專利名稱：用于檢測分析物的試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測分析物的試劑，涉及適合用于這種試劑的染料化合物，涉及利用這種試劑檢測或測量分析物的方法以及涉及分析物和這種試劑的絡合物。
背景技術：
檢測或測量分析物的方法基于FRET(熒光共振能量轉移)。
FRET是兩種染料物的電子激發(fā)態(tài)之間依賴于距離的相互作用，其中激發(fā)能量從供體轉移到受體而不發(fā)射光子。
FRET的效率反向地取決于分子間距的六次方。[參考1.B.Wieb Van der Meer，G.Coker III，S.-Y.Simon Chen，Resonance energy transfer；Theory and data，VCHpublishers，1994；2.Principles of Fluorescence Spectroscopy，Joseph R.Lakowicz(Ed.)，2.edition，Plenum Press，New York 1999]。因此FRET的檢測可用于確定用供體標記的物質和用受體標記的物質之間的距離。例如這可用于確定兩種物質是否相互結合。
FRET的要求是-供體和受體必須是緊密鄰近(通常為10-100)。
-受體的吸收光譜必須與供體的熒光發(fā)射光譜重疊。
-供體和受體躍遷偶極取向必須大致平行。
FRET引起供體熒光的強度和壽命的減少。如果受體是熒光性的，FRET還可引起受體熒光強度的增加。當供體和受體相同時，FRET引起熒光去偏振。
可以通過利用供體吸收光譜中的光照射樣品并測量全部的這些特征來測定FRET。
可以通過用供體標記分析物和用受體標記分析物接合劑(或反之亦然)來實施簡單的FRET分析。當分析物不結合分析物結合劑時，供體和受體之間的距離大，不發(fā)生FRET。
當分析物結合分析物結合劑時，供體和受體之間的距離小并且發(fā)生FRET。
因此，FRET的檢測可用于確定分析物是否存在和/或分析物的濃度。
當標記的分析物與非標記的分析物競爭時，可以實施競爭性FRET分析。在這種情況下，當非標記的分析物濃度增加時，將存在更少結合的標記分析物。這意味著將發(fā)生更少的FRET。
因此，FRET的檢測還可用于確定分析物的濃度。
這種分析可用于測量葡萄糖濃度。葡萄糖可逆性地結合一類所謂凝集素的蛋白質。伴刀豆球蛋白A是凝集素的一個實例。分析的成分例如標記的伴刀豆球蛋白A(分析物結合劑)和標記的葡萄糖或標記的葡萄糖類似物。葡聚糖是適當的葡萄糖類似物。當葡萄糖(分析物)結合伴刀豆球蛋白A時，它取代了標記的葡萄糖或葡聚糖，并且將發(fā)生更少的FRET。
作為替代方案，供體和受體可以連接到相同的物質上以形成單一FRET試劑。這種試劑的實例是“分子信標”。
分子信標由單鏈多核苷酸或多核苷酸類似物序列構成，該單鏈多核苷酸或多核苷酸類似物序列具有連接在該序列一端的供體?；パa性受體連接在序列的另一端。
未結合的分子信標作為莖環(huán)結構(stem-and-loop)存在。在分子信標末端的序列相配并結合，從而產生莖，同時探針的其余部分不相配和不結合，從而形成環(huán)。當以這種方式折疊時，探針一端的供體鄰接另一端的受體。供體和受體的鄰近允許發(fā)生FRET。
當探針識別并結合靶時，分子信標結構展開。這使受體與供體分離，從而不能發(fā)生FRET。
因此FRET可用于確定特定的靶是否存在。
分子信標可用于檢測互補性單鏈多核苷酸序列。作為替代方案，它們可用于檢測其它非核苷酸物質。這種分子信標被稱為適配體(aptamer)。例如，適配體可用于檢測蛋白質。
分子信標具有潛在的缺點，即它依賴于FRET發(fā)生，同時信標未結合。在體內試驗中，信標序列可以被體內酶切割。這將減少FRET。由于信標降解而引起的FRET減少不能與由信標結合靶而引起的FRET減少區(qū)分，由此所獲得的結果可能不可靠。
為了解決該問題，作為分子信標替代方案的是雙探針。其包含兩個單鏈多核苷酸或多核苷酸類似物序列，一個用能量供體標記，一個用互補性能量受體標記。雙探針用于檢測與雙探針兩部分的序列互補的單鏈多核苷酸靶序列。當雙探針的兩部分均與靶結合時，發(fā)生FRET。由于當雙探針不結合時不發(fā)生FRET，因此雙探針降解將不影響FRET的發(fā)生。因此，降解將不引起結果的不可靠。
類似于分子信標的試劑可以由多肽形成。
FRET還可用于免疫測定。
用于FRET中的供體和受體的選擇是重要的，并且需要考慮下列因素。
供體應該具有高量子產率。
適當的受體必須具有與供體發(fā)射光譜重疊的吸收光譜。例如，QSY 21TM是與Alexa Fluor 21TM一起使用的適當供體。理想的是受體具有寬吸收光譜，以便它可以與各種供體一起使用。
如果受體也是熒光物質，那么由直接的受體激發(fā)產生的背景熒光將可能產生并且同供體熒光一起被檢測。過濾受體發(fā)射可引起供體熒光信號的損失，其中過濾不是足夠的強烈。非熒光受體例如dabcyl和QSYTM可用于避免該問題。作為替代方案，可以通過選擇發(fā)射光譜遠離供體發(fā)射光譜的受體。
當供體或受體與分析物或分析物結合劑結合時，一些供體的發(fā)射光譜和一些受體的吸收光譜(例如QSY 21TM)偏移。這是不理想的。
當FRET分析用于體內時，理想的是供體在550-約600nm處發(fā)射熒光以及受體在約650nm處吸收光。這避免了供體熒光和體內自動熒光之間在較低波長處重疊。熒光素在495nm處發(fā)射熒光，因此用于體內是不理想的。
Alexa Fluor 594TM是用于體內的具有適當發(fā)射光譜的染料。這種染料在594nm處吸收并且在620nm處發(fā)射熒光。

發(fā)明內容
本發(fā)明人現已提供用于FRET中的新一類受體(HMCV染料)。該受體是穩(wěn)定化的碳正離子，其在結構上與結晶紫和孔雀綠相關。該受體可來源于在Bo W.Laursenet al.，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，12255-12263中所描述的trioxatriangulenium體系合成中的中間體。
