)的功能部分包含疊氮基和炔基。
58.權(quán)利要求57的方法,其中所述功能部分保持在適合疊氮基和炔基環(huán)加成反應(yīng)形成三唑基的條件下,從而形成環(huán)狀功能部分。
59.權(quán)利要求58的方法,其中所述環(huán)加成反應(yīng)在銅催化劑的存在下進(jìn)行。
60.權(quán)利要求59的方法,其中步驟(f)的一個(gè)或多個(gè)功能部分中的至少一個(gè)包含至少兩個(gè)巰基,并且該功能部分保持在適合兩個(gè)巰基反應(yīng)形成二硫基的條件下,從而環(huán)化該功能部分。
61.權(quán)利要求27的方法,其中所述起始寡核苷酸包含PCR引物序列。
62.權(quán)利要求28的方法,其中循環(huán)i的引入寡核苷酸包含PCR封閉引物。
63.權(quán)利要求28的方法,其在循環(huán)i后進(jìn)一步包括以下步驟(d)將包含封閉PCR引物序列的寡核苷酸與編碼寡核苷酸連接。
64.權(quán)利要求63的方法,其中在催化所述連接的酶的存在下,所述包含封閉PCR引物序列的寡核苷酸與編碼寡核苷酸連接。
65.下式的化合物 其中X是包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分;Z是在其3’末端與B連接的寡核苷酸;Y是在其5’末端與C連接的寡核苷酸;A是與X形成共價(jià)鍵的官能團(tuán);B是與Z的3’-末端形成鍵的官能團(tuán);C是與Y的5’-末端形成鍵的官能團(tuán);D、F和E各自獨(dú)立地是雙功能連接基團(tuán);且S是原子或分子支架。
66.權(quán)利要求65的化合物,其中D、E和F各自獨(dú)立地是亞烷基鏈或低聚(乙二醇)鏈。
67.權(quán)利要求65的化合物,其中Y和Z基本互補(bǔ),并且在化合物中定向,從而在適當(dāng)條件下能夠發(fā)生Watson-Crick堿基配對(duì)和雙鏈體形成。
68.權(quán)利要求65的化合物,其中Y和Z具有相同的長(zhǎng)度或不同的長(zhǎng)度。
69.權(quán)利要求68的化合物,其中Y和Z具有相同的長(zhǎng)度。
70.權(quán)利要求65的化合物,其中Y和Z各為10個(gè)或更多堿基的長(zhǎng)度,并且具有10個(gè)更多堿基對(duì)的互補(bǔ)區(qū)。
71.權(quán)利要求65的化合物,其中S是碳原子、硼原子、氮原子、磷原子或多原子支架。
72.權(quán)利要求71的化合物,其中S是磷酸基或環(huán)基。
73.權(quán)利要求72的化合物,其中S是環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、芳基或雜芳基。
74.權(quán)利要求65的化合物,其中連接體部分具有結(jié)構(gòu) 其中n、m和p各自獨(dú)立地為1至約20的整數(shù)。
75.權(quán)利要求74的化合物,其中n、m和p各自獨(dú)立地為2至8的整數(shù)。
76.權(quán)利要求75的化合物,其中n、m和p各自獨(dú)立地為3至6的整數(shù)。
77.權(quán)利要求65的化合物,其中連接體部分具有結(jié)構(gòu)
78.權(quán)利要求65的化合物,其中X和Y包含PCR引物序列。
79.一種包含至少約102種不同化合物的化合物文庫(kù),該化合物包含功能部分,該功能部分包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元并且與識(shí)別該功能部分結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可操作連接。
80.權(quán)利要求79的化合物文庫(kù),該文庫(kù)包含各為至少約105個(gè)拷貝的不同化合物。
81.權(quán)利要求79的化合物文庫(kù),該文庫(kù)包含各為至少約106個(gè)拷貝的不同化合物。
82.權(quán)利要求79的化合物文庫(kù),其包含至少約104種不同的化合物。
83.權(quán)利要求79的化合物文庫(kù),其包含至少約106種不同的化合物。
84.權(quán)利要求79的化合物文庫(kù),其包含至少約108種不同的化合物。
85.權(quán)利要求79的化合物文庫(kù),其包含至少約1010種不同的化合物。
86.權(quán)利要求79的化合物文庫(kù),其包含至少約1012種不同的化合物。
87.權(quán)利要求79的化合物文庫(kù),其中該文庫(kù)包含多種獨(dú)立地為式I的化合物 其中X是包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分;Z是在其3’末端與B連接的寡核苷酸;Y是在其5’末端與C連接的寡核苷酸;A是與X形成共價(jià)鍵的官能團(tuán);B是與Z的3’-末端形成鍵的官能團(tuán);C是與Y的5’-末端形成鍵的官能團(tuán);D、F和E各自獨(dú)立地是雙功能連接基團(tuán);且S是原子或分子支架。