因此，本發(fā)明在第一方面提供用于檢測分析物的試劑，包含熒光能量供體和能量受體，當該能量供體和能量受體相互充分接近時，能量從激發(fā)后能量供體非輻射地轉移到淬滅能量供體熒光的能量受體，其中能量受體具有下列通式 其中R1、R2和R3各自獨立地是H、給電子取代基或吸電子取代基，或者R3與連接體結構連接，前提是R1、R2和R3中至少兩個是給電子基；R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地是H、鹵素、烷基、芳基、O-烷基、S-烷基，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地是氫、O-烷基、S-烷基、烷基，或者基團R1和R4和/或R1和R5和/或R2和R6和/或R2和R7和/或R3和R8和/或R3和R9和/或R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的芳基、亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，前提是R10、R11、R12、R13、R14和R15不都是氫；以及其中所述試劑的能量供體和能量受體之間的距離能夠通過合適的待檢測分析物來調節(jié)。
當用于本文中時，術語“給電子取代基”包括但不限于氨基、伯胺、仲胺、烷基、O-烷基、S-烷基、酰胺(NHCOR)、酯(OCOR)、OH、SH和富電子芳基。
當用于本文中時，術語“吸電子取代基”包括但不限于NO、NO2、CN、COOH、酯(COOR)、COO-、酰胺(CONR2)、CHO、酮(COR)、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基和缺電子芳基。
富電子/缺電子芳基可分別定義為具有給電子或吸電子取代基的芳基。
當用于本文中時，術語“烷基”和“亞烷基”包括線型、支化和環(huán)狀基團、飽和和不飽和基團(包括含三鍵的基團)、含一個或多個取代基的基團和含一個或多個雜原子的基團。優(yōu)選C1-C6烷基。
當用于本文中時，術語“O-亞烷基”、“N-亞烷基”和“S-亞烷基”各自包括其中雜原子在基團內任意位置處的基團。優(yōu)選C1-C7O-亞烷基、N-亞烷基和S-亞烷基以及C2-C7亞烷基。
當提及酯取代基時，取代基可以經羰基部分(如R(C＝O)OR)或經烷氧基部分(如RO(C＝O)R)來連接。同樣，當提及酰胺取代基時，取代基可以經羰基部分(如RCONR2)或氮部分(如R(NR)COR)來連接。
在一個優(yōu)選實施方案中，能量供體和能量受體通過非共價結合連接在一起。非共價結合可存在于連接至能量供體和能量受體之一的分析物結合劑和連接至能量供體和能量受體中另一個的分析物類似物之間，可通過適當的分析物破壞非共價結合，以便增大所述試劑的能量供體和能量受體之間的距離。
適當地，在該實施方案中，分析物結合劑是凝集素和/或分析物類似物是葡萄糖類似物。例如，分析物類似物可以是葡聚糖。該體系可用于上文中所述的葡萄糖檢測和/或測量。
優(yōu)選凝集素結合能量供體以及分析物類似物結合能量受體(例如葡聚糖-HMCV和伴刀豆球蛋白A-Alexa Fluor 594TM)。葡聚糖可以比伴刀豆球蛋白A更濃密地標記。如果葡聚糖用熒光團標記，則存在過量的熒光，其沖淡了基于壽命的分析中的信號。
在作為替代方案的實施方案中，能量供體和能量受體通過共價鍵連接在一起。能量供體和能量受體之間的共價鍵可以分裂以增大試劑的能量供體和能量受體之間的距離。適當地，能量供體和能量受體經多核苷酸序列或多核苷酸類似物序列或多肽序列來連接，所述序列具有能夠通過合適的待檢測分析物調節(jié)的構象以便調節(jié)試劑能量供體和能量受體之間的距離。在這種情況下，試劑是如上文所述的“分子信標”。
在另一個可替代實施方案中，能量供體和能量受體在不存在分析物時不連接。這種試劑可以是上文所述的“雙探針”。
優(yōu)選的是，連接體結構在R3處連接至能量受體，或者任選地當橋連基存在時連接體結構在橋連基處連接至能量供體。
優(yōu)選的是，給電子取代基選自氨基、伯胺、仲胺、O-烷基、烷基、S-烷基、酰胺、酯、OH和SH。優(yōu)選的是，R1至R3中的一個或多個是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、和SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的二甲基氨基、二乙基氨基或甲基乙基氨基。
在優(yōu)選的實施方案中，R1和R2各自為二甲基氨基。作為替代方案，R1和R2可任選地各自為取代的甲基乙基氨基。
優(yōu)選的是，吸電子取代基存在，并且吸電子取代基選自NO、NO2、CN、COOH、酯、COO-、酰胺、CHO、酮、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基和SO3-烷基。
優(yōu)選的是，R10、R11、R12、R13、R14和R15中至少一個是O-烷基。
適當地，基團R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基。
優(yōu)選的是，R10-R15各自為O-甲基或O-乙基。
優(yōu)選的是，所述試劑進一步包含選自鹵化物、BF4-、PF6-、NO3-、羧酸酯、ClO4-、Li+、Na+、K+、Mg2+和Zn2+中的一種或多種相反離子，使得試劑整體上不帶電。
優(yōu)選的是，連接體結構存在，并且通過選自活性酯、異硫氰酸酯、酰氯、醛、疊氮化物、α-鹵代酮和胺的連接體單元與反應參與物的反應來形成。適當地，反應參與物選自多糖、多核苷酸或蛋白質。適當地，連接體單元是活性酯，并且選自琥珀酰亞胺基和五氟苯基活性酯。
適當地，能量供體是Alexa Fluor 594TM。
所述試劑可用于體內檢測分析物。例如，所述試劑可包含在植入體內的傳感器內。適當地，將傳感器植入表皮內，使得它將隨著時間流逝而從身體中流出。在WO02/30275中詳細地描述了適當的傳感器構造。在這種情況下，應該可以通過植入傳感器之上的皮膚層照射試劑和測量試劑熒光。
作為替代方案，所述試劑可包含在部分地植入體內但延伸到體外的傳感器內。這樣的傳感器可以采用針狀。在這種情況下，可以沿著針孔向下照射試劑并且可以以相同的方式檢測試劑熒光，而沒有光透過皮膚層。
所述傳感器應該對分析物而言是可滲透的。
在第二方面，本發(fā)明涉及包含包封上述用于檢測分析物的試劑的半透膜的傳感器。
在第三方面，本發(fā)明涉及具有下列通式的染料化合物 其中R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地是H、鹵素、烷基、芳基、O-烷基或S-烷基，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地是氫、O-烷基、S-烷基或烷基，或者基團R20和R4和/或R20和R5和/或R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的芳基、亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，前提是R10、R11、R12、R13、R14和R15不都是氫；R16、R17、R18和R19各自獨立地是H、烷基(優(yōu)選C1-C5烷基)或芳基，或者R16和R17或R18和R19中的一個或多個是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基(優(yōu)選C3-C7亞烷基)；或者基團R6和R16、R7和R17、R8和R18以及R9和R19中的一對或多對是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，以及R20是選自活性酯、異硫氰酸酯、酰氯、α-鹵代酮、疊氮化物和胺的連接體單元。
適當地，R10、R11、R12、R13、R14和R15中至少一種是烷基。
在優(yōu)選實施方案中，R16、R17、R18和R19各自為甲基或乙基。作為替代方案，R16和R18可以各自為甲基，R17和R19可以各自為用SO3-在2-位取代的乙基。
適當地，基團R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基。
優(yōu)選的是，R20是具有下列結構的連接體單元
其中R21是H或者任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2N-二烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的烷基或芳基，并且R22是亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基(優(yōu)選C2-C6烷基)，或者R21和R22是環(huán)(優(yōu)選C3-C7)的一部分，任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代；和R23是o-琥珀酰亞胺基、o-五氟苯基、Cl或α-鹵代烷基。
優(yōu)選的是，R10-R15各自為O-甲基或O-乙基。
優(yōu)選的是，染料化合物進一步包含選自鹵化物、BF4-、PF6-、NO3-、羧酸酯、ClO4-、Li+、Na+、K+、Mg2+和Zn2+中的一種或多種相反離子。
在第四方面，本發(fā)明涉及利用上述試劑檢測或測量分析物的方法，包括以下步驟使所述試劑與樣品接觸利用波長在能量供體吸收光譜范圍內的光照射試劑和樣品；通過測量能量供體的熒光來檢測能量供體和能量受體之間的非輻射能量轉移；和使熒光測量值與分析物的存在或濃度相關聯(lián)。
適當地，通過基于強度的或時間分辨熒光測量值來測量能量供體的熒光。優(yōu)選的是，通過將樣品熒光測量值與利用已知濃度分析物得到的熒光測量值相比來測量分析物。
用于照射的光優(yōu)選具有大于550nm的波長。
在第五方面，本發(fā)明涉及分析物和用于檢測分析物的試劑的絡合物，其中所述試劑包含熒光能量供體和能量受體，當該能量供體和能量受體相互充分接近時，能量從激發(fā)后能量供體非輻射地轉移到淬滅能量供體熒光的能量受體，其中能量受體具有下列通式 其中R1、R2和R3各自獨立地是H、給電子取代基或吸電子取代基，或者R3與連接體結構連接，前提是R1、R2和R3中至少兩個是給電子基；R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地是H、鹵素、烷基、芳基、O-烷基、S-烷基，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地是氫、O-烷基、S-烷基、烷基，或者基團R1和R4和/或R1和R5和/或R2和R6和/或R2和R7和/或R3和R8和/或R3和R9和/或R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、和SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的芳基、亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，前提是R10、R11、R12、R13、R14和R15不都是氫；和其中分析物的存在調節(jié)能量供體和能量受體之間的距離。


如圖所示，參照由實施例所闡述的優(yōu)選實施方案來進一步描述本發(fā)明，圖1表示葡萄糖劑量-響應曲線，圖2表示在PBS緩沖水溶液50mM、pH＝7.4中的AlexaFluor 594和HMCV-1-葡聚糖的歸一化吸收和發(fā)射光譜(在0.7μM溶液中AF594在570nm處激發(fā)(exitation))。