88.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中對(duì)于每一種式I的化合物,A、B、C、D、E、F和S各自具有相同的身份。
89.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),該文庫(kù)基本由多種式I的化合物組成。
90.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中D、E和F各自獨(dú)立地是亞烷基鏈或低聚(乙二醇)鏈。
91.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中Y和Z基本互補(bǔ),并且在化合物中定向,從而在適當(dāng)條件下能夠發(fā)生Watson-Crick堿基配對(duì)和雙鏈體形成。
92.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中Y和Z具有相同的長(zhǎng)度或不同的長(zhǎng)度。
93.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中Y和Z具有相同的長(zhǎng)度。
94.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中Y和Z各自為10個(gè)或更多堿基的長(zhǎng)度,并且具有10個(gè)或更多堿基對(duì)的互補(bǔ)區(qū)。
95.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中S是碳原子、硼原子、氮原子、磷原子或多原子支架。
96.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中S是磷酸基或環(huán)基。
97.權(quán)利要求96的化合物文庫(kù),其中S是環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、芳基或雜芳基。
98.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中連接體部分具有結(jié)構(gòu) 其中n、m和p各自獨(dú)立地是1至約20的整數(shù)。
99.權(quán)利要求98的化合物文庫(kù),其中n、m和p各自獨(dú)立地是2至8的整數(shù)。
100.權(quán)利要求99的化合物,其中n、m和p各自獨(dú)立地是3至6的整數(shù)。
101.權(quán)利要求87的化合物,其中連接體部分具有結(jié)構(gòu)
102.權(quán)利要求87的化合物文庫(kù),其中X和Z包含PCR引物序列。
103.由權(quán)利要求1的方法制備的一種化合物。
104.由權(quán)利要求27的方法制備的一種化合物文庫(kù)。
105.一種鑒定能與生物靶標(biāo)結(jié)合的一種或多種化合物的方法,該方法包括以下步驟(a)在適合化合物文庫(kù)的至少一個(gè)成員與靶標(biāo)結(jié)合的條件下使該生物靶標(biāo)接觸通過(guò)權(quán)利要求27的方法制備的化合物文庫(kù);(b)除去不與該靶標(biāo)結(jié)合的文庫(kù)成員;(c)擴(kuò)增能與該靶標(biāo)結(jié)合的化合物文庫(kù)至少一個(gè)成員的編碼寡核苷酸;(d)對(duì)步驟(c)的編碼寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序;和(e)利用步驟(d)測(cè)定的序列確定能與該生物靶標(biāo)結(jié)合的化合物文庫(kù)成員的功能部分的結(jié)構(gòu);從而鑒定能與生物靶標(biāo)結(jié)合的一種或多種化合物。
106.一種鑒定能與生物靶標(biāo)結(jié)合的化合物的方法,該方法包括以下步驟(a)在適合化合物文庫(kù)的至少一個(gè)成員與靶標(biāo)結(jié)合的條件下,使生物靶標(biāo)接觸包含至少約102種不同化合物的化合物文庫(kù),該化合物包含功能部分,該功能部分包含兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元,并且與標(biāo)識(shí)該功能部分的結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可操作連接;(b)除去不與該靶標(biāo)結(jié)合的文庫(kù)成員;(c)擴(kuò)增能與該靶標(biāo)結(jié)合的化合物文庫(kù)至少一個(gè)成員的編碼寡核苷酸;(d)對(duì)步驟(c)的編碼寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序;和(e)利用步驟(d)測(cè)定的序列確定能與該生物靶標(biāo)結(jié)合的化合物文庫(kù)成員的功能部分的結(jié)構(gòu);從而鑒定能與該生物靶標(biāo)結(jié)合的一種或多種化合物。