實施例染料化合物4的制備合成方法和材料除非另有說明，所有使用的試劑均是標準級。醚和THF通過在氮氣下從鈉/二苯酮中蒸餾來干燥。苯通過置于鈉的上方來干燥。NMR譜在250或400MHz光譜儀上獲得。FABMS譜利用1，4-二氰基丁烷作為基質而獲得。
元素分析在丹麥哥本哈根2100大學區(qū)(Universitetsparken)5號哥本哈根大學化學系元素分析實驗室進行。
三(2，4，6-三甲氧苯基)碳正離子四氟硼酸鹽(1-BF4)。通過將干醚(50mL)中的溴苯(24.5g，156mmol)加入到干醚(100mL)中的鋰金屬線(2.30g，328mmol)中來制備苯基鋰溶液。加入干苯(100mL)中的1，3，5-三甲氧基-苯(25.1g，149mmol)，在氬氣和室溫下攪拌反應混合物70小時。加入干苯(150mL)中的碳酸二乙酯(5.30g，45mmol)，將反應混合物回流3天。將冷卻后的反應混合物倒入NaOH溶液(300mL，1M)中。相分離，并且用醚萃取水相?；旌系挠袡C相在MgSO4上干燥并且過濾，產生透明黃色溶液。加入HBF4水溶液(12mL，50％約100mmol)引起了深藍色碳正離子鹽的立即沉淀。濾出暗紫色沉淀，用干醚徹底洗滌，并在固體KOH上干燥以產生26.0g(96％)的粗產物。通過將水加入到乙腈溶液中再沉淀、接著從甲醇中重結晶，從而產生70％總產率的純化合物。
1H NMR(250MHz，CDCl3)；δ6.05(6H，s)，3.99(9H，s)，3.59(18H，s).13C NMR(400MHz，CDCl3)δ169.70，166.47，163.93，118.62，91.53，56.52，56.36.MS(FAB+)m/z513(M+).UV-vis λmax(nm(log∈))(CH2Cl2)584(4.55)，467(3.98)，322(3.68)，287(4.02).C28H33O9BF4分析計算值C，56.01；H，5.50.實測值C，55.69；H，5.64.
三(2，4，6-三甲氧苯基)碳正離子氯化物(1-Cl)。類似于1-BF4制備該化合物(用15.0g的1，3，5-三甲氧基苯為起始原料)。使氣體HCl而不是HBF4通過水解和干燥的反應混合物起泡。濾出暗紫色晶體沉淀，用干醚徹底洗滌，并在固體KOH上干燥以產生10.1g(66％)的粗產物。MS(FAB+)、1H NMR和13C NMR譜與BF4鹽的相同。
HMCV-1的合成 方案1I)4-(N-甲基氨基)-丁酸氫氯化物(1當量)，二異丙基乙胺，乙腈中，20℃，20小時。II)二甲胺(過量)。III)TSTU，二異丙基乙胺，乙腈中，20℃，2小時。
4a(BF4-)將4-(N-甲基氨基)-丁酸氫氯化物(1.36g；8.8mmol)、1(5.0g；8.3mmol)和二異丙基乙胺(5mL)溶于乙腈(120mL)中。在30-35℃下在干燥的氮氣氣氛中攪拌反應混合物22小時。加入二甲胺水溶液(40mL的40％溶液)并將反應混合物再攪拌四天。在真空中將溶劑和過量的二甲胺去除并將殘留的物質溶于氯仿中。氯仿溶液用鹽水洗滌兩次并在MgSO4上干燥，之后蒸發(fā)溶劑并從CH2Cl2/醚中再沉淀產物。產率4.4g(70％)的暗藍色粉末。
MS(FAB+)m/z 624(M+)1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.34(1H，bs)，6.03(2H，s)，5.83(4H，s)，3.49(2H，m)，3.46(6H，s)，3.44(12H，s)，3.12(3H，s(掩蔽))，3.08(12H，s)，1.94(2H，t)，1.70(2H，m).
HMCV-1(Cl-)將TSTU(2-琥珀酰亞胺-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽；0.8g，2.6mmol)加入到4a(0.9g，1.26mmol)和二異丙基乙胺(0.55g，4.5mmol)的乙腈(15mL)溶液中。在密閉的燒瓶中攪拌反應混合物2小時，之后將其倒入用HCl水溶液(4mL，2M)酸化的幾乎飽和的冰冷NaCl溶液(約150mL)中。水相用氯仿萃取(2×150mL)?；旌系穆确孪嘤名}水洗滌(2×50mL)并在MgSO4上干燥。蒸發(fā)溶劑并從CH2Cl2/醚中再沉淀產物，從而產生暗藍色粉末(0.80g，84％)。
Ms(FAB+)m/z 721(M+)1H-NMR1H-NMR br.(400MHz，DMSO-d6)δ5.88(2H，s)，5.85(4H，s)，3.60(2H，s)，3.46(12H，s)，3.45(6H，s)，3.15(12H，s)，3.12(3H，s)，2.85(4H，s)，2.80(2H，t)，1.95(2H，m).
HMCV-2的合成 方案2I)哌啶-4-羧酸(1當量)，二異丙基乙胺，NMP中，80℃。II)二甲胺(過量)，20℃。III)TSTU，二異丙基乙胺，乙腈中，20℃，2小時。
4b(PF6-)將NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮，20mL)中哌啶-4-羧酸(異哌啶酸)(0.215g；1.7mmol)和二異丙基乙胺(1mL)的懸浮液加入到1(1.0g，1.7mmol)的30mL NMP溶液中。在80-100℃的溫熱油浴中加熱反應混合物2小時(直到反應混合物為鮮紅色)并在室溫下靜置過夜。加入二甲胺(10mL的33％無水乙醇溶液)并在室溫下攪拌反應混合物24小時。將反應混合物倒入KPF6水溶液(400mL，0.2M)中并小部分地加入HCl水溶液(2M)直到沉淀。濾出藍色沉淀并用純水洗滌，然后干燥、溶于DCM中，接著過濾并加入醚再沉淀。產率0.85g的暗藍色粉末(64％)。
MS(FAB+)m/z 636(M+)1H-NMR(CD3CN，內標基準溶劑1.94ppm)δ6.03(2H，s)，5.81(4H，s)，3.90(2H，m)，3.48(12H，s)，3.47(6H，s)，3.14(12H，s)，3.04(2H，m)，2.61(1H，m)，2.15(1H，br)，1.97(2H，m)，1.71(2H，m).
HMCV-2(PF6-)將TSTU(2-琥珀酰亞胺-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽；0.72g，2.4mmol)加入到乙腈(15mL)中的4b(0.8g，1mmol)和二異丙基乙胺(0.47g)溶液中。在密閉的燒瓶中攪拌混合物2小時，之后將其倒入用HCl水溶液(4mL，2M，約4mmol)酸化的冷NaCl溶液(約100mL)中。水相用氯仿萃取(2×100mL)?；旌系穆确孪嘤名}水洗滌(2×50mL)并在MgSO4上干燥。將助濾劑(10g)加入到經過濾的氯仿相中并去除溶劑。在蒸發(fā)溶劑(收集第一藍色級分)并從CH2Cl2/醚中再沉淀之后，通過柱色譜法(二氧化硅，CHCl3/MeCN 5∶1)分析得到暗藍色粉末(0.55g，62％)。
MS(FAB+)m/z 732(M+)1H-NMR(DMSO，內標基準溶劑2.50ppm)δ6.08(2H，s)，5.84(4H，s)，4.93(2H，m)，3.45(12H，s)，3.44(6H，s)，3.14(12H，s)，3.14(2H，m(掩蔽))，2.82(4H)，2.03(2H，m)，1.74(2H，m).(CDCl3，內標基準溶劑7.76ppm)δ5.94(2H，s)，5.70(4H，S)，3.80(2H，m)，3.53(12H，s)，3.18(6H)，3.16(2H，m(掩蔽))，2.97(1H，m)，2.85(4H，s)，2.19(2H，m)，2.04(2H，m).
HMCV-3的合成HMCV-3前體4c的合成通過兩條合成路線來完成。A通過類似于在合成HMCV-1和HMCV-2中所用方法的“一鍋(One-Pot)”法，其中首先引入攜帶氨基的連接體(4-(N-甲基氨基)-丁酸)，接著引入兩種磺酸取代的氨基官能團(N-甲基-?；撬?(方案3)。在方法B中，次序相反并且分兩步實施，同時分離雙取代產物3C(方案4)。
方案3(方法A)I)4-(N-甲基氨基)-丁酸氫氯化物(1當量)，二異丙基乙胺，DMSO中，20℃，24小時。II)N-甲基?；撬徕c(過量)，70℃，48小時。
方案4(方法B)I)N-甲基?；撬徕c(過量)，20℃，3天。II)4-(N-甲基氨基)-丁酸氫氯化物(過量)，Na2CO3，DMSO中，70℃，3天。
4c(Na+)(方法A)在室溫下攪拌DMSO(25mL)中4-(甲基氨基)-丁酸氫氯化物(0.275g；1.8mmol)、1(1.0g；1.7mmol)和二異丙基乙胺(1mL)的溶液20小時，之后加入N-甲基?；撬徕c(2.0g；12mmol)、二異丙基乙胺(1mL)和DMSO(20mL)。然后在約70℃下攪拌反應混合物兩天并在室溫下攪拌兩天。通過二氧化硅過濾反應混合物，接著用甲醇徹底洗滌。濃縮藍色濾液并且通過加入乙酸乙酯使得粗產物沉淀為粘性的藍色蠟狀物。柱色譜法(二氧化硅，MeCN/MeOH 5∶2)產生藍色固體(第一藍色級分/帶)，通過在熱乙醇中溶解并隨后過濾(熱)來進一步純化該固體。冷卻之后再過濾乙醇溶液并且用乙醇洗滌沉淀(留下白色物質)。蒸發(fā)藍色乙醇溶液，產生0.3g的4c(18％)。
MS(FAB+，甘油)m/z 812(MH2+)，834(MNaH+)，856(MNa2+)1H-NMR(CD3OD，內標基準溶劑3.35ppm)δ5.98(6H，s)，3.95(4H，t)，3.62(2H，t)，3.57(6H，s)，3.56(12H，s)，3.21(3H，s)，3.20(6H，s)，3.15(4H，t)，2.41(2H，t)，1.99(2H，m).
由方法B制備4c3c(Na+)在室溫下攪拌DMSO(25mL)中N-甲基?；撬徕c(1.3g；8mmol)和1(1.0g；1.7mmol)的溶液3天。加入乙酸乙酯(約500mL)產生藍色沉淀(和紅色母液)。在無水乙醇(約150mL)中回流加熱固體物質并在室溫下靜置過夜。濾出沉淀，溶于甲醇中并通過二氧化硅過濾(5cm層)，再用甲醇洗滌。蒸發(fā)溶劑并從甲醇/乙酸乙酯中再沉淀，產生藍色粉末(1.1g，88％)。
Ms(FAB+，甘油)m/z 727(MH2+)，749(MNaH+)，765(MNaK+)，771(MNa2+)1H-NMR(CD3OD，內標基準溶劑3.35ppm)δ6.20(2H，s)，5.98(4H，s)，4.00(4H，t)，3.87(3H，s)，3.58(12H，s)，3.56(6H，s)，3.28(6H，s)，3.17(2H，t).