107.權(quán)利要求106的方法,其中所述文庫(kù)包含各為至少約105個(gè)拷貝的不同化合物。
108.權(quán)利要求106的方法,其中所述文庫(kù)包含各為至少約106個(gè)拷貝的不同化合物。
109.權(quán)利要求106的方法,其中所述文庫(kù)包含至少約104種不同的化合物。
110.權(quán)利要求106的方法,其中所述文庫(kù)包含至少約106種不同的化合物。
111.權(quán)利要求106的方法,其中所述文庫(kù)包含至少約108種不同的化合物。
112.權(quán)利要求106的方法,其中所述文庫(kù)包含至少約1010種不同的化合物。
113.權(quán)利要求106的方法,其中所述化合物文庫(kù)包含至少約1012種不同的化合物。
114.權(quán)利要求106的方法,其中所述化合物文庫(kù)包含多種獨(dú)立地為式I的化合物 其中X是包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的功能部分;Z是在其3’末端與B連接的寡核苷酸;Y是在其5’末端與C連接的寡核苷酸;A是與X形成共價(jià)鍵的官能團(tuán);B是與Z的3’-末端形成鍵的官能團(tuán);C是與Y的5’-末端形成鍵的官能團(tuán);D、F和E各自獨(dú)立地是雙功能連接基團(tuán);且S是原子或分子支架。
115.權(quán)利要求114的方法,其中對(duì)于每一種式I的化合物,A、B、C、D、E、F和S各自具有相同的身份。
116.權(quán)利要求114的方法,其中所述化合物文庫(kù)基本由多種式I的化合物組成。
117.權(quán)利要求114的方法,其中D、E和F各自獨(dú)立地是亞烷基鏈或低聚(乙二醇)鏈。
118.權(quán)利要求114的方法,其中Y和Z基本互補(bǔ),并且在化合物中定向,從而在適當(dāng)條件下能夠發(fā)生Watson-Crick堿基配對(duì)和雙鏈體形成。
119.權(quán)利要求114的方法,其中Y和Z具有相同的長(zhǎng)度或不同的長(zhǎng)度。
120.權(quán)利要求119的方法,其中Y和Z具有相同的長(zhǎng)度。
121.權(quán)利要求114的方法,其中Y和Z各自為10個(gè)或更多堿基的長(zhǎng)度,并且具有10個(gè)或更多堿基對(duì)的互補(bǔ)區(qū)。
122.權(quán)利要求114的方法,其中S是碳原子、硼原子、氮原子、磷原子或多原子支架。
123.權(quán)利要求114的方法,其中S是磷酸基或環(huán)基。
124.權(quán)利要求123的方法,其中S是環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、芳基或雜芳基。
125.權(quán)利要求114的方法,其中連接體部分具有結(jié)構(gòu) 其中n、m和p各自獨(dú)立地為1至約20的整數(shù)。
126.權(quán)利要求125的方法,其中n、m和p各自獨(dú)立地為2至8的整數(shù)。
127.權(quán)利要求126的方法,其中n、m和p各自獨(dú)立地為3至6的整數(shù)。
128.權(quán)利要求127的方法,其中連接體部分具有結(jié)構(gòu)
129.權(quán)利要求114的方法,其中X和Z包含PCR引物序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種合成包含編碼寡核苷酸標(biāo)簽的分子文庫(kù)的方法。
文檔編號(hào)C07B61/00GK1898257SQ200480037850
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月17日
發(fā)明者巴里·摩根, 斯蒂芬·黑爾, 克里斯托弗·C·阿里科·馬恩德?tīng)? 馬修·克拉克, 理查德·瓦格納, 戴維德·I·伊斯雷爾, 馬爾科爾姆·L·格夫特, 丹尼斯·本杰明, 尼爾斯·雅各布·維斯特·漢森, 馬爾科爾姆·J·卡瓦爾納, 斯蒂芬·菲利普·克里澤, 喬治·J·富蘭克林, 保羅·A·森特里爾拉, 雷克沙·A·阿查雅 申請(qǐng)人:普雷西斯藥品公司
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