4c(Na+)在70℃下攪拌DMSO(7mL)中3c(0.5g；0.67mmol)、4-(N-甲基氨基)-丁酸氫氯化物(0.5g；3.26mmol)和干燥NaCO3(0.5g)的溶液3天。通過加入乙酸乙酯從冷卻的反應混合物中沉淀出粗產物，獲得粘性藍色物質(約1.1g)。蒸發(fā)溶劑后柱色譜法(硅石，MeCN/MeOH 5∶2)產生藍色固體產物4c(0.25g，44％)。
MS(FAB+，甘油)m/z 812(MH2+)1H-NMR(CD3OD，內標基準溶劑3.35ppm)δ5.98(6H，s)，3.95(4H，t)，3.62(2H，t)，3.57(6H，s)，3.56(12H，s)，3.21(3H，s)，3.20(6H，s)，3.15(4H，t)，2.41(2H，t)，1.99(2H，m).
方案5III)TSTU，二異丙基乙胺，DMSO。
HMCV-3(Na+)將TSTU(2-琥珀酰亞胺-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽；0.20g，0.6mmol)加入到干燥DMSO(10mL)中的4c(0.25g，0.3mmol)和二異丙基乙胺(0.06g)的溶液中。在密閉的燒瓶中攪拌反應混合物2小時，之后通過加入乙酸乙酯沉淀出粗產物。用甲醇從過濾器洗滌粘性藍色物質并在高真空下干燥。在蒸發(fā)溶劑(室溫下高真空)并從甲醇/乙酸乙酯中再沉淀之后，通過柱色譜法(二氧化硅，H2O/MeCN 1∶10)分析產生暗藍色粉末(0.25g，90％)。
MS(FAB+，甘油)m/z 909(MH2+)，931(MNaH+)，947(MKH+)，1H-NMR(CD3OD，內標基準溶劑3.35ppm)δ5.99(4H，s)，5.94(2H，s)，3.95(4H，t)，3.68(2H，t)，3.57(12H，s)，3.58(2H，掩蔽)，3.55(6H，s)，3.21(9H，s)，3.16(4H，t)，2.88(4H，s)，2.80(2H，s)，2.13(2H，m).
HMCV-1對氨基葡聚糖的附著將氨基葡聚糖(130mg，Mw 110.000，0.5mmol NH2/g葡聚糖)溶于6.5mL的碳酸鈉水溶液(15mM，PH＝8.5)中，以產生具有182μM、20mg/mL葡聚糖濃度的溶液。用10分鐘的時間在攪拌下以每份10μL將HMCV-1(5.65mg，于200μL DMSO中)加入到3.0mL的這種溶液中。在室溫下攪拌該溶液1小時并廣泛地透析(3mL透析片，12-14.000MwCO膜)磷酸鹽緩沖水溶液(10mM H2PO4-/HPO42-，4mM K+，145mM Na+，0.1mM Ca2+，0.1mM Mn2+，pH＝7.4)。由透析期間的稀釋來測定標記的葡聚糖的濃度。由一系列所產生溶液的UV-Vis光譜來測定標記程度(DOL值)(3.2mL，葡聚糖濃度168μM，DOL＝10)。
Alexa Fluor 594TM對伴刀豆球蛋白A(Con A)的附著如下制備Con A(III型，Sigma)溶液。將甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(0.97g)、30μL CaCl2水溶液(0.1M)和30μL MnCl2水溶液(0.1M)混合在20mL 0.5M的Na2CO3緩沖液(pH＝8.5)中。然后加入Con A(1.00g～150mg蛋白質)并且激烈攪拌該懸浮液1h。將該溶液離心并收集上層清液。用10分鐘的時間以每份20μL將Alexa Fluor 594TM(10.0mg，于800mL干燥DMSO中)加入到13.0mL的這種溶液中。攪拌所產生的藍色溶液1小時然后用10分鐘的時間以每份20μL加入琥珀酸酐(18.2mg，于867μL干燥DMSO中)。再攪拌該溶液1.5小時，之后將其轉移到15mL的透析片并透析如HMCV-1-葡聚糖合成所描述的相同緩沖液。將2mM NaN3加入到該緩沖液中以防止生長。(15.4mL，蛋白質二聚物濃度59μM，DOL＝4.0)。
用染料化合物4標記的分析物結合試劑在FRET分析中的用途葡萄糖測量分析化學的優(yōu)選實施方案基于如上所述葡聚糖和葡萄糖之間對伴刀豆球蛋白A(ConA)結合的競爭。
Con A用Alexa Fluor 594TM(AF594)(供體)標記，并且用非熒光染料-HMCV-1(受體)標記葡聚糖，其在AF594發(fā)射帶內吸收。
通過頻域熒光測定法來測量熒光壽命。通過使受激供體發(fā)射用相同頻率調節(jié)并通過激發(fā)態(tài)壽命延遲的光來調節(jié)激發(fā)光強度。這導致激發(fā)光和發(fā)射的熒光之間的相位移。
我們選擇AF594標記的(Con A)作為糖結合凝集素以及HMCV-1標記的葡聚糖作為葡萄糖類似物。在整個實驗期間使用的供體和受體顏料-[AF594]和[HMCV-1]的體積濃度是恒定的并且它們的比為1∶6。這與供體濃度遠小于受體濃度的Frster理論條件是一致的[參考O.J.Rolinski，D.J.S.Birch，L.J.McCartney，J.C.Pickup，J Photochem.Photobiol.BBiol.54，26-34，2000]。我們發(fā)現當用供體標記Con A并且用受體標記多糖葡聚糖時最好地符合Frster理論。
測量混合供體偶聯(lián)物、受體偶聯(lián)物和PBS緩沖液(50mM PBS緩沖液，pH＝7.4，用NaCl將離子強度調整為150mM)使得分析化學中Con A的最終濃度為20μM且葡聚糖濃度為50μM。([Con A]/[Dex])的摩爾比為0.40，([AF594]/[HMCV-1])的濃度比為0.16。使兩種中空纖維素纖維(Spectrum Laboratories，Inc.，再生纖維素，纖維外徑216μm，纖維內徑200μm，MWCO 13 kDa Reorder No.132294)具備分析化學性質，然后將其安裝在置于含熒光單元的PBS緩沖液中的定制固定器中。
利用相和調制熒光儀(來自ISS，Inc.，Champaign，Illinois的Koala)來測量相激發(fā)位移。光源是黃色LED。將發(fā)射540-590nm的光的XF1067帶通濾波器(GlennSpectra Ltd)置于激發(fā)通道以及基準通道中。發(fā)射通道裝有發(fā)射610-690nm的光的XF3061帶通濾波器(Glenn Spectra Ltd)。
通過用含有葡萄糖濃度從0mM增加到50mM的葡萄糖的PBS緩沖液連續(xù)置換PBS緩沖液來測量葡萄糖劑量-響應。
結果如表1和圖1中所示。

表1上述分析體系是在豬夾鉗實驗(clamped pig experiment)中體內進行測試的。該分析在通過針而置于皮膚的皮下組織(subcutus)中的空纖維中進行，與體外實驗相比，相測量結果表現出輕微的相位移，但是該相位移可能與整個血液葡萄糖的基準值非常相關。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案的受體具有相對于已知受體而言的許多優(yōu)點。
第一，HMCV受體具有寬且強的吸收光譜(550-700nm)。這意味著它們可以與多種供體一起使用(參見圖2)。
第二，受體在高波長處吸收。這意味著它們適合在自身熒光不干擾測量的波長處體內使用。
第三，染料的中心碳原子由在芳族部分上的鄰位取代基掩蔽，抑制由還原、氧化或親核攻擊在該位置引發(fā)的降解過程。
第四，受體的吸收光譜不會由于與分析物或分析物結合劑的偶聯(lián)而受到明顯影響。這意味著可以預測受體的性能。
第五，受體不發(fā)熒光并且不會對背景熒光信號做出貢獻。
權利要求書(按照條約第19條的修改)其中R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地是H、鹵素、烷基、芳基、O-烷基或S-烷基，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地是氫、O-烷基、S-烷基或烷基，或者基團R20和R4和/或R20和R5和/或R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的芳基、亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，前提是R10、R11、R12、R13、R14和R15不都是氫；R16、R17、R18和R19各自獨立地是H、烷基或芳基，或者R16和R17或R18和R19中的一個或多個是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基；或者基團R6和R16、R7和R17、R8和R18以及R9和R19中的一對或多對是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基；以及R20是選自活性酯、異硫氰酸酯、酰氯、α-鹵代酮和疊氮化物的連接體單元。
24.如權利要求23中所要求的染料化合物，其中R10、R11、R12、R13、R14和R15中至少一個是烷基。
25.如權利要求24中所要求的染料化合物，其中基團R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基。
26.如權利要求23-25中任一項所要求的染料化合物，其中R20是具有下列結構的連
權利要求
1.一種用于檢測分析物的試劑，包含熒光能量供體和能量受體，當能量供體和能量受體相互充分接近時，能量從激發(fā)后能量供體非輻射地轉移到淬滅能量供體熒光的能量受體，其中能量受體具有下列通式 其中R1、R2和R3各自獨立地是H、給電子取代基或吸電子取代基，或者R3與連接體結構連接，前提是R1、R2和R3中至少兩個是給電子基；R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地是H、鹵素、烷基、芳基、O-烷基、S-烷基，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地是氫、O-烷基、S-烷基、烷基，或者基團R1和R4和/或R1和R5和/或R2和R6和/或R2和R7和/或R3和R8和/或R3和R9和/或R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的芳基、亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，前提是R10、R11、R12、R13、R14和R15不都是氫；并且其中所述試劑的能量供體和能量受體之間的距離能夠通過合適的待檢測分析物來調節(jié)。
2.如權利要求1中所要求的試劑，其中能量供體和能量受體通過共價鍵連接在一起。
3.如權利要求2中所要求的試劑，其中能量供體和能量受體之間的共價健可以分裂以增大所述試劑的能量供體和能量受體之間的距離。
4.如權利要求2中所要求的試劑，其中能量供體和能量受體經多核苷酸序列或多核苷酸類似物序列或多肽序列來連接，所述序列具有能夠通過合適的待檢測分析物調節(jié)的構象以便調節(jié)所述試劑的能量供體和能量受體之間的距離。
5.如權利要求1中所要求的試劑，其中能量供體和能量受體通過非共價結合連接在一起。
6.如權利要求5中所要求的試劑，其中非共價結合存在于連接至能量供體和能量受體之一的分析物結合劑與連接至能量供體和能量受體中另一個的分析物類似物之間，所述非共價結合可通過適當的分析物破壞，以便增大所述試劑的能量供體和能量受體之間的距離。
7.如權利要求6中所要求的試劑，其中分析物結合劑是凝集素。
8.如權利要求6或權利要求7中所要求的試劑，其中分析物類似物是葡萄糖類似物。
9.如權利要求8中所要求的試劑，其中分析物類似物是葡聚糖。
10.如權利要求1中所要求的試劑，其中能量供體和能量受體在不存在分析物時不連接。
11.如前述權利要求中任一項所要求的試劑，其中連接體結構在R3處連接至能量受體，或者任選地當橋連基存在時連接體結構在橋連基處連接至能量供體。
12.如前述權利要求中任一項所要求的試劑，其中給電子取代基選自氨基、伯胺、仲胺、O-烷基、烷基、S-烷基、酰胺、酯、OH和SH。
13.如權利要求12中所要求的試劑，其中R1至R3中的一個或多個是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的二甲基氨基、二乙基氨基或甲基乙基氨基。
14.如前述權利要求中任一項所要求的試劑，其中吸電子取代基存在，并且吸電子取代基選自NO、NO2、CN、COOH、酯、COO-、酰胺、CHO、酮、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基和SO3-烷基。
15.如前述權利要求中任一項所要求的試劑，其中R10、R11、R12、R13、R14和R15中至少一個是O-烷基。
16.如前述權利要求中任一項所要求的試劑，其中基團R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基。
17.如權利要求1-14中任一項所要求的試劑，其中R10至R15各自為O-甲基或O-乙基。
18.如前述權利要求中任一項所要求的試劑，進一步包含選自鹵化物、BF4-、PF6-、NO3-、羧酸酯、ClO4-、Li+、Na+、K+、Mg2+和Zn2+中的一種或多種相反離子。
19.如前述權利要求中任一項所要求的試劑，其中連接體結構存在，并且通過選自活性酯、異硫氰酸酯、酰氯、醛、疊氮化物、α-鹵代酮和胺的連接體單元與反應參與物的反應來形成。
20.如權利要求19中所要求的試劑，其中反應參與物選自多糖、多核苷酸和蛋白質。
21.如權利要求19或權利要求20中所要求的試劑，其中連接體單元是活性酯，并且選自琥珀酰亞胺基和五氟苯基活性酯。
22.如前述權利要求中任一項所要求的試劑，其中能量供體是Alexa Fluor 594TM。
23.具有下列通式的染料化合物 其中R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地是H、鹵素、烷基、芳基、O-烷基或S-烷基，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地是氫、O-烷基、S-烷基或烷基，或者基團R20和R4和/或R20和R5和/或R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的芳基、亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，前提是R10、R11、R12、R13、R14和R15不都是氫；R16、R17、R18和R19各自獨立地是H、烷基或芳基，或者R16和R17或R18和R19中的一個或多個是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基；或者基團R6和R16、R7和R17、R8和R18以及R9和R19中的一對或多對是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基；以及R20是選自活性酯、異硫氰酸酯、酰氯、α-鹵代酮、疊氮化物和胺的連接體單元。
24.如權利要求23中所要求的染料化合物，其中R10、R11、R12、R13、R14和R15中至少一個是烷基。
25.如權利要求24中所要求的染料化合物，其中基團R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基。
26.如權利要求23-25中任一項所要求的染料化合物，其中R20是具有下列結構的連接體單元 R21是H或者任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2N-二烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的烷基或芳基，并且R22是亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，或者R21和R22是任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的環(huán)的一部分；以及R23是o-琥珀酰亞胺基、o-五氟苯基、Cl或α-鹵代烷基。
27.如權利要求23-26中任一項所要求的染料化合物，其中R10至R15各自為O-甲基或O-乙基。
28.如權利要求23-27中任一項所要求的染料化合物，進一步包含選自鹵化物、BF4-、PF6-、NO3-、羧酸酯、ClO4-、Li+、Na+、K+、Mg2+和Zn2+中的一種或多種相反離子。
29.利用如權利要求1-22中任一項所要求的試劑檢測或測量分析物的方法，包括以下步驟使所述試劑與樣品接觸利用波長在能量供體吸收光譜范圍內的光照射試劑和樣品；通過測量能量供體的熒光來檢測能量供體和能量受體之間的非輻射能量轉移；和使熒光測量值與分析物的存在或濃度相關聯(lián)。
30.如權利要求29中所要求的方法，其中通過基于測量強度的或時間分辨熒光測量值來測量能量供體的熒光。
31.如權利要求29或30中所要求的方法，其中通過將樣品熒光測量值與利用已知濃度分析物得到的熒光測量值相比來測量分析物。
32.分析物和用于檢測分析物的試劑的絡合物，其中所述試劑包含熒光能量供體和能量受體，當能量供體和能量受體相互充分接近時，能量從激發(fā)后能量供體非輻射地轉移到淬滅能量供體熒光的能量受體，其中能量受體具有下列通式 其中R1、R2和R3各自獨立地是H、給電子取代基或吸電子取代基，或者R3與連接體結構連接，前提是R1、R2和R3中至少兩個是給電子基；R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地是H、鹵素、烷基、芳基、O-烷基、S-烷基，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自獨立地是氫、O-烷基、S-烷基、烷基，或者基團R1和R4和/或R1和R5和/或R2和R6和/或R2和R7和/或R3和R8和/或R3和R9和/或R4和R10和/或R5和R11和/或R6和R12和/或R7和R13和/或R8和R14和/或R9和R15中的一對或多對是由下列基團組成的橋連基任選地用SO3-、PO32-、OH、O-烷基、SH、S-烷基、COOH、COO-、酯、酰胺、鹵素、SO-烷基、SO2-烷基、SO2NH2、SO2NH-烷基、SO2N-二烷基、和SO3-烷基、CN、仲胺或叔胺中的一個或多個取代的芳基、亞烷基、O-亞烷基、S-亞烷基或N-亞烷基，前提是R10、R11、R12、R13、R14和R15不都是氫；和其中分析物的存在調節(jié)能量供體和能量受體之間的距離。
全文摘要
用于檢測分析物的試劑包含熒光能量供體和能量受體，其中能量受體具有通式(I)并且其中該試劑的能量供體和能量受體之間的距離能夠通過合適的待檢測分析物來調節(jié)。
文檔編號C07D207/40GK1902283SQ200480037638
公開日2007年1月24日 申請日期2004年12月14日 優(yōu)先權日2003年12月16日
發(fā)明者延斯·克里斯蒂安·諾里爾德, 波·韋格·勞爾森 申請人:帕瑞薩森思公